發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法

14發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法從微生物發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中提取生化物質(zhì)的第一個必要步驟就是預(yù)處理和固液分離。14.1發(fā)酵液的預(yù)處理從懸浮液中分離固形物的速度，取決于該液體的物理性質(zhì)、常采用預(yù)處理的辦法改變其物理性質(zhì)而促其分離。細(xì)菌及某些放線菌菌體細(xì)小，發(fā)酵液粘度大，不能直接過濾。由于菌體自溶，核酸、蛋白質(zhì)及其它有機粘性物質(zhì)的存在會造成濾液渾濁，濾速極慢。因此，在預(yù)處理中應(yīng)采用絮凝或凝聚的方法，設(shè)法增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速度，或采用稀釋、加熱等方法降低粘度，以利于過濾。發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，其中對提煉影響最大的是高價無機離子（Ca＋＋、Mg十＋、Fe＋＋）和雜蛋白質(zhì)等。

高價無機離子的存在，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。雜蛋白質(zhì)的存在，不僅在采用離子交換法和大網(wǎng)格樹脂吸附法提煉時會降低其吸附能力，而且在采用有機溶劑或兩水相萃取時，容易產(chǎn)生乳化，使兩相分離不清，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。14.1高價無機離子的去除方法為去除鈣離子，宜加入草酸,可用其可溶性鹽，如草酸鈉。反應(yīng)生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固，提高濾液（也稱為原液）質(zhì)量。但草酸價格較貴，加入硫酸鉛，在60℃下反應(yīng)生成草酸鉛。后者在90－95℃下用硫酸分解，經(jīng)過濾、冷卻、結(jié)晶后可以回收草酸。草酸鎂的溶解度較大。故加入草酸不能除盡鎂離子。要除去鎂離子，可以加入三聚磷酸鈉，它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物：Na5P3O10＋Mg＋＋＝MgNaNa3P3O10＋2Na十用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。要除去鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍(lán)沉淀。14.l.2雜蛋白質(zhì)的去除方法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。膠體粒子的穩(wěn)定性和其所帶電荷有關(guān)。蛋白質(zhì)在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點。因為羧基的電離度比氨基大，故蛋白質(zhì)的酸性性質(zhì)通常強于堿性，因而很多蛋白質(zhì)的等電點都在酸性范圍內(nèi)（pH4.0－5.5）。但單靠調(diào)節(jié)pH至等電點的辦法不能將大部分蛋白質(zhì)除去。在酸性溶液中，蛋白質(zhì)能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子，如Ag十，Cu＋＋，Zn十十，F(xiàn)e＋＋和Pb＋＋等形成沉淀。變性蛋白質(zhì)溶解度較小。最常用的使蛋白質(zhì)變性的方法是加熱。加熱還能使液體粘度降低，加快過濾速度。該法只適用于對熱較穩(wěn)定的生化物質(zhì)。使蛋白質(zhì)變性的其它辦法還有：大幅度改變pH，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。在抗生素生產(chǎn)中，常將發(fā)酵液pH調(diào)至偏酸性范圍（pH2－3）或較堿性范圍（pH8一9）使蛋白質(zhì)凝固，一般以酸性下除去的蛋白質(zhì)較多。加有機溶劑使蛋白質(zhì)變性的方法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。此外，還可以利用吸附作用除去蛋白質(zhì)。例如，四環(huán)類抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3〔Fe（CN）5〕2的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)。在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，這兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過濾速度。14.l.3凝聚和絮凝技術(shù)凝聚和絮凝技術(shù)能有效地改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使聚集起來，增大體積，以便于過濾，常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中。凝聚和絮凝的概念凝聚是在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。

絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團的過程，是一種以物理的集合為主的過程。發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。

通常發(fā)酵液中細(xì)胞或菌體帶有負(fù)電荷，由于靜電引力的作用使溶液中帶相反電荷的粒子（即正離子）被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。但是這些正離子還受到使它們均勻分布開去的熱運動的影響，具有離開膠粒表面的趨勢，在這兩種相反作用的影響下，雙電層就分裂成兩部分，在相距膠核表面約一個離子半徑的Stern平面以內(nèi)，正離子被緊密束縛在膠核表面，稱為吸附層或緊密層；在stern平面以外，剩余的正離子則在溶液中擴散開去，距離越遠(yuǎn)，濃度越小，最后達(dá)到主體溶液的平均濃度，稱為擴散層。這樣就形成了擴散雙電層的結(jié)構(gòu)模型，如圖14－1所示。當(dāng)膠粒在溶液中作相對運動時，總有一薄層液體，隨著它一起滑移，這一薄層，厚度比吸附層稍大，滑移面（剪切面）在圖14－l中用波紋線表示。

這三種電位中只有ζ電位能實際測得，所以可以認(rèn)為它是控制膠粒間電排斥作用的電位，用來表征雙電層的特征，并作為研究凝聚機理的重要參數(shù)。膠粒能保持分散狀態(tài)的原因主要是帶有相同電荷和擴散雙電層的結(jié)構(gòu)，一旦由于布朗（Brown）運動使粒子間距離縮小到它們的擴散層部分重疊時，即產(chǎn)生使兩個粒子分開：從而阻止了粒子的聚集。ζ電位越大，電排斥作用就越強，膠粒的分散程度也越大，此外，由于膠粒表面的水化作用，形成了包圍于粒子周圍的水化層，也能阻礙膠粒間的直接聚集。但是，水化膜主要是伴隨膠粒帶電而引起的，一旦ζ電位降低或消除，水化層也會隨之減弱或消失。根據(jù)靜電學(xué)基本定理，可導(dǎo)出ζ電位的基本公式為：ζ＝4πqδ/D其中D—水的介電常數(shù)；q—膠體的電動電荷密度，即滑移面上的電荷密度；δ—擴散層的有效厚度，即為吸附層和擴散層界面處電位φd降低到其值為1/e處的距離，可知，ζ電位與擴散層厚度δ和電動電荷密度q成正比，而擴散層厚度又與溶液中離子強度有關(guān)，當(dāng)雙電層的排斥力不足以抗衡膠粒間的范德華引力時，由于熱運動的結(jié)果導(dǎo)致膠粒的互相碰撞而聚集起來。由此可見，在發(fā)酵液中加入具有高價陽離子的電解質(zhì)，能降低ζ電位和脫除膠粒表面的水化膜，就能導(dǎo)致膠粒間的凝聚作用。常用的凝聚劑電解質(zhì)有：Al2（SO4）3·18H2O（明礬）；AlC13·6H2O；FeC13；ZnSO4；MgCO3等。有機高分子聚合物絮凝劑，它們具有長鏈線狀的結(jié)構(gòu)，是一種水溶性的聚合物，分子量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，在長的鏈節(jié)上含有相當(dāng)多的活性功能團，可以帶有多價電荷（如陰離子或陽離子），也可以不帶電性（如非離子型）。它們通過靜電引力、范德華分子引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面，一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上，產(chǎn)生了架橋聯(lián)接，生成粗大的絮團，這就是架凝作用。如果膠粒相互間的排斥電位不太高，只要高分子聚合物的鏈節(jié)足夠長，跨越的距離超過顆粒間的有效排斥距離，也能把多個膠粒拉在一起，導(dǎo)致架橋絮凝。目前最常見的高分子聚合物絮凝劑是有機合成的聚丙烯酰胺類衍生物。根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為非離子型、陰離子型（含有羧基）和陽離子型（含有胺基）三類。聚丙烯酰胺類絮凝劑具有用量少，絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快以及種類多等優(yōu)點，所以適用范圍廣。它們的主要缺點是存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，要考慮這些物質(zhì)最終能否從產(chǎn)品中去除。近年來還發(fā)展了聚丙烯酸類陰離子絮凝劑，它們無毒，可用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中。另外，還有聚苯乙烯類衍生物及無機高分子聚合物絮凝劑，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等。除此以外，也可采用天然有機高分子絮凝劑。如多聚糖類膠粘物，海藻酸鈉，明膠、骨膠、殼多糖和脫乙酰殼多糖等。對于帶負(fù)電性菌體或蛋白質(zhì)來說，陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低粒子排斥電位和產(chǎn)生吸附架橋的雙重機理，所以可以單獨使用。對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，則主要通過分子間引力和氫鍵作用產(chǎn)生吸附架橋，它們常與無機電解質(zhì)凝聚劑搭配使用。首先加入無機電解質(zhì)，使懸浮粒子間的相互排斥能降低，脫穩(wěn)而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝劑。無機電解質(zhì)的凝聚作用為高分子絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件，從而，提高了絮凝效果。這種包括凝聚和絮凝機理的過程，常稱為混凝。

絮凝劑濃度增加有助于架橋充分，但是，過多的加量反而會引起吸附飽和，在每個膠粒上形成覆蓋層而使膠粒產(chǎn)生再次穩(wěn)定現(xiàn)象見圖（14－2）。適宜的加量通常由實驗得出。雖然高分子絮凝劑分子量提高，鏈增長，可使架橋效果明顯，但是，分子量不能超過一定的限度，因為隨分子量提高，高分子絮凝劑的水溶性降低。溶液PH的變化常會影響離子型絮凝劑中功能團的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。電離度增大，由于鏈節(jié)上相鄰離子基團間的電排斥作用，而使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，所以架橋能力提高。14.2發(fā)酵液的過濾微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細(xì)胞或細(xì)胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。過濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進(jìn)行分離的過程。14.2.4發(fā)酵液的過濾特性和濾餅的重量比阻微生物的發(fā)酵液大多數(shù)屬于非牛頓型液體，濾渣為可壓縮性的。衡量過濾特性的主要指標(biāo)是濾餅的重量比阻rB，它表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。對于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)，但對于可壓縮性濾餅，比阻rB是操作壓力差的函數(shù)，一般可用下式表示：rB＝r（△p）m式中r—不可壓縮濾渣的比阻，對于一定的料液，其值為常數(shù)；m—壓縮性指數(shù)，一般取0.5－0.8，對不可壓縮性濾餅，m為0；可見，濾餅的比阻值是隨操作壓力差的提高而增大的。因此，開始過濾時應(yīng)注意不能很快提高壓差，通?？恳褐淖匀粔翰钸M(jìn)料，并應(yīng)緩慢地，逐步地升高壓力，一般在相當(dāng)長的時間內(nèi)，壓力差不要超過0.05MPa，最后的壓差也不超過0.3－0.4MPa。

如果操作壓力控制過高，由于比阻值的急劇增加，會使過濾速度很快下降，以至達(dá)到不能繼續(xù)過濾的程度。恒壓下，可壓縮性濾餅的比阻值應(yīng)為常數(shù)。如過濾介質(zhì)的阻力相對較小可以忽略不計，則恒壓下的過濾方程式如下：q2＝2△pτ/μrBXB式中q--到瞬間τ，通過單位過濾面積的濾液量，m；△p—壓力差，Pa；μ—濾液粘度，Pa．s；

rB—濾餅的重量比阻，m／kg；XB—通過單位體積濾液，所形成的濾渣重量（干重），kg／m3；τ—過濾時間，s。14.2.2影響過濾速度的因素過濾速度和菌種、發(fā)酵條件（培養(yǎng)基的組成，未用完培養(yǎng)基的數(shù)量，消沫油，發(fā)酵周期）等有關(guān)。菌種對過濾速度影響很大。一般，真菌的菌絲比較粗大，發(fā)酵液容易過濾，常不需特殊處理。其濾渣呈緊密餅狀物，很容易從濾布上刮下來，故可采用鼓式真空過濾機過濾。放線菌發(fā)酵液菌絲細(xì)而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀。還含有很多多糖類物質(zhì)，粘性強，過濾較困難，一般需經(jīng)預(yù)處理，以凝固蛋白質(zhì)等膠體。細(xì)菌發(fā)酵液的菌體更細(xì)小，因此，過濾十分困難，如不用絮凝等方法預(yù)處理發(fā)酵液，往往難以采用常規(guī)過濾的設(shè)備來完成過濾操作。培養(yǎng)基的組成對過濾速度影響也很大。用黃豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源會使過濾困難。此外，發(fā)酵后期加消沫油或剩余大量未用完的培養(yǎng)基，都會使過濾困難。正確選擇發(fā)酵終了時間對過濾影響很大。在菌絲自溶前必須放罐，因為細(xì)胞自溶后的分解產(chǎn)物一般很難過濾。有時延長發(fā)酵