多覺型C纖維傳導(dǎo)丟峰的活動規(guī)律與機(jī)制及其外周鎮(zhèn)痛作用

多覺型C纖維傳導(dǎo)丟峰的活動規(guī)律與機(jī)制及其外周鎮(zhèn)痛作用外周無髓鞘纖維C類傳入纖維是由背根節(jié)小細(xì)胞發(fā)出的外周突，其主要功能是將外周的傷害性信息傳入脊髓。長期以來，人們認(rèn)為軸突只是一根相對簡單的“導(dǎo)線”，其任務(wù)是忠實(shí)地傳導(dǎo)攜帶神經(jīng)信息的動作電位序列。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)：無髓鞘纖維的傳導(dǎo)功能具有傳導(dǎo)速度活動依賴性減慢和傳導(dǎo)丟峰現(xiàn)象，使得動作電位序列的傳入模式和數(shù)量都發(fā)生改變。結(jié)果提示C纖維并非忠實(shí)地傳遞神經(jīng)信息，可能在傳導(dǎo)過程中對放電序列進(jìn)行信息加工和整合。我室前期工作發(fā)現(xiàn)家兔隱神經(jīng)C纖維具有傳導(dǎo)丟峰現(xiàn)象，傳導(dǎo)丟峰現(xiàn)象是指動作電位序列在軸突上傳遞過程中發(fā)生丟失的現(xiàn)象，并將丟峰模式分為三類：不丟峰、規(guī)則丟峰和不規(guī)則丟峰。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病理痛模型尾神經(jīng)中多覺型傷害性Ｃ纖維的傳導(dǎo)丟峰程度顯著下降，并伴隨著初始傳導(dǎo)速度加快以及傳導(dǎo)速度活動依賴性減慢程度降低等現(xiàn)象，提示傳導(dǎo)丟峰程度的減弱參與了糖尿病神經(jīng)痛敏的形成。但是多覺型傷害性Ｃ纖維傳導(dǎo)丟峰程度的變化在慢性炎癥痛敏形成過程起到什么作用？哪些關(guān)鍵離子通道電流和分子參與了傳導(dǎo)丟峰的調(diào)變機(jī)制？通過何種途徑可能增加傳導(dǎo)丟峰程度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛效應(yīng)？這將是我們接下來研究課題的主要內(nèi)容。本研究以CFA慢性炎性痛模型尾神經(jīng)中多覺型傷害性Ｃ纖維為對象，運(yùn)用在體單纖維記錄的方法研究C纖維傳導(dǎo)丟峰的規(guī)律和特征。以Ｃ纖維的胞體—DRG小細(xì)胞為標(biāo)本，采用整節(jié)DRG膜片鉗記錄的方法研究傳導(dǎo)丟峰發(fā)生的離子通道機(jī)制。采用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察DRG小細(xì)胞和C纖維上相關(guān)通道表達(dá)的變化。最后通過在坐骨神經(jīng)周圍注射Ih電流的特異阻斷劑ZD7288研究增加傳導(dǎo)丟峰對動物痛敏行為的影響。第一部分：傳導(dǎo)丟峰的特征及規(guī)律實(shí)驗(yàn)以尾部皮下注射CFA3-5天的大鼠尾神經(jīng)中多覺型傷害性C纖維為研究對象，在感受野皮下給予不同頻率的電刺激，在記錄電極和刺激電極之間的神經(jīng)干施加藥物，采用在體單纖維記錄的方法研究傳導(dǎo)丟峰的規(guī)律和特征，結(jié)果表明：1.通過感受野對機(jī)械傷害性刺激和熱傷害性刺激均起反應(yīng)的Ｃ纖維定為多覺型傷害性C纖維，僅對機(jī)械刺激發(fā)生反應(yīng)的C纖維定為機(jī)械敏感C纖維。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10Hz電刺激頻率下多覺型傷害性C纖維傳導(dǎo)丟峰程度顯著大于機(jī)械敏感C纖維（多覺型傷害性C纖維組：45.8%±4.7%，機(jī)械敏感C纖維組：5.8%±2.4%，P<0.05）。重復(fù)刺激多覺型傷害性C纖維時(shí)，傳導(dǎo)速度減慢程度（Slowingofconductionvelocity,CVs）顯著大于機(jī)械敏感C纖維組（多覺型傷害性C纖維：35.5%±1.5%，機(jī)械敏感C纖維：9.1%±0.7%，P<0.05）。但兩者初始傳導(dǎo)速度（Initialconductionvelocity,CVi）并無顯著差異（多覺型C纖維組：0.75±0.04m/s，機(jī)械敏感C纖維組：0.82±0.07m/s，P>0.05）。2.在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中以多覺型傷害性C纖維為研究對象。在感受野給予2Hz,5Hz和10Hz的電刺激，與正常對照組相比，CFA組多覺型傷害性Ｃ纖維的丟峰程度均顯著降低，隨著刺激頻率的增高傳導(dǎo)丟峰程度相應(yīng)增大。CFA組丟峰程度分別為0.73%±0.31%，8.03%±1.83%和16.58%±3.46%，正常對照組的傳導(dǎo)丟峰程度分別為5.36%±2.51%，30.99%±4.08%和50.55%±4.39%，在5Hz和10Hz電刺激頻率下CFA組傳導(dǎo)丟峰程度顯著低于正常對照組（P<0.05）。在2Hz電刺激頻率下測量初始傳導(dǎo)速度，CFA慢性炎性痛后初始傳導(dǎo)速度顯著增加（CFA組：0.79±0.02m/s，對照組：0.69±0.02m/s，P<0.05），但傳導(dǎo)速度減慢程度卻顯著降低（CFA組：19.51%±1.1%，對照組：24.96%±0.7%，P<0.05）。3.在記錄電極和刺激電極之間的神經(jīng)干上分別施加不同濃度的Ih電流的特異阻斷劑ZD7288（5,10,20,40μM），在10Hz電刺激頻率下ZD7288濃度依賴性地增加傳導(dǎo)丟峰程度（依次為30.63%±2.56%，32.51%±1.82%，39.35%±3.25%，50.93%±3.64%），施加ZD7288前傳導(dǎo)丟峰程度為15.44%±2.61%（P<0.05）。在2Hz電刺激頻率下觀察ZD7288（40μM）對傳導(dǎo)速度特性的影響，發(fā)現(xiàn)加藥后CVs顯著增大（加藥前：19.11%±1.41%，加藥后：22.51%±2.42%，P<0.05），但對CVi卻沒有顯著影響（加藥前：0.78±0.02m/s，加藥后：0.75±0.02m/s，P>0.05）。4.ZD7288活動依賴性增加傳導(dǎo)丟峰程度。CFA組多覺型C纖維在2Hz電刺激頻率下均不丟峰，施加ZD7288（40μM）后丟峰程度為2.08%±2.08%，兩者沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在5Hz的電刺激下，丟峰程度由原來的3.73%±2.14%增加到15.67%±4.21%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。在10Hz電刺激頻率下，丟峰程度由15.44%±2.6%增加到50.93%±3.64%，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。5.在同樣的電刺激頻率（10Hz）下，ZD7288（150μM）選擇性增加多覺型傷害性C纖維的傳導(dǎo)丟峰程度并降低初始傳導(dǎo)速度，但是對有髓鞘A類纖維的傳導(dǎo)速度無顯著影響，也未出現(xiàn)傳導(dǎo)丟峰現(xiàn)象，表明ZD7288選擇性增加多覺型傷害性C纖維的傳導(dǎo)丟峰程度而不影響有髓鞘Ａ類纖維傳導(dǎo)。6.CFA后，大約20%的C纖維出現(xiàn)自發(fā)放電，放電頻率在0.5Hz-3Hz之間。在神經(jīng)干施加不同濃度的ZD7288（40μM，150μM，500μM），可濃度依賴性抑制自發(fā)放電頻率，（加藥后分別為：0.90±0.11Hz，0.59±0.05Hz，0.45±0.03Hz，加藥前：1.32±0.18Hz，P<0.05），且加藥后自發(fā)放電的脈沖間距（Interspikeinterval，ISI）相應(yīng)增加。7.在記錄電極和刺激電極之間的神經(jīng)干上施加低閾值鉀電流的特異阻斷劑α-DTX（0.5nM），可顯著降低傳導(dǎo)丟峰程度(加藥前：35.45%±4.23%，加藥后：8.42%±1.43%，P<0.05)。施加α-DTX后初始傳導(dǎo)速度顯著增加(加藥前：0.69±0.02m/s，加藥后：0.78±0.01m/s，P<0.05)，但CVs顯著減小(加藥前：23.5%±0.71%，加藥后：17.1%±0.79%，P<0.05)。第二部分：傳導(dǎo)丟峰離子通道機(jī)制由于C纖維的直徑較小，難以直接對其離子通道機(jī)制進(jìn)行研究。而C纖維是由DRG小細(xì)胞發(fā)出的外軸突，軸突上通道蛋白在胞體合成后運(yùn)輸?shù)捷S突特定部位，所以本部分實(shí)驗(yàn)通過膜片鉗記錄慢性炎性痛DRG小細(xì)胞上離子通道電流和興奮性的變化來反映軸突興奮性和離子通道的變化。1.CFA后DRG小細(xì)胞基強(qiáng)度下降、閾值偏向超極化和動作電位上升斜率增大，表明DRG小細(xì)胞興奮性顯著升高，但靜息膜電位并未發(fā)生顯著變化。2.在記錄浴槽中施加低閾值鉀通道阻斷劑α-DTX（100nM），可增加不同強(qiáng)度的去極化刺激誘發(fā)的DRG小細(xì)胞的放電數(shù)目，動作電位的閾值偏向更超極化水平，基強(qiáng)度減小，但是對動作電位的幅度、波寬和上升斜率沒有顯著影響。3.CFA組DRG小細(xì)胞α-DTX敏感鉀電流顯著減小(P<0.05)，但是其激活特性未發(fā)生顯著的變化。4.先將細(xì)胞鉗制在-60mV，然后在-60mV到-130mV之間再分別施加持續(xù)6s的不同超極化水平的鉗制，發(fā)現(xiàn)CFA后DRG小細(xì)胞Ih電流從-110mV起顯著增大(P<0.05)。5.CFA組DRG小細(xì)胞放電的后超極化電位（AHP）的幅度和時(shí)程均顯著減小(P<0.05)，當(dāng)在浴槽中施加ZD7288（40μM）時(shí)可顯著增大CFA組AHP幅度（正常組AHP幅度：12.2±0.62mV,n=15；CFA組AHP幅度：8.1±0.74mV，n=12；CFA+ZD7288組：10.5±0.53mV，n=12，P<0.05）和時(shí)程（對照組AHP半寬：30.2±2.5ms，n=15；CFA組AHP半寬：15.8±2.7ms，n=12；CFA+ZD7288組：25.6±3.3ms，n=12，P<0.05)。第三部分：慢性炎癥DRG小細(xì)胞和C纖維上HCN1和HCN2通道表達(dá)增加本部分采用免疫組織化學(xué)的方法觀察CFA組DRG小細(xì)胞和C纖維上HCN1和HCN2通道表達(dá)的變化。1.CFA組DRG小細(xì)胞和C纖維上HCN1通道表達(dá)均上調(diào),DRG小細(xì)胞上HCN1的熒光強(qiáng)度增加（CFA組：49.5±4.3，對照組：23.4±3.8，P<0.05），C纖維HCN1通道熒光強(qiáng)度增加（CFA組：45.8±5.4，對照組17.6±3.5，P<0.05）。2.CFADRG小細(xì)胞和C纖維上HCN2通道表達(dá)均上調(diào)，DRG小細(xì)胞上HCN2的熒光強(qiáng)度增加（CFA組：64.5±8.6，對照組：26.5±6.8，P<0.05），C纖維HCN2通道熒光強(qiáng)度增加（CFA組：44.6±7.6，對照組20.3±4.2，P<0.05）。第四部分：坐骨神經(jīng)周圍局部注射Ih電流的特異阻斷劑ZD7288抑制機(jī)械痛敏和熱痛敏本部分實(shí)驗(yàn)采用在坐骨結(jié)節(jié)和大轉(zhuǎn)子之間的坐骨神經(jīng)周圍注射不同濃度ZD7288（15μM,50μM,150μM,500μM）的方法觀察增加傳導(dǎo)丟峰程度對動物痛敏行為反應(yīng)的影響，還同時(shí)觀察這種給藥方法對運(yùn)動功能和心率變化的影響。1.坐骨神經(jīng)周圍注射ZD7288可濃度和時(shí)間依賴性地部分抑制機(jī)械痛敏和熱痛敏，ZD7288可濃度依賴性地抑制福爾馬林炎性痛動物的自發(fā)痛行為。2.坐骨神經(jīng)周圍注射ZD7288不影響動物的運(yùn)動功能。3.坐骨神經(jīng)周圍注射ZD7288（500μM，0.2ml）不影響動物心率，但腹腔注射（4mg/kg）可顯著降低動物心率。主要結(jié)論：1.在CFA慢性炎性痛模型,發(fā)現(xiàn)多覺型傷害性C纖維的傳導(dǎo)丟峰程度顯著降低。2.首次發(fā)現(xiàn)ZD7288可濃度依賴性和活動依賴性地增加多覺型傷害性C纖維的傳導(dǎo)丟峰程度,但不影響有髓鞘A類神