調節(jié)miR200c、ZEB1及TGF-β1表達增強B16F10GPI-IL-21瘤苗抗黑色素瘤效應的研究

調節(jié)miR200c、ZEB1及TGF-β1表達增強B16F10/GPI-IL-21瘤苗抗黑色素瘤效應的研究黑色素瘤是一種高度惡性腫瘤,占皮膚腫瘤死亡病例的極大部分,患者早期癥狀隱匿,一旦發(fā)現多數已發(fā)生轉移,無法手術切除,故死亡率極高。隨著腫瘤免疫學的進展,人們對腫瘤抗原、腫瘤免疫逃逸機制和腫瘤微環(huán)境的認識的深入,免疫治療逐漸成為腫瘤治療和研發(fā)領域的關注點：即通過激發(fā)或調動機體的免疫系統(tǒng),增強腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫力,從而控制和殺傷腫瘤細胞[2,3]。特別是近期抗PD-1和抗CTLA-4的單克隆抗體的應用,在免疫治療黑色素瘤的療效方面有了突破性進展[4-6]。細胞因子療法也是腫瘤免疫治療的一個重要途徑,即通過某種方式使需要的細胞因子水平增加,充分發(fā)揮某細胞因子抗腫瘤的生物學作用。大量的臨床數據表明,雖然免疫治療的應用,使黑色素瘤的療效明顯提高,但仍有部分患者最后出現惡性復發(fā)[7-9]。治療失敗的原因之一是由于黑色素瘤細胞分泌大量的轉化生長因子β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β),抑制了機體免疫功能,并促使癌細胞的轉移。IL-21是2000年發(fā)現的屬IL-2細胞因子家族的新成員,由活化的CD4+T輔助細胞產生,其受體表達在多種免疫細胞(B、T、NK細胞)上,因此對多種免疫細胞有重要的生物調節(jié)作用。IL-21能提高B淋巴細胞的增殖,提高IgG1的產生,從而調節(jié)人體體液免疫。IL-21還可增強NK細胞、T淋巴細胞的增殖與殺傷功能,從而增強人體的細胞免疫(圖1,圖2)。在腫瘤的免疫治療方面,無論是重組IL-21,還是表達IL-21的腫瘤疫苗,無論是單.藥治療還是聯合應用,IL-21都表現出了較強的抗腫瘤作用[12-14]。本實驗組自2001年開始從事IL-2的研究，并在國內首次擴增出小鼠的IL-21編碼基因，序列已于2003年遞交GeneBank(登錄號：AY428262)。我們在前期研究中發(fā)現，IL-21在小鼠黑色素瘤等多種腫瘤中可誘導較強的抗腫瘤作用,黑色素瘤苗B16F10/GPI-IL-21可增強免疫小鼠NK細胞和CTL的細胞毒功能,抑制Treg細胞及其對CD8+T細胞的抑制作用,同時增加T細胞分泌IFN-Y的能力；增加的IFN-γ具有直接抗腫瘤活性,并可減少TGF-β的表達,進而抑制TGF-β誘導的Smad3的磷酸化,即Smad3和Smad4結合、Smad3的核內積聚以及TGF-β應答元件的活化,從而明顯降低腫瘤細胞的侵襲性。然而,GPI-IL-21畢竟不能直接作用于TGF-3/Smad信號通路,因此不能完全阻斷黑色素瘤的轉移。微小RNA(microRNA)是由基因組編碼的小分子RNA,長度為22nt左右,由核內和胞內酶分別從折疊的發(fā)夾狀轉錄前體約為68個堿基RNA上切割形成,其功能發(fā)揮依賴于niRNA通過堿基配對結合到靶基因mRNA的3’UTR,通過抑制核糖體功能、降解靶基因mRNA等進而調控mRNA的轉錄與翻譯功能。上皮-間質轉化(epithelialmesenchymaltransition,EMT)是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞轉化的現象,上皮來源的腫瘤可借助EMT發(fā)生遠處轉移。黑色素瘤雖然不是上皮來源的,但瘤細胞具有上皮樣的特征,如易發(fā)生EMT而轉移。鋅指增強子結合蛋白1(zinc-fingerE-boxbindinghomeobox1,ZEB1)是上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)轉錄抑制因子,具有典型的鋅指結構,可以和靶基因E-Cadherin啟動子區(qū)的E-box結合,抑制E-Cadherin的轉錄表達,導致細胞間粘附性降低、移動性和轉移性增強。已有研究顯示,一方面miR200c能夠抑制ZEB1和ZEB2表達,另一方而,ZEB1和ZEB2亦能在轉錄水平抑制miR200c的表達,專司上皮特性的miR200c和專司間質特性的ZEB家族構成了一個雙向反饋調節(jié)回路,在調控結腸癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。此外,過表達miR200c可以阻斷TGF-β誘導的EMT。因此,這一領域研究成為腫瘤靶向治療關注點。以往研究顯示,細胞因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-21等作為腫瘤瘤苗的免疫增強劑,僅限于其對免疫細胞的活化反應,但針對腫瘤細胞及其相關的信號通路的研究有限；調節(jié)腫瘤細胞本身的信號通路,從而影響其生物學特性,這對腫瘤疫苗誘導的免疫反應所發(fā)揮的免疫治療作用有重要影響。由此我們設想,如果能直接下調黑色素瘤細胞中TGF-β1的表達,并通過不同途徑調節(jié)miR200和ZEB1的表達,可能會與黑色素瘤苗B16F10/GPI-IL-21產生協(xié)同和增強作用。該策略應用,一方而能提高機體免疫系統(tǒng)針對腫瘤細胞的免疫攻擊效應,另一方面能降低或阻止黑色素瘤的侵襲和轉移,從而發(fā)揮更好的抗腫瘤效果。為此,本論文進行了如下系列實驗研究。一.目的：通過調節(jié)miR200c、ZEB1及TGF-p1靶分子表達,加強黑色素瘤B16F10/GPI-IL-21瘤苗的抗腫瘤效應,為腫瘤疫苗免疫治療黑色素瘤研究提供實驗依據和新的思路。二.方法：1.B16F10/GPI-IL-21瘤苗聯合miR200c和shZEB1的抗腫瘤效應及其相關機制研究1)將實驗室前期構建的質粒pSUPER-EGFP1-shZEB1(shZEB1)和pcDNA3.1/GPI-IL-21,脂質體轉染小鼠B16F10細胞,G418篩選穩(wěn)定轉染的陽性克隆,分別命名為B16F10/shZEB1和B16F10/GPI-IL-21,并通過QRT-PCR和Western-blot鑒定靶分子表達；將過表達miR200c的核心質粒與包裝質粒psPAX2和包膜質粒pMD2.G,通過脂質體共轉染人胚腎HEK-293T細胞,回收上清,通過超高速離心法收集病毒并感染B16F10細胞,最后用極限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達miR200c的細胞株,命名為B16F10/miR200c,通過RT-PCR檢測穩(wěn)定感染細胞中miR200c和ZEB1的表達；以野生型B16F10細胞為對照,通過Western-blot檢測B16F10/shZEB1、B16F10/GPI-IL-21和B16F10/miR200c中ZEB1、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Smad7等EMT相關分子的表達,并用劃痕實驗、平板克隆形成實驗檢測其遷移能力和克隆形成能力；2)分別給予C57BL/6小鼠腹股溝處皮下接種絲裂霉素C(MMC,100μg/ml)滅活的B16F10/細胞1×107/只／周,在免疫后0、1、2、3、4周小鼠眼靜脈采血,雙抗夾心ELISA法檢測瘤苗免疫鼠血清中IFN-γ、IL-4和TGF-p的分泌,流式細胞術檢測免疫鼠脾細胞的細胞毒活性；第3次免疫后1周將小鼠隨機分組,每組6只,分別于小鼠背部皮下攻擊野生株B16F10、B16F10/shZEB1、B16F10/GPI-IL-21和B16F10/miR200c細胞1×105/只,觀察皮下腫瘤出現的時間、大小、遠處轉移情況以及小鼠的生存期等；HE染色比較各組小鼠的肺部轉移情況,免疫組化和Western-blot檢測相應腫瘤組織中EMT相關因子的表達情況。2shZEB1質粒和miR200cagomir小鼠體內接種以增強B16F10/GPI-IL-21瘤苗的抗黑色素瘤效應及其機制研究1)小鼠免疫方法同前,第三次免疫結束后分別于小鼠背部皮下攻擊野生株B16F10細胞1×105／只,攻擊后3天,將小鼠隨機分三組,分別以PBS、shZEB1質粒和miR200cagomir治療,4天／次×6；2)治療結束后小鼠眼靜脈采血,雙抗夾心ELISA法檢測瘤苗免疫鼠血清中IFN-y和TGF-p水平；處死部分小鼠,流式細胞術檢測各組荷瘤鼠的NK和CTL細胞毒活性以及脾臟和腫瘤引流淋巴結中CD4+CD25+Treg細胞的比例；觀察皮下腫瘤出現的時間、大小、遠處轉移情況以及小鼠的生存期等；HE染色比較各組小鼠的肺部轉移情況,免疫組化和Western-blot檢測相應腫瘤組織中EMT相關分子的表達。3.下調TGF-p1表達聯合miR200cagomir增強黑色素瘤苗B16F10/GPI-IL-21的抗腫瘤效應及其機制研究1)用pSUPER-EGFP1載體構建針對小鼠shTGF-β1基因的干擾質粒pSUPER-EGFP1-shTGF-β1(shTGF-p1),用脂質體將其轉染B16F10細胞,G418篩選穩(wěn)定轉染細胞株,并命名為B16F10/shTGF-β1,定量QRT-PCR檢測干擾效率,Western-blot檢測B16F10/shTGF-β1細胞中EMT相關分子的表達情況；通過克隆形成、劃痕實驗和侵襲實驗檢測其克隆形成能力、侵襲能力和遷移能力。2)按上述方法免疫小鼠,免疫后隨機分為B16F10/GPI-IL-21+B16F10/shTGF-β1組,(1×105B16F10/shTGF-β1細胞小鼠皮下成瘤),B16F10/GPI-IL-21+B16F10/shTGF-β1+miR200c組(1×105B16F10/shTGF-β1細胞小鼠皮下成瘤,同時以niR200cagomir治療),B16F10/GPI-IL-21+B16F10/Scrambled+miR200c/Scrambled組(1×105B16F10/Scramble細胞小鼠皮下成瘤,同時以miR200c/Scramble治療)；以兩組未免疫鼠為對照,分別為B16F10/shTGF-β1組(1×105B16F10/shTGF-β1細胞小鼠皮下成瘤)、B16F10/shTGF-β1+miR200c組(1×105B16F10/shTGF-β1細胞小鼠皮下成瘤,并以miR200cagomir治療)。觀察各組小鼠腫瘤出現的時間、生長速度、遠處轉移情況以及小鼠的生存時間等；HE染色比較各組小鼠腫瘤的轉移情況,免疫組化和Western-blot檢測相應腫瘤組織中EMT相關分子的表達。三.結果1)B16F10/GPI-IL21瘤苗免疫后,小鼠血清中IFN-γ、IL-4和TNFa的含量顯著升高,脾細胞的CTL毒性也明顯增強,而TGF-p含量下降。與對照組相比,實驗組小鼠的成瘤率、腫瘤生長速度以及肺轉移程度都明顯降低,小鼠的生存周期也顯著延長。免疫組化和Western-blot檢測結果顯示,各實驗組的腫瘤組織中TGF-p.ZEB1和N-Cadherin的表達都明顯降低,而E-Cadherin和Smad7的表達明顯增加,與對照組相比,差異有顯著性意義。2)以B16F10/GPI-IL21瘤苗免疫小鼠后,用B16F10攻擊小鼠,再用shZEB1質粒和niR200cagomir治療后,小鼠的NK和CTL細胞毒活性明顯增強,腫瘤引流淋巴結中CD4+CD25+Treg細胞的比例顯著降低,小鼠的成瘤率、腫瘤生長速度和肺部轉移情況明顯下降,免疫組化和Western-blot檢測結果顯示,腫瘤組織中上皮相關分子表達量增加,而間質表型的分子表達量下降,與對照組相比,差異有顯著性意義。3)用下調TGF-β1表達的B16F10細胞攻擊B16F10/GPI-IL-21瘤苗免疫后小鼠,以miR200cagomir治療后顯示,該法誘導了更強的免疫反應,與對照組相比,差異有顯著性意義。如增強小鼠NK細胞和CTL的細胞毒功能；更強的抑制Treg細胞的特異