滅菌方法與生物指示劑

滅菌方法與生物指示劑概要滅菌法和生物指示劑生物指示劑的形式無菌保證水平滅菌工藝驗證常用滅菌方法制藥工業(yè)常用的滅菌方法生物指示劑的使用孢子數(shù)測定

滅菌法和生物指示劑

滅菌法系指用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段將物品中活的微生物殺滅或除去，從而使物品殘存活微生物的概率下降至預(yù)期的無菌保證水平的方法。

生物指示劑系一類特殊的活微生物制品，可用于確認(rèn)滅菌設(shè)備的性能、滅菌程序的驗證、生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控等。用于滅菌驗證中的生物指示劑一般是細(xì)菌的孢子。生物指示劑的形式一定數(shù)量的孢子附著在惰性載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等孢子懸浮液密封于安瓿中

無菌保證水平無菌保證水平一批物品的無菌特性只能相對地通過物品中活微生物的概率低至某個可接受水平來表述，即SAL〔sterilityassurancelevel〕。我國及歐美藥典都把SAL不得大于百萬分之一作為最終滅菌產(chǎn)品無菌保證的要求，即SAL≤10－6

滅菌工藝驗證驗證一個滅菌工藝系統(tǒng)能否使產(chǎn)品滅菌后到達(dá)無菌要求,通常認(rèn)為滅菌后微生物殘存概率小于1×10-6。物理性驗證：通過得到的熱分布與熱穿透數(shù)據(jù),來估測一個滅菌程序?qū)ξ⑸锏闹滤佬浴；瘜W(xué)指示劑驗證：物品包外用化學(xué)指示劑用于驗證物品是否經(jīng)過滅菌處理，物品包內(nèi)中心部位的化學(xué)指示劑才可作為物品是否到達(dá)滅菌的參考標(biāo)志。生物指示劑驗證：將其耐熱性的生物指示劑直接接種在產(chǎn)品溶液或相似溶液中進(jìn)行驗證,是評判滅菌工藝殺滅效果最直觀有效的方法,也是滅菌工藝驗證必不可少的試驗。常用的滅菌方法濕熱滅菌法干熱滅菌法氣體滅菌法輻射滅菌法過濾除菌法不同滅菌方式不同的菌種種類的選擇滅菌方法生物指示劑保藏號D值備注濕熱滅菌法嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusNCTC10007NCIMB8157ATCC79531.5-3.0min生孢梭菌孢子ClostridiumsporogenesNCTC8594NCIMB8053ATCC79550.4-0.8min干熱滅菌法枯草芽孢桿菌BacillussubtilisNCIMB8058ATCC9372>1.5min去熱原驗證時加大腸桿菌內(nèi)毒素(Escherichiacoliendoxin)輻射滅菌法短小芽孢桿菌BacilluspumilusNCTC10327NCIMB10692ATCC271423kGy短小芽孢桿菌孢子可用于監(jiān)控滅菌過程，但不能用于滅菌輻射劑量的建立氣體滅菌法枯草芽孢桿菌BacillussubtilisNCTC10073ATCC9372>2.5min環(huán)氧乙烷滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusNCTC10007NCIMB8157ATCC795312980氣態(tài)過氧化氫滅菌過濾除菌法缺陷假單胞菌PseudomonasdiminutaATCC19146用于濾膜孔徑為0.22μm的濾器黏質(zhì)沙雷菌Serratin

marcescensATCC14756用于濾膜孔徑為0.45μm的濾器濕熱滅菌法

指將物品置于滅菌柜內(nèi)利用高壓飽和蒸汽、過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物的方法。

須保證物品滅菌后的SAL≤10-6對熱穩(wěn)定的物品，可采用過度殺滅法，其SAL應(yīng)≤10-12

適用范圍

藥品、容器、培養(yǎng)基、無菌衣、膠塞以及其它遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損壞的物品常用的生物指示劑嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(SporesofBacillusstearothermophilus，NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)D值為1.5～3.0min生孢梭菌孢子(SporesofClostridiumsporogenes，NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955〕D值為0.4～0.8min生物指示劑的選擇干熱滅菌法

指物品于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設(shè)備中，利用干熱空氣到達(dá)殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)的方法。保證滅菌后的產(chǎn)品其SAL≤10-6干熱過度殺滅后產(chǎn)品的SAL應(yīng)≤10-12

耐高溫但不宜用濕熱滅菌法滅菌的物品的滅菌，如玻璃器具、金屬制容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等

適用范圍枯草芽孢桿菌孢子(SporesofBacillussubtilis，NCIMB8058、ATCC9372)

常用的生物指示劑

D值大于1.5min

生物指示劑的選擇氣體滅菌法

指用化學(xué)消毒劑形成的氣體殺滅微生物的方法。在充有滅菌氣體的高壓腔室內(nèi)進(jìn)行。

常用氣體：環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛等

環(huán)氧乙烷法滅菌原理：強(qiáng)氧化，其分子作用于菌體后，能與菌體蛋白、核酸和酶中的—COOH、—NH2、—SH、—OH等基團(tuán)起反響，而使菌體死亡。具有殺菌譜廣，滅菌能力強(qiáng)的特點(diǎn)，對微生物的繁殖體、芽孢有較強(qiáng)的殺滅效果。

適用范圍塑料包裝的原料粉末、散劑、顆粒等固體藥料及醫(yī)療器械類固體器具等不能采用高溫滅菌的物品的滅菌含氯的物品及能吸附環(huán)氧乙烷的物品那么不宜使用常用生物指示劑枯草芽孢桿菌孢子(SporesofBacillussubtilis，NCTC10073、NCIMB8058、ATCC9372)

D值大于2.5min

氣態(tài)過氧化氫法應(yīng)用：

隔離器的驗證

新設(shè)備或灌裝線的調(diào)整和認(rèn)證大型或組裝設(shè)備的評估未知?dú)怏w分布動力學(xué)研究含有多個裝載配置的設(shè)備認(rèn)證設(shè)備中最難滅菌位置的日常檢測

生物指示劑：嗜熱脂肪芽胞桿菌孢子(SporesofBacillusstearothermophilus，NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)生物指示劑的選擇輻射滅菌法

應(yīng)用γ射線、β射線殺滅細(xì)菌的方法，又稱電離輻射，前者由鈷-60或銫-137發(fā)出，穿透力強(qiáng)；后者由電子加速器產(chǎn)生，帶電荷，穿透力弱，滅菌效果差。γ射線滅菌機(jī)理：γ射線直接作用于微生物的蛋白質(zhì)、核酸和酶等，促使化學(xué)鍵斷裂，殺死微生物；又可間接作用于微生物體內(nèi)的水分子，引起水的電離和激發(fā)，生成自由基，再作用于微生物活性分子，使微生物死亡。對于輻射滅菌，無芽孢菌比有芽孢菌敏感得多；無芽孢菌中革蘭氏陰性菌比陽性菌敏感；而病毒敏感性很差。

適用范圍

不耐熱藥物的滅菌，醫(yī)療器械、容器、高分子材料、包裝材料、生產(chǎn)輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法滅菌。

常用生物指示劑

短小芽孢桿菌孢子(SporesofBacilluspumilus，如NCTC10327、NCIMB10692、ATCC27142)。置于放射劑量25kGy條件下，D值約3kGy。

過濾除菌法

系利用細(xì)菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。

適用范圍：對熱不穩(wěn)定的藥物溶液、氣體、水或原料的除菌。

常用生物指示劑濾膜孔徑為0.22μm的濾器：缺陷假單胞菌(Pseudomonasdiminuta,如ATCC19146)濾膜孔徑為0.45μm的濾器：黏質(zhì)沙雷菌(Serratin

marcescens,如ATCC14756)制藥工業(yè)常用的滅菌方法原料藥：化學(xué)合成藥——較高熔點(diǎn)藥物常用于干熱滅菌法，對較低熔點(diǎn)的那么用濕熱滅菌法，對不耐熱藥物，如是晶體，可溶解后過濾除菌；

植物提取物——假設(shè)是用常規(guī)或高溫提取的單一成分的流浸膏，常用壓力蒸汽法、流通蒸汽法消毒滅菌；假設(shè)是低溫提取物，那么優(yōu)先考慮過濾除菌；

生化藥物——化學(xué)消毒滅菌劑，如低溫乙醇法、低溫間歇法和過濾法等。藥品制劑：輸液劑和水針劑——壓力蒸汽滅菌法；熱不穩(wěn)定藥物如凍干粉針劑——過濾法；多數(shù)藥液——射線滅菌。軟膏等半固體制劑：干熱法或輻射法中藥：大部份藥材——壓力蒸汽法；除含揮發(fā)油、對熱不穩(wěn)定成分的藥材和生、熟成效不同的藥材——熱力法和輻射法。廠房設(shè)施、設(shè)備和工器具：

不銹鋼制密閉設(shè)備、管道——壓力蒸汽；小的設(shè)備零部件、工器具和容器——干熱法或濕熱法；耐酸堿而不耐高溫的塑料材質(zhì)物品——過氧化氫法；潔凈工作服、清潔工具——壓力蒸汽法。常用滅菌方法匯總滅菌方法適用范圍濕熱法(壓力蒸汽、流通蒸汽)設(shè)備、釜罐、管道、器械、耐熱液體制劑、生藥、無菌衣、清潔工器具等干熱法(>170℃)某些設(shè)備、器械、耐熱干粉粉劑、安瓿和西林瓶等包裝容器射線法耐輻射藥劑、生藥、包裝容器等環(huán)氧乙烷包裝材料、器械、生藥等過氧化物類(過氧化氫、二氧化氯)某些設(shè)備表面、工作臺、器械、空氣、水等醛類(甲醛、戊二醛)器械、工作臺、包裝臺、空氣過濾除菌法空氣、水、不耐熱液體藥劑、生化藥劑滅菌方法孢子生物指示劑產(chǎn)品蒸汽嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子、生孢梭菌孢子Smart-Read?EZTest?System（SEZS/5,SEZS/6）EZTest?(EZS/5,EZS/6)EZTestTestPack(STP)Releasat?(RS5/100,RS6/100)SGMStrip?(SGMS,SGMD)環(huán)氧乙烷枯草芽孢桿菌孢子EZTest?(EZG/6)EZTestTestPack(ETP)Releasat?(RG/100)SGMStrip?(SGMG,SGMD)低溫甲醛蒸汽嗜熱脂肪芽胞桿菌孢子SGMStrip?(SGMLF/6)滅菌方法孢子生物指示劑液體蒸汽嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子、枯草芽孢桿菌孢子SterilAmpII?(SA/4,SA/5,SA/6)SterilAmpII“5230”(SASU/6)MagnaAmp?(MA/5,MA/6)輻射短小芽孢桿菌孢子SGMStrip?(SGMR)干熱枯草芽孢桿菌孢子DriAmp?CulturingSet(DH/50)環(huán)氧丙烷嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子EZTest?(EZP/5)過氧化氫嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子ApexEZTest?(EZH/6)二氧化氯枯草芽孢桿菌孢子SGMStrip?(SGMG,SGMD)生物指示劑的使用選擇適宜的生物指示劑正確使用生物指示劑放置位置、數(shù)目、放置的方式使用之后的處理選擇適宜的生物指示劑生物指示劑的放置位置應(yīng)放在滅菌最困難的地方：①在滅菌器中最大包裝的中心；②滅菌器排氣口，往往不易到達(dá)滅菌溫度；③靠滅菌器的門口和底部；④不同的生物指示劑擺放要求不同。根據(jù)設(shè)備規(guī)風(fēng)格整指示劑數(shù)量，建議不少于2支，一般每個滅菌周期使用不少于10支。冷藏保存的生物指示劑使用前須室溫放置1-2小時。生物指示劑