大鼠硅肺纖維化組織cDNA消減文庫的構建和差異表達基因的克隆

大鼠硅肺纖維化組織cDNA消減文庫的構建和差異表達基因的克隆前言:肺纖維化是一組由多種病因引起的肺破壞性疾病,肺纖維化過程包括肺組織的炎癥損傷、組織結構破壞以及隨后伴有的肺間質細胞積聚的組織修復過程。在此過程中,肺泡巨噬細胞、肺泡上皮細胞、肺成纖維細胞等效應細胞通過分泌細胞因子、炎癥介質等生物活性物質,發(fā)揮直接或間接的作用,從而使這些參與肺纖維化的多種細胞共同構成了一個復雜的細胞網(wǎng)絡,彼此間相互影響,共同促進了病變發(fā)展。但目前對該疾病發(fā)生發(fā)展起關鍵作用的細胞分子機制尚不清楚,迄今為止仍未找到有效的防治措施。目前肺纖維化的動物研究模型大多數(shù)僅限于在病變早期,尚未形成典型的肺纖維化病變,因此也不能分析肺纖維化病變與其他疾病的關系。目前認為慢性阻塞性肺疾病、間質性肺病(石棉肺、硅肺、特發(fā)性間質性肺纖維化等)均為肺癌的危險因素,間質性肺纖維化引發(fā)肺癌的機制目前尚不清楚,大多數(shù)觀點認為,間質性肺纖維化由于炎癥損傷和修復的相互作用可導致局部上皮反復的細胞及基因損傷,通過連續(xù)的細胞形態(tài)學改變如化生,異常增生,非典型增生而最終導致腫瘤發(fā)生。故加深對肺纖維化發(fā)病機制的認識,并在此基礎上發(fā)展新的治療策略已成為更加迫切的需要。目的:本研究擬通過建立大鼠慢性硅肺纖維化動物模型,利用SSH技術,篩選和鑒定硅肺纖維化大鼠與正常大鼠之間肺組織差異表達基因,旨在獲得與肺纖維化相關的特異表達基因,為肺纖維化發(fā)生機制及與其他疾病的關系提供實驗依據(jù)。方法:本研究以SD大鼠為實驗對象,采用氣管插管灌注二氧化硅粉塵,經過360天,建立硅肺肺纖維化動物模型;應用抑制消減雜交技術(SSH),結合T/A克隆技術和藍白篩選構建了硅肺肺纖維化正反向差異表達消減cDNA文庫(SNA,SNB);經過菌液PCR技術初步驗證,插入片段大小,采用半定量RT—PCR技術證實部分基因確實存在差異表達,隨機挑取部分含有插入片段的克隆進行測序分析及生物信息學分析。結果:1、360天,X線顯示大鼠肺紋理增粗,肺野有散在分布的高密度影出現(xiàn)。肉眼見肺組織表面及切面有散在分布的灰白色小結節(jié),結節(jié)大小不等;顯微鏡下肺內有典型的纖維性硅結節(jié)形成,在部分硅結節(jié)周圍肺泡上皮細胞和管上皮明顯增生,部分細胞顯不同程度不典型增生,肺間質纖維化明顯。2、分別以肺纖維化肺組織cDNA為實驗方(Tester),以正常肺組織為對照方(Driver),以正常肺組織cDNA為實驗方(Tester),以肺纖維化肺組織cDNA為對照方(Driver)構建了反向差異表達消減cDNA文庫(SNB)。經過菌液PCR技術初步驗證,插入片段大小主要分布于200-600bp之間。隨機挑取正向和反向消減文庫共52個含有插入片段的克隆進行測序分析,共獲得47個有效差異表達cDNA片段。為證實這些基因確實存在差異表達,采用半定量RT—PCR技術對隨機挑選的硅肺纖維化肺組織消減文庫中的SNA—11、SNA—28、SNA—43、SNA—48,正常肺組織消減文庫中的SNB—13、SNB—30、SNB—42進行RT—PCR分析,結果顯示它們在硅肺纖維化肺組織和正常肺組織中的表達存在差異,根據(jù)圖像掃描定量分析,在兩組肺組織中基因表達量相差在2—5倍以上。3、生物信息學分析表明雙向消減cDNA文庫測序得到的47個陽性克隆代表了35個基因,包含2個假想蛋白、4個推測的相似蛋白。其中大多數(shù)功能已知基因在細胞或細胞外基質結構/運動、細胞/機體防御、物質轉運、翻譯/表達調控、代謝等方面起重要作用。表明SSH技術是篩選差異表達基因的有效方法,對這些基因功能的步研究,有利于從另外的角度了解肺纖維化的機制。結論:1成功建立了典型大鼠慢性硅肺纖維化動物模型。2建立了較高質量的硅肺纖維化正反差異消