當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控及作用機(jī)制

當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控及作用機(jī)制1研究背景動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是一種動(dòng)脈的退行性、增生性病變,諸多危險(xiǎn)因素造成的動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷和功能失調(diào)是As發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵；血管內(nèi)皮功能及結(jié)構(gòu)完整性受損將促成早期A(yíng)s病變形成,其中內(nèi)皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的內(nèi)皮功能異常是As形成最重要的一步；內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)增殖、遷移、分化來(lái)修復(fù)受損血管內(nèi)皮,但內(nèi)皮細(xì)胞屬于終末分化的細(xì)胞,其增殖能力有限,因此內(nèi)皮修復(fù)需要其他來(lái)源的細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)是具有分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞潛能的干細(xì)胞,以骨髓含量居多；在生理或病理因素刺激下,損傷內(nèi)皮組織釋放的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)等可促使骨髓EPCs動(dòng)員至外周血,遷移、歸巢于受損內(nèi)皮,分化為內(nèi)皮細(xì)胞,發(fā)揮內(nèi)皮修復(fù)作用；然而EPCs的數(shù)量和功能在A(yíng)s及其相關(guān)疾病中均受到明顯損害,血液中EPCs數(shù)量的減少可作為As危險(xiǎn)性的一個(gè)標(biāo)志；EPCs在維護(hù)內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中具有重要作用,其數(shù)量維持在高水平將漸弱多重危險(xiǎn)因素的致As作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為As屬于本虛標(biāo)實(shí)之病,本虛多責(zé)之于氣血虧虛,標(biāo)實(shí)多與痰瘀相關(guān)；近年來(lái)諸多研究表明某些益氣補(bǔ)血、活血祛瘀的中藥及其組方能通過(guò)影響EPCs的數(shù)量和功能達(dá)到抗As的作用。當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪5份及當(dāng)歸1份組成,具有益氣補(bǔ)血、祛瘀生新的功能；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪、當(dāng)歸及當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有調(diào)血脂、抗氧化、抗炎等血管內(nèi)皮保護(hù)作用；我們前期研究也表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過(guò)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及核因子κB(NF-κB)這兩條信號(hào)通路來(lái)調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),減輕內(nèi)皮炎癥反應(yīng)；p38MAPK及NF-κB信號(hào)通路是As內(nèi)皮炎癥損傷的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,而EPCs在血管內(nèi)皮炎癥損傷的修復(fù)中起到非常重要的作用；當(dāng)歸補(bǔ)血湯通過(guò)“益氣補(bǔ)血、祛瘀生新”達(dá)到抗As的作用可能與促進(jìn)EPCs的數(shù)量及功能具有密切聯(lián)系。2研究目的EPCs是能分化為內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞,具有修復(fù)As受損血管內(nèi)皮的作用；本研究是在課題組前期研究及其他相關(guān)研究證實(shí)當(dāng)歸補(bǔ)血湯能調(diào)節(jié)血脂、抗氧化損傷、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、保護(hù)血管內(nèi)皮功能的基礎(chǔ)上,通過(guò)研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化EPCs數(shù)量及功能的作用,探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)EPCs的作用效果、分子機(jī)制及信號(hào)通路,補(bǔ)充并發(fā)展當(dāng)歸補(bǔ)血湯防治As的作用機(jī)制,開(kāi)拓中西醫(yī)結(jié)合防治As研究的新思路。3研究?jī)?nèi)容3.1觀(guān)察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)As模型兔外周血及骨髓EPCs數(shù)量和功能、血清VEGF和SDF-1含量的影響,探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)EPCs的整體作用效果及可能機(jī)制。3.2觀(guān)察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)體外刺激人外周血EPCs功能、凋亡、Bcl-2mRNA及其蛋白表達(dá)的影響,探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)EPCs凋亡的作用及機(jī)制。3.3觀(guān)察當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)人外周血EPCs功能、一氧化氮(NO)分泌量、一氧化氮合成酶(eNOS)mRNA和蛋白激酶B(Akt)表達(dá)的影響,探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)EPCs作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。4研究方法4.1當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)As模型兔EPCs的影響及作用機(jī)制取黃芪5份及當(dāng)歸1份,文火水煎并濃縮成含1g/mL生藥的煎液；新西蘭兔25只,免疫損傷聯(lián)合高脂飲食法4周后形成As模型；模型動(dòng)物按體重隨機(jī)分為5組,每組5只。模型組灌胃等量蒸餾水,辛伐他汀組灌胃辛伐他汀水懸液1.7mg/kg,當(dāng)歸補(bǔ)血湯高、中、低劑量組分別灌胃當(dāng)歸補(bǔ)血湯6g/kg、3g/kg、1.5g/kg,各組每日灌胃1次,持續(xù)2周,灌胃結(jié)束后采取兔腹主動(dòng)脈血,Elisa法檢測(cè)兔血清VEGF及SDF-1的含量；抽取髂棘及脛骨骨髓,密度梯度離心法分離獲取兔外周血及骨髓單個(gè)核細(xì)胞,誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs,培養(yǎng)第7d后,將貼壁細(xì)胞與Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1(FITC-UEA-1)共同孵育以鑒定EPCs；觀(guān)察細(xì)胞集落形成狀況,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖功能,黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附功能,transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移功能,體外成血管試劑盒檢測(cè)細(xì)胞成小管功能。4.2當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)ox-LDL體外刺激人EPCs的影響及作用機(jī)制取黃芪5份及當(dāng)歸1份,文火水煎并濃縮成含0.48g/mL生藥的煎液,過(guò)濾除菌后調(diào)整藥液PH值為7.2；密度梯度離心法分離獲取人外周血單個(gè)核細(xì)胞,誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后收集貼壁細(xì)胞行EPCs鑒定。將EPCs分為11組：A對(duì)照組用含0.2%牛血清白蛋白的M199培養(yǎng)液孵育48h；B藥物處理組(共5組)分別用含蒸餾水、辛伐他汀(0.1umol/L)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高濃度(4g／L)、中濃度(2g／L)、低濃度(1g／L)的M199培養(yǎng)液孵育24h,然后移去上清,加入M199培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24h;Cox-LDL刺激組(共5組)分別用含蒸餾水、辛伐他汀(0.1umol/L)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高、中、低濃度的M199培養(yǎng)液孵育24h后,移去上清,加入含10mg/Lox-LDL的M199培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24h。處理完畢后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖功能,黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附功能,transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移功能,體外成血管試劑盒檢測(cè)細(xì)胞成小管功能,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Bcl-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量,Western-blot方法檢測(cè)Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.3當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)人EPCs的影響及作用機(jī)制健康新西蘭大白兔8只,按體重隨機(jī)分為對(duì)照組(灌胃等量蒸餾水)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組(15g/kg)、中劑量組(7.5g/kg)、低劑量組(1.5g/kg),每組2只,每天分兩次灌胃,連續(xù)3d后禁食12h,于第4d上午灌胃2h后采取腹主動(dòng)脈血,離心取上清,微孔濾器過(guò)濾除菌。分離培養(yǎng)并鑒定人外周血EPCs,將培養(yǎng)第7d的EPCs隨機(jī)分為8組：A對(duì)照組加入含10%對(duì)照組兔血清的M199培養(yǎng)液；B辛伐他汀組加入含0.1umol/L辛伐他汀及10%對(duì)照組兔血清的M199培養(yǎng)液；C當(dāng)歸補(bǔ)血湯各劑量組(共3組)分別加入含10%當(dāng)歸補(bǔ)血湯高、中、低劑量含藥血清的M199培養(yǎng)液；D當(dāng)歸補(bǔ)血湯各抑制劑組(共3組)分別加入含10%高、中、低劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清和PI3K/Akt特異性抑制劑wortamannin(WT)的M199培養(yǎng)液,以上各組處理24h后,檢測(cè)細(xì)胞N0分泌量,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖功能,黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附功能,transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移功能,體外成血管試劑盒檢測(cè)細(xì)胞成小管功能,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)eNOSmRNA的相對(duì)表達(dá)量,Western-blot方法檢測(cè)總Akt、磷酸化(p-Akt)的相對(duì)表達(dá)量。5研究結(jié)果5.1當(dāng)歸補(bǔ)血湯可促進(jìn)As模型兔EPCs的數(shù)量及功能As模型兔外周血EPCs及骨髓EPCs的增殖功能、黏附功能、遷移功能及成小管功能均有不同程度的降低；細(xì)胞集落數(shù)可直觀(guān)反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量,培養(yǎng)過(guò)程中模型組家兔外周血EPCs無(wú)集落形成,而骨髓EPCs集落形成稀少,這表明EPCs的數(shù)量及各項(xiàng)功能均在A(yíng)s病變中受到損害,而當(dāng)歸補(bǔ)血湯及辛伐他汀可促進(jìn)EPCs的功能及集落形成；VEGF和SDF-1是EPCs從骨髓動(dòng)員至外周血,遷移分化為血管內(nèi)皮過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,當(dāng)歸補(bǔ)血湯及辛伐他汀組動(dòng)物血清VEGF、SDF-1較模型組維持在較高水平,這提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能是通過(guò)維持循環(huán)VEGF、SDF-1的水平來(lái)參與調(diào)節(jié)促進(jìn)EPCs的數(shù)量及功能。5.2當(dāng)歸補(bǔ)血湯可保護(hù)。x-LDL體外誘導(dǎo)EPCs的凋亡及功能辛伐他汀及當(dāng)歸補(bǔ)血湯高、中、低濃度均能顯著改善正常人EPCs的增殖功能、遷移功能、黏附功能及成小管功能；EPCs各項(xiàng)功能在ox-LDL刺激后均受到不同程度的損害,細(xì)胞凋亡嚴(yán)重,Bcl-2mRNA及蛋白的表達(dá)下降；加入當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)后,EPCs的各項(xiàng)功能得到了一定程度的恢復(fù),細(xì)胞存活增加,Bcl-2mRNA及蛋白的表達(dá)上調(diào)；這提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞Bcl-2mRNA及蛋白的水平來(lái)促進(jìn)EPCs活性,保護(hù)ox-LDL誘導(dǎo)后受損的EPCs功能,抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。5.3當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過(guò)PI3K/Akt通路調(diào)控EPCs的活性當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清及辛伐他汀均可促進(jìn)EPCs增殖功能、遷移功能、黏附功能及成小管功能,促進(jìn)細(xì)胞N0的分泌,上調(diào)eNOSmRNA及總Akt、p-Akt蛋白的表達(dá);特異性抑制劑WT能阻斷當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)EPCs各項(xiàng)功能的促進(jìn)作用,而且經(jīng)當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理的細(xì)胞分泌NO、表達(dá)eNOSmRNA及總Akt、p-Akt蛋白的水平均在WT處理后明顯漸弱,這證明當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控EPCs活性的可能機(jī)制之一是通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路。6討論及結(jié)論As及其相關(guān)疾病,中醫(yī)研究認(rèn)為其病機(jī)主要是氣血不足、血脈瘀阻；動(dòng)脈粥樣硬化EPCs數(shù)量及功能的受損與氣血不足、血脈瘀阻有著密切的關(guān)系；EPCs具有干細(xì)胞功能,能通過(guò)動(dòng)員、歸巢、分化等步驟修復(fù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞,可被認(rèn)為是中醫(yī)學(xué)的“正氣”：中醫(yī)認(rèn)為“正氣存內(nèi),邪不可干”,補(bǔ)益正氣能提高機(jī)體功能,促進(jìn)修復(fù),因此可將EPCs對(duì)As損傷內(nèi)皮的修復(fù)理解為機(jī)體正氣抗邪、驅(qū)邪外出、固衛(wèi)自身的表現(xiàn)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯通過(guò)益氣補(bǔ)血,祛瘀生新達(dá)到抗As作用與促進(jìn)EPCs活性之間具有密切聯(lián)系。本文在國(guó)內(nèi)率先開(kāi)展了當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化EPCs調(diào)控作用的研究,結(jié)果表明EPCs的數(shù)量及功能在A(yíng)s病程中受到不同程度的損害,當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化EPCs的數(shù)量和功能,動(dòng)員并促進(jìn)其遷移、歸巢、粘附