第四章 食品微生物檢驗(yàn)方法手段

第四章食品微生物檢驗(yàn)方法手段在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)過程中，需求采用很多方法和手段。下面就幾種常用的檢驗(yàn)方法作一些根本引見。一、顯微鏡檢驗(yàn)在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，為了可以發(fā)現(xiàn)微生物或察看其形狀、陳列及某些構(gòu)造，必需借助于顯微鏡。顯微鏡察看的微生物標(biāo)本普通分為兩種：染色標(biāo)本和不染色標(biāo)本。〔一〕不染色標(biāo)本的檢驗(yàn)在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，檢驗(yàn)不染色標(biāo)本是為了察看微生物細(xì)胞在生活時期原有的形狀、大小及確定細(xì)胞能否運(yùn)動等。不染色標(biāo)本的根本制片方法有以下兩種：1、壓滴法在載波片上加一滴生理鹽水，再在其中滴加少許要察看的含菌液體或少量要察看的固體培育物，使菌體均勻分布在生理鹽水中，然后蓋上蓋玻片，即可進(jìn)展鏡檢。2、懸滴法將待察看的含菌液體滴在蓋玻片上，然后將其反扣在凹玻片上，使液滴懸掛在凹室內(nèi)?！捕橙旧珮?biāo)本的檢驗(yàn)染色標(biāo)本是將檢驗(yàn)標(biāo)本根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康模匆欢ǖ姆椒ㄍ科潭?，用適當(dāng)?shù)娜玖先旧傻臉?biāo)本。經(jīng)過染色，微生物細(xì)胞與其背景的色差添加，鏡檢時更加明晰可見。染色標(biāo)本除能顯示微生物的形狀、陳列和一定的構(gòu)造外，還能顯示某些細(xì)胞成分的性質(zhì)及其分布的位置、區(qū)別活菌與死菌、鑒定微生物的種類。革蘭氏染色法革蘭氏染色法盧戈氏碘液媒染1min95%乙醇脫色20-30s番紅花紅復(fù)染1-2min革蘭氏染色法呈現(xiàn)第一次染色效果-紫色，革蘭氏染色陽性菌呈現(xiàn)第二次染色的效果-紅色革蘭氏染色陰性菌二、培育檢驗(yàn)在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，分別培育是一項(xiàng)非常重要的任務(wù)，它對進(jìn)一步確定微生物的種類和研討它們的特性等都具有重要意義。微生物的接種和培育接種工具有：接種針、環(huán)、鉤、玻璃涂棒、接種圈、接種鋤、小解剖刀

1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀A劃線接種：是最常用的接種方法。即在固體培育基外表作來回直線形的挪動就可到達(dá)接種的目的。常用的接種工具是接種環(huán)、接種針。劃線接種是在斜面接種和平板劃線中常用的方法。

B三點(diǎn)接種〔點(diǎn)植法〕：在研討霉菌的形狀時常用此法。它是把少量的微生物接種在平板外表成等邊三角形的三點(diǎn)上，讓它各自獨(dú)立構(gòu)成菌落來察看研討它們的形狀。除三點(diǎn)外，還有一點(diǎn)或多點(diǎn)接種的。C穿刺法接種：在保藏厭氧菌種或研討微生物的動力時常用此法。所用工具是接種針，培育基是半固體培育基。詳細(xì)做法：用接種針蘸取少量菌種，沿半固體培育基中心向管底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動，那么在穿刺線周圍可以生長。D澆混接種〔傾注法〕：是將待接的微生物先放入培育皿中，然后倒入冷卻至45左右的固體培育基，迅速悄然搖勻，這樣菌液就到達(dá)了稀釋的目的。待平板凝固后，置適宜溫度下培育，就可長出單個生物菌落。E涂布接種〔涂布法〕：與傾注法略有不同,即先倒好平板，讓其凝固，然后將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在外表作來回左右的涂布，讓菌液分布均勻，就可長出單個的微生物菌落。F液體接種：從固體培育基中將菌洗下，到入液體培育基中，或從液體培育物中用移液管將菌液接至液體培育基中，或從液體培育物中將菌液移至固體培育基中都可稱液體接種。G注射接種：是用注射的方法，將待接的微生物轉(zhuǎn)至活的生物體內(nèi)如人或其他動物中，常見的是疫苗預(yù)防接種，來預(yù)防某些疾病。H活體接種：是專門用于培育病毒或其他病原微生物的一種方法，由于病毒必需接種于活的生物體內(nèi)才干生長繁衍?；铙w可以是整個動物也可以是某個離體的活組織如猴腎，也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，根據(jù)被檢資料的不同和檢驗(yàn)步驟中的要求不同，在同一種培育基上可以有不同的接種方法。在進(jìn)展菌落總數(shù)測定時，用的是傾注法接種，再進(jìn)展各種被檢微生物得分別時，常采用劃線法接種，雖然他們用的都是瓊脂平板，但接種方法各異。食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中常用的接種方法有涂布法、劃線法、傾注法、定植法、穿刺法。傾注平板法〔2〕微生物的培育根據(jù)培育時能否需求氧氣，可分為好氧培育：這種微生物在培育時，需求有氧氣參與，否那么不能生長良好，實(shí)驗(yàn)是中斜面培育是經(jīng)過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培育多數(shù)是經(jīng)過搖床震蕩，使外界的空氣源源不斷的進(jìn)入瓶中。厭氧培育：這類微生物在培育時，不需求氧氣參與。在厭氧微生物的培育過程中，最重要的一定是要除去培育基中的氧氣?？刹捎靡韵路椒ǔパ鯕??！?〕降低培育基中的氧化復(fù)原電位：常將復(fù)原劑谷胱甘肽，硫基酸鹽等，加如到培育基中，即可到達(dá)目的，有的將一些動物死的或活的組織如牛心羊腦參與到培育基中，也可適宜厭氧菌的生長?！?〕化合去氧法：主要有焦性沒食酸吸收氧氣，用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧菌混合培育吸收氧氣，用植物的組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣，用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧?！?〕隔絕阻氧：深層液體培育，用石蠟油封存，半固體穿刺培育〔4〕替代驅(qū)氧：用CO2驅(qū)代氧，用氮?dú)怛?qū)代氧，用真空驅(qū)代氧，用氫氣驅(qū)代氧，用混合氣體驅(qū)代氧2．培育結(jié)果的察看各種微生物經(jīng)過培育后，表現(xiàn)出一定特征，這在食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，是鑒別微生物種類的重要根據(jù)?！?〕固體培育基上菌落形狀特征的察看細(xì)菌在固體培育基上，經(jīng)過一定時間的培育，即可出現(xiàn)肉眼可見的菌落，每種細(xì)菌都有一定的菌落形狀和特征，主要包括菌落的大小、外形、邊緣形狀、顏色、透明度等察看菌落的形狀特征，通常先用肉眼察看，再用放大鏡仔細(xì)察看，必要時可用低倍鏡察看?！?〕液體培育基中培育特征的察看主要是液體的渾濁度能否產(chǎn)生沉淀，液體外表有無菌膜構(gòu)成，有無附著菌環(huán)，培育液的顏色以及能否產(chǎn)氣等。〔3〕半固體培育基中培育特征的察看主要是其能否需氧及其運(yùn)動情況，是在上部還是在下部深層生長，是沿穿刺線生長還是樹根樣生長?！踩成瘜?shí)驗(yàn)各種微生物含有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，用于進(jìn)展代謝活動，在代謝過程中產(chǎn)生的產(chǎn)物也有各自的特點(diǎn)，可借此區(qū)別和鑒定微生物的種類。利用這種特點(diǎn)可鑒別微生物。生化實(shí)驗(yàn)或生化反響是經(jīng)過利用生物化學(xué)的方法來測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來鑒別細(xì)菌的類別、屬種的實(shí)驗(yàn)。

在進(jìn)展生化實(shí)驗(yàn)時，必需采用純培育，嚴(yán)禁其他種類的微生物污染，否那么會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果，生化實(shí)驗(yàn)工程很多，應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康倪m中選擇。1.糖醇類代謝實(shí)驗(yàn)此類實(shí)驗(yàn)主要用于察看微生物對某些糖類分解的才干以及不同的分解產(chǎn)物，從而進(jìn)展微生物的鑒定，常見的實(shí)驗(yàn)有以下幾種〔1〕糖醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)不同的微生物可對各種糖類、醇類等進(jìn)展分解，但不同的微生物的分解才干和產(chǎn)物都不一樣，如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖〔產(chǎn)酸產(chǎn)氣〕，沙門氏菌只分解葡萄糖不能分解乳糖〔只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣〕。根據(jù)這一特點(diǎn)，在進(jìn)展大腸菌群測定時，可采用乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時，培育基內(nèi)的溴甲酚紫指示劑由藍(lán)紫色變?yōu)辄S色。乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣景象〔2〕甲基紅實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸锶绱竽c桿菌、志賀氏菌等，在糖代謝過程中能分解葡萄糖產(chǎn)生多種有機(jī)酸，酸類增多會使培育物的濃度增大。當(dāng)培育基的PH低于4.5時，甲基紅指示劑是紅色〔陽性反響〕；有些細(xì)菌產(chǎn)酸量少，培育基的PH堅(jiān)持在6.2以上，指示劑呈現(xiàn)黃色〔陰性反響〕〔3〕V-P實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸锬芊纸馄咸烟钱a(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)縮合、脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被空氣中的氧氣氧化生成二乙酰，在萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰與蛋白胨中所含的胍基成分作用生成紅色化合物，即V-P實(shí)驗(yàn)陽性。

1.糖醇類代謝實(shí)驗(yàn)〔4〕七葉苷水解實(shí)驗(yàn)原理：七葉苷被細(xì)菌分解后，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與Fe2+結(jié)合，生成黑色化合物，使培育基呈黑色，以此鑒別細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)方法：將待試純培育物少許，接種于七葉苷培育基，于36±1℃培育24h,察看結(jié)果。結(jié)果察看與記錄〔1〕培育基變?yōu)楹谏蜃睾谏撸瑸殛栃?，記錄?〔2〕培育基不變色者，為陰性，記錄-

〔三〕生化實(shí)驗(yàn)七葉苷水解實(shí)驗(yàn)單增李斯特氏菌陽性〔5〕B-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)有些微生物在含有乳糖或B-半乳糖苷化合物的存在下，產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，這種酶具有活力，經(jīng)一系列反響，使培育物變成深黃色。2、蛋白質(zhì)及氨基酸代謝實(shí)驗(yàn)〔1〕靛基質(zhì)〔吲哚〕實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸锶绱竽c桿菌、變形桿菌、霍亂弧菌等，含有色氨酸酶，能使培育基中色氨酸水解脫氨生成吲哚，吲哚與對二甲基氨基苯甲醛反響生成紅色的玫瑰吲哚而是紅色，即吲哚實(shí)驗(yàn)的陽性反響。〔2〕產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)〔沙門氏菌檢驗(yàn)〕某些微生物如沙門氏菌、變形桿菌、枯草桿菌、酵母菌等能水解蛋白質(zhì)中含硫氨基酸〔如胱氨酸、半胱氨酸〕產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與二價(jià)鐵離子或鉛離子生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌〔3〕尿素酶檢驗(yàn)〔沙門氏菌檢驗(yàn)〕某些微生物如普通變形桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、奇特變形桿菌屬、沙門氏菌的個別變種能產(chǎn)生尿素酶，分解培育基的尿素而產(chǎn)生氨，使培育基變成堿性，最終粉紅色指示劑〔酚紅〕變?yōu)榧t色。〔4〕氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)〔沙門氏菌檢驗(yàn)〕某些微生物如沙門氏菌屬含有氨基酸脫羧酶，使氨基酸脫羧產(chǎn)生胺類和二氧化碳。胺類的存在使培育基變?yōu)閴A性而使指示劑變色〔溴甲酚紫陽性紫色，陰性黃色，陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培育基變成黃色〕。常用于脫羧酶實(shí)驗(yàn)的氨基酸有鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸?！?〕苯丙氨酸脫氨實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸锞哂斜奖彼崦摪泵?，能將苯丙氨酸氧化脫氨?gòu)成苯丙酮酸。苯丙酮酸遇到三氯化鐵成藍(lán)綠色。本實(shí)驗(yàn)可用于多種微生物的鑒定?！?〕明膠液化實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸锬芊置诿髂z〔一種動物蛋白〕水解酶〔蛋白質(zhì)〕而水解明膠，使經(jīng)培育后的明膠培育基有原來的固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。3.呼吸酶類實(shí)驗(yàn)〔1〕硝酸鹽復(fù)原實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能把培育基中的硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸鹽或氨或氮等。當(dāng)參與格里斯試劑后，亞硝酸鹽與乙酸反響生成亞硝酸。亞硝酸與對氨基苯磺酸作用構(gòu)成偶氮苯磺酸，偶氮苯磺酸與α-萘胺結(jié)合構(gòu)成紅色的偶氮化合物N-α-荼氨偶氮苯黃酸，即為陽性反響。陰性反響的緣由有兩個：一是細(xì)菌不能復(fù)原硝酸鹽，那么培育后的培育液中仍有硝酸鹽的存在；二是細(xì)菌將亞硝酸鹽復(fù)原為氮或氨等物質(zhì)，那么培育基中沒有硝酸鹽的存在。

硝酸鹽復(fù)原實(shí)驗(yàn)操作步驟：接種硝酸鹽肉湯，35℃培育5天，參與0.2ml的試劑A,再參與0.2ml的試劑B,輕搖混合。呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色者闡明有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽復(fù)原陽性。假設(shè)無顏色變化，須參與少量鋅粉變紅者為陰性〔硝酸鹽未被復(fù)原〕不變?yōu)殛栃浴瞾喯跛猁}已分解成氨和氮〕〔2〕細(xì)胞色素氧化酶實(shí)驗(yàn)分子氧和細(xì)胞色素C，能氧化鹽酸二甲基對苯二胺，并和α-萘酚結(jié)合，生成吲哚酚藍(lán)〔靛酚藍(lán)〕，是藍(lán)色反響。〔3〕過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)過氧化氫酶又稱接觸酶，能將水分解而釋放氧氣，大多數(shù)好氧或兼性厭氧微生物能產(chǎn)生過氧化氫酶,普通厭氧微生物不產(chǎn)生此酶〔如乳酸細(xì)菌〕

觸酶實(shí)驗(yàn)左側(cè)陽性,右測為陰性對照4.有機(jī)酸鹽和氨鹽利用實(shí)驗(yàn)〔1〕檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)?zāi)承┪⑸铩伯a(chǎn)氣桿菌〕能利用氨鹽作為獨(dú)一氮源，同時利用檸檬酸鹽作為獨(dú)一碳源。他們可在檸檬酸鹽培育基上生長，并分解檸檬酸鈉而生成碳酸鈉，使培育基變?yōu)閴A性，培育基中的指示劑溴百里酚藍(lán)，由原來的草綠色變?yōu)樗{(lán)色?！?〕丙二酸鹽利用實(shí)驗(yàn)琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中一個重要環(huán)節(jié)。丙二酸與琥珀酸會競爭琥珀酸脫氫酶，在丙二酸濃度較高的情況下，琥珀酸脫氫酶不能被釋放出來催化琥珀酸脫氫反響，從而抑制了三羧酸循環(huán)反響進(jìn)展，微生物的生長也遭到了抑制，也有些微生物在丙二酸鈉培育基上可以生長，使培育基變?yōu)閴A性，溴百里酚藍(lán)，由原來的草綠色變?yōu)樗{(lán)色，闡明這些微生物可以利用丙二酸鹽。5.毒性酶實(shí)驗(yàn)〔1〕卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)有些微生物能產(chǎn)生卵磷脂酶，即X-毒素，在有鈣離子存在時，能迅速分解卵磷脂，生成脂肪和水溶性磷酸膽堿，當(dāng)這些微生物在卵黃胰胨培育液中生長時，可出現(xiàn)白色沉淀〔脂肪〕?！?〕血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)致病性葡萄球菌〔金黃葡萄球菌〕能產(chǎn)生血漿凝固酶，他們可直接作用于血漿中的纖維蛋白，也可作用于血漿凝固酶原，是之成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固，這是鑒定致病球菌的重要目的,能否是致病球菌主要看它能否產(chǎn)生凝固酶.有凝塊均勻混濁均勻混濁生理鹽水金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

〔3〕鏈激酶實(shí)驗(yàn)A型溶血鏈球菌能產(chǎn)生鏈激酶〔溶解纖維蛋白酶〕，該酶能激活人體血液中的血漿蛋白酶原，構(gòu)成血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。在檢驗(yàn)溶血鏈球菌時，常以他們能否能溶解凝固的人血漿來判別能否為A型溶血鏈球菌，融化的時間越短，表示該菌產(chǎn)生的鏈激酶越多。5.其他生化實(shí)驗(yàn)〔氰化鉀抗性實(shí)驗(yàn)〕氰化鉀是呼吸鏈末端的抑制劑，在含有氰化鉀的培育基中，有的微生物呼吸鏈末端遭到抑制，阻斷了生物氧化，故不能生長：有的微生物那么對氰化鉀有抗性，在含有氰化鉀的培育基中依然能生長。