貝伐珠單抗與順鉑、5-FU不同時序給藥方式對胃癌的影響及其機制的研究

貝伐珠單抗與順鉑、5-FU不同時序給藥方式對胃癌的影響及其機制的研究在我國,胃癌的發(fā)病率很高,由于胃癌篩查沒有得到普及和重視,大多數(shù)胃癌到中晚期才得到診斷,且由于胃部腫瘤原發(fā)或繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生致使腫瘤對化療不敏感,往往導(dǎo)致治療無效或失敗。近年來,對腫瘤耐藥相關(guān)基因功能的研究揭示了眾多的腫瘤耐藥機制,在指導(dǎo)臨床治療中逐漸凸顯出重要的作用,然而由于揭示這些基因功能的相關(guān)研究相對獨立,還難以據(jù)此整合形成一套行之有效的治療手段。因此,目前臨床治療胃癌的方法中,化療仍是主要的治療手段。近年來研究顯示,在胃癌化療臨床藥物的選擇中,順鉑(cisplatin,CDDP)聯(lián)合氟尿嘧啶以及其衍生物仍是基礎(chǔ)化療藥物之一。“抗腫瘤血管生成”是19世紀70年代由Folkman教授提出的治療腫瘤的全新理念,是腫瘤治療領(lǐng)域的里程碑式的標志。在此之后,貝伐珠單抗、恩度、索拉菲尼、舒尼替尼等抗血管生成類藥物相繼被研發(fā)。目前,國內(nèi)針對恩度抗血管生成藥物時間窗研究較多。而對舒尼替尼、索拉菲尼、貝伐珠單抗等抗血管生成藥物時間窗研究較少,其抗血管生成的作用機理、毒副反應(yīng)、單用還是與化療藥物聯(lián)用,如何聯(lián)用更有優(yōu)勢等方面進行研究還有待開展。早在2004年,貝伐珠單抗就已經(jīng)被美國FDA批準上市,被用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌、復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤以及某些腎癌。2012年,貝伐珠單抗聯(lián)合標準化療首次被歐盟委員會批準用于治療復(fù)發(fā)性卵巢癌。目前,有研究表明:作為人源化單克隆抗體,貝伐珠單抗中的鼠源性組成部分特異性地結(jié)合VEGF,從而阻斷其與內(nèi)源性VEGFR的結(jié)合,進而限制其生物學活性、抑制新生血管形成以及降低血管通透性。MGC803是胃癌VEGF表達的細胞株。本研究對不同時序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合化療對人胃癌細胞株(MGC803)的抑制作用進行了分析;建立了MGC803細胞荷瘤裸鼠模型,進一步探討了不同時序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合化療給藥方式對胃癌荷瘤小鼠的治療效果:通過小動物活體成像技術(shù)對抗血管生成藥物療效進行實時監(jiān)測;同時通過流式細胞技術(shù)、westernblot以及免疫組化技術(shù)檢測,觀察vegf/akt通路及凋亡蛋白bcl-2和bax的變化和mvd,bax,bcl-2與vegfr表達;分析并探討不同時序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合化療的給藥方式對胃癌荷瘤裸鼠治療的分子機制,以及貝伐珠單抗抗血管生成的時間窗問題。第一部分不同時序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑、5-fu對人胃癌細胞株(mgc803)抑制作用及其相關(guān)機制的探究目的:研究不同時序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑、5-fu對人胃癌細胞株(mgc803)抑制作用及其機制,嘗試找到抗血管生成藥物貝伐珠單抗與細胞毒藥物的最佳聯(lián)合時序。方法:體外培養(yǎng)人胃癌細胞mgc803,不同時序條件下,貝伐珠單抗聯(lián)合化療處理細胞,mtt法檢測mgc803細胞的生長抑制情況,流式細胞儀(pi染色)分析細胞周期分布相和細胞凋亡率。結(jié)果:1mtt測定不同單藥、不同濃度的胃癌細胞株mgc803的抑制率差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05),進一步做兩兩比較,各單藥不同濃度間的抑制率差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05),隨著濃度的增高,抑制率逐漸增高。2mtt測定不同時序聯(lián)合給藥對胃癌細胞株mgc803的抑制率差異有統(tǒng)計學意義(p<0.001),進一步做兩兩比較,抑制率最高的為fp(順鉑、5-fu)化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗(68.63%),其次為fp化療前48小時聯(lián)合貝伐珠單抗(63.46%)和fp化療前72小時聯(lián)合貝伐珠單抗(62.89%),再次為fp化療同時聯(lián)合貝伐珠單抗(60.96%)和fp化療后24小時聯(lián)合貝伐珠單抗(59.64%),再次為fp化療后48小時聯(lián)合貝伐珠單抗(57.53%)和fp化療后72小時聯(lián)合貝伐珠單抗(56.63%),單純fp方案化療組最低(52.33%)。表明先給予貝伐株單抗,再給予fp化療的聯(lián)合方案對胃癌細胞生長具有高效的抑制作用。3不同時序給藥對胃癌細胞株mgc803細胞周期g0/g1期和g2/m期差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05),s期差異有統(tǒng)計學意義(p<0.001),進一步做兩兩比較,s期最高的為fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗(48.13),均高于其他各組(p<0.05);最低的為單純fp方案化療組(23.50),均低于其他各組(p<0.05),其余各組間差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。表明fp化療前24小時給予貝伐株單抗的聯(lián)合方案明顯誘導(dǎo)胃癌細胞出現(xiàn)s期細胞阻止。4不同時序給藥的胃癌細胞株mgc803凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(p<0.001),進一步做兩兩比較,凋亡率最高的為fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗(4.76),其次為fp化療前48小時聯(lián)合貝伐珠單抗(3.41)、fp化療前72小時聯(lián)合貝伐珠單抗(3.32)、fp化療同時聯(lián)合貝伐珠單抗(2.99)和fp化療后24小時聯(lián)合貝伐珠單抗(2.90),再次為fp化療后48小時聯(lián)合貝伐珠單抗(2.21)、fp化療后72小時聯(lián)合貝伐珠單抗(2.57)和單純fp方案化療組(2.14)。結(jié)果表明fp化療前24小時給予貝伐株單抗的聯(lián)合方案明顯促進胃癌細胞凋亡。結(jié)論:1不同時序?qū)ξ赴┘毎阭gc803的抑制率不同,抑制率最高的為fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗。2不同時序給藥可以誘導(dǎo)胃癌細胞株mgc803細胞周期s期阻滯,其中fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗誘導(dǎo)s期阻滯最顯著。3不同時序給藥的胃癌細胞株mgc803凋亡率不同,誘導(dǎo)細胞凋亡最顯著的為fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗。第二部分利用小動物活體成像技術(shù)探討貝伐珠單抗與順鉑、5-fu不同時序給藥方式對胃癌荷瘤小鼠治療療效的影響目的:通過小動物活體成像系統(tǒng)觀察帶有熒光標記的腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的生長變化,進一步在整體動物水平上比較貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑、5-fu不同時序給藥方式的抗腫瘤療效的差異。方法:采用貝伐珠單抗聯(lián)合fp方案化療不同時序給藥方式對人胃癌裸鼠皮下種植模型的腫瘤生長進行干預(yù)治療,通過腫瘤體積計算抑制率,熒光信號值的變化觀察腫瘤生長情況。實驗分組和給藥時序如下:第一組a組為貝伐珠單抗+fp化療同時治療組;第二組b組為fp化療24小時后給予貝伐珠單抗;第三組c組為貝伐珠單抗24小時后給予fp化療;第四組d組為單藥貝伐珠單抗;第五組e組對照組,腹腔注射生理鹽水。結(jié)果:1不同組別裸鼠體重變化差異無統(tǒng)計學意義(p=0.219),治療后不同時間點體重變化差異有統(tǒng)計學意義(p<0.001),時間與組別間存在交互作用(p=0.031)。進一步做兩兩比較,a組不同時間點裸鼠體重變化差異無統(tǒng)計學意義(p=0.773),b,c,d,e組裸鼠體重隨時間均有增加趨勢(p<0.05)。2根據(jù)腫瘤體積計算各組抑瘤率分別為a組抑瘤率為40.95%,b組抑瘤率為37.57%,c組抑瘤率為68.42%,d組抑瘤率為19.84%。不同組別裸鼠腫瘤體積變化差異無統(tǒng)計學意義(p=0.166),治療后不同時間點腫瘤體積變化差異有統(tǒng)計學意義(p=0.006),時間與組別間存在交互作用(p<0.001),進一步做兩兩比較,用藥前和用藥一周后不同組別差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05),用藥第2周和第3周不同組別差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05),體積由小到大依次為c,a,b,d,e,c組體積明顯低于d組和e組(p<0.05),a,b,d組不同時間點裸鼠腫瘤體積變化差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05),c組裸鼠腫瘤體積隨時間呈降低趨勢(p<0.05),e組裸鼠腫瘤體積隨時間呈增加趨勢(p<0.05)。3不同組別裸鼠腫瘤熒光信號變化差異有統(tǒng)計學意義(p<0.001),治療后不同時間點腫瘤熒光信號變化差異有統(tǒng)計學意義(p<0.001),時間與組別間存在交互作用(p<0.001),進一步做兩兩比較,用藥前不同組別差異無統(tǒng)計學意義(p=0.074),用藥第1周、第2周和第3周不同組別差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05),第1周和第2周,e組均高于a,b,c,d組,第3周,熒光信號由低到高依次為c,a,b,d,e組,a組、c組裸鼠腫瘤熒光信號第3周低于用藥前(p<0.05),e組裸鼠腫瘤熒光信號隨時間呈增加趨勢(p<0.05)。結(jié)論:1貝伐珠單抗與fp聯(lián)合,具有協(xié)同作用,且先于fp化療應(yīng)用時腫瘤抑制率最為顯著。2通過在體實驗研究,利用小動物活體成像系統(tǒng)動態(tài)獲得腫瘤長徑和短徑以及熒光信號值,客觀敏感的發(fā)現(xiàn)腫瘤體積不再縮小的時間點,熒光信號繼續(xù)衰減,即藥物繼續(xù)發(fā)揮著抗腫瘤作用。第三部分貝伐珠單抗與順鉑、5-fu化療不同時序給藥方式對胃癌細胞治療療效的分子機制目的:檢測不同時序貝伐珠單抗聯(lián)合fp化療處理后的人胃癌細胞株(mgc803)以及荷瘤裸鼠腫瘤組織akt,bax,bcl-2,cyclind1,p21,pi3k,mvd的表達情況,初步探究fp化療前給予貝伐珠單抗的聯(lián)合用藥時序誘導(dǎo)胃癌細胞毒性作用的生物學機制,旨在進一步為臨床上使用貝伐珠單抗聯(lián)合fp方案治療胃癌提供相應(yīng)的理論依據(jù)。方法:通過westernblot、免疫組化技術(shù)檢測不同時序貝伐珠單抗聯(lián)合化療處理后,對人胃癌細胞株(mgc803)以及荷瘤裸鼠腫瘤組織中akt,bax,bcl-2,cyclind1,p21,pi3k,mvd,vegfr表達的影響。結(jié)果:1不同時序聯(lián)合給藥對胃癌細胞株mgc803相關(guān)蛋白表達的影響不同時序聯(lián)合給藥處理胃癌細胞株mgc803后:各組pi3k,akt,p21蛋白表達與單獨化療組相比較,均具有顯著統(tǒng)計學差異(p<0.05)。進一步做兩兩比較,表達量最高的為fp化療組,分別為:pi3k(1.11±0.03),akt(1.27±0.09),p21(1.51±0.04);其次為fp化療后72小時聯(lián)合貝伐珠單抗,分別為:pi3k(0.97±0.04),akt(1.13±0.10),p21(1.38±0.05),cyclind1以及fp化療后48小時聯(lián)合貝伐珠單抗,分別為:pi3k(0.90±0.05),akt(1.04±0.12),p21(1.35±0.05);fp化療前24小時方案聯(lián)合組最低,分別為:pi3k(0.07±0.03),akt(0.02±0.01),p21(0.13±0.02),其顯著性的治療療效可能通過抑制pi3k和akt發(fā)揮作用。除fp化療前48小時聯(lián)合貝伐珠單抗處理組外,其余各組bcl-2蛋白表達與單獨化療組相比較明顯降低,(p<0.05)。進一步做兩兩比較,表達量最高的為單純化療組(1.12±0.04),其次為fp化療后72小時聯(lián)合貝伐珠單抗(1.00±0.06)以及fp化療后24小時聯(lián)合貝伐珠單抗(0.74±0.04);fp化療前24聯(lián)合貝伐珠單抗方案組最低(0.05±0.04)。各組bax蛋白表達與單獨化療組相比較,均具有顯著統(tǒng)計學差異(p<0.05),進一步做兩兩比較,表達量最高的為fp化療前72小時聯(lián)合貝伐珠單抗(1.02±0.04),其次為fp化療前48小時聯(lián)合貝伐珠單抗(0.99±0.05)以及fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗組(0.95±0.04);fp化療組最低(0.07±0.01)。各組cyclind1蛋白表達與單獨化療組相比較,均具有顯著統(tǒng)計學差異(p<0.05),進一步做兩兩比較,表達量最低的為單純化療組(0.04±0.03),其次為fp化療后72小時聯(lián)合貝伐珠單抗(0.13±0.05)以及fp化療前48小時聯(lián)合貝伐珠單抗(0.28±0.05);fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗方案組最高(0.71±0.05)。2不同時序聯(lián)合給藥對荷瘤裸鼠腫瘤組織相關(guān)蛋白表達的影響對荷瘤(胃癌細胞株mgc803)裸鼠進行不同時序貝伐珠單抗以及化療的聯(lián)合給藥處理后:各組pi3k,akt,bcl-2蛋白表達的相對光密度值(od)與空白對照組相比較,均具有顯著統(tǒng)計學差異(p<0.05),進一步做兩兩比較,表達量最高的為空白對照組,分別為pi3k(0.73±0.04),akt(1.13±0.05),bcl-2(1.40±0.04),其次為fp化療后24小時聯(lián)合貝伐珠單抗pi3k(0.44±0.03),akt(0.46±0.02),bcl-2(1.14±0.04)和貝伐珠單抗單藥pi3k(0.14±0.03),akt(0.35±0.03),bcl-2(0.74±0.04),再次為fp化療聯(lián)合貝伐珠單抗同時給藥pi3k(0.09±0.03),akt(0.25±0.03),bcl-2(0.52±0.02);fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗最低pi3k(1.13±0.05),akt(0.06±0.03),bcl-2(0.19±0.02)。各組p21蛋白表達的相對光密度值(od)與空白對照組相比較,均具有顯著統(tǒng)計學差異(p<0.05),進一步做兩兩比較,表達量最高的為fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗(0.85±0.02);其次為貝伐珠單抗單藥(0.61±0.02)和fp化療聯(lián)合貝伐珠單抗同時給藥(0.48±0.04);fp化療后24小時聯(lián)合貝伐珠單抗(0.43±0.01)和空白對照組(0.43±0.03)最低。各組bax蛋白表達的相對光密度值(od)與空白對照組相比較,均具有顯著統(tǒng)計學差異(p<0.05),進一步做兩兩比較,表達量最高的為fp化療前24小時聯(lián)合貝伐珠單抗組(1