01-蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)課件

第三章蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、兩性性質(zhì)及等電點二、膠體性質(zhì)三、變性與復(fù)性作用四、蛋白質(zhì)的沉淀作用五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離性質(zhì)，具有特定的等電點（pI）。溶液pH＝pI時，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等；

pH＞pI時，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷；

pH＜pI時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

等電點時特點：（1）凈電荷為零（2）一定離子強度的緩沖液：等離子點特征常數(shù)（3）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點偏酸（較低）

堿性AA/酸性AA等電點

胃蛋白酶0.21.0

血紅蛋白1.76.7

細(xì)胞色素C2.910.7

菊糖酶0.348.2（4）導(dǎo)電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的負(fù)電荷或正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，據(jù)此可互相分離。01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達(dá)1~100nm，處于膠體顆粒的范圍。（親水膠體）蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)：布朗運動、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。1、蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)2、穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個重要因素：水化膜

通過氫鍵與水結(jié)合表面電荷

在非等電點狀態(tài)下，雙電層，帶同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥。

01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)3.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用滲析（透析）超濾二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性與凝固作用

在某些物理或化學(xué)因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞（肽鍵不斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的改變，稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。

What’sdenaturationofprotein?01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)1、變性理論

蛋白質(zhì)的變性就是天然蛋白質(zhì)分子中肽鏈的高度規(guī)則的緊密排列方式因氫鍵及其他次級鍵的破壞而變成不規(guī)則的松散排列方式。2、引起蛋白質(zhì)變性的因素：①物理因素：高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波、機械攪拌②化學(xué)因素：強酸、強堿、有機溶劑、尿素、胍、重金屬鹽等。變性的因素及作用機制01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)①物理性質(zhì)：旋光性改變，溶解度下降，結(jié)晶能力下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學(xué)性質(zhì)：官能團反應(yīng)性增加，呈色反應(yīng)增強，易被蛋白酶水解。③生物學(xué)性質(zhì)：原有生物學(xué)活性喪失，抗原性改變。

變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)變性的可逆性－復(fù)性：某些蛋白質(zhì)變性后可以在一定的條件下重新形成原來的空間結(jié)構(gòu)，并恢復(fù)原來部分理化特性和生物學(xué)活性，這個過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）。蛋白質(zhì)變性的可逆性與復(fù)性

蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下不能復(fù)性；

如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象未被嚴(yán)重破壞；或蛋

白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu),并經(jīng)特殊處理則可以復(fù)性。01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)核糖核酸酶的變性與復(fù)性去除變性劑并緩慢氧化天然構(gòu)象尿素，

-巰基乙醇變性狀態(tài)01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)變性的可逆性與復(fù)性

可逆變性：

變性條件除去后仍可恢復(fù)天然狀態(tài)的變性。

不可逆變性：

變性條件除去后不能恢復(fù)天然狀態(tài)的變性。01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用

理論上：

研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能,分子量測定,亞單位拆分；

生產(chǎn)生活中有利的一面：

食品加工，消毒滅菌等；

非蛋白生物物質(zhì)提取純化，終止酶促反應(yīng)；

生產(chǎn)生活中不利的一面：

活性蛋白制品（酶、抗體）的分離提取和保存；01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)外加一些因素去除蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素后，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀（precipitation）。1.What’sprecipitationofprotein?變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì)。四、蛋白質(zhì)的沉淀作用01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)2.沉淀種類：可逆與不可逆四、蛋白質(zhì)的沉淀作用3.沉淀方法：

沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法

沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)2.沉淀種類：可逆與不可逆四、蛋白質(zhì)的沉淀作用3.沉淀方法：

沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法（1）鹽析－中性鹽沉淀法（2）有機溶劑沉淀法（3）酸沉淀法01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（1）鹽析—中性鹽沉淀

鹽溶作用

鹽析作用What’ssaltprecipitationofprotein?

蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（1）鹽析—中性鹽沉淀定義：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析（saltprecipitation）。作用機制:

中和電荷的同時破壞水化膜;What’ssaltprecipitationofprotein?

蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)常用的中性鹽：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。鹽析時，pH在蛋白質(zhì)的等電點處效果最好。鹽析沉淀蛋白質(zhì)通常不會引起蛋白質(zhì)的變性。優(yōu)點鹽析應(yīng)用舉例（1）鹽析—中性鹽沉淀

蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

分段鹽析：

半飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較大的血漿球蛋白,而飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較小的血漿清蛋白。因此,使用不同濃度的硫酸銨溶液就可將分子量不同的蛋白質(zhì)進行初步分離。（1）鹽析—中性鹽沉淀01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)凡能與水以任意比例混合的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質(zhì)。沉淀原理：①脫水作用——破壞水化膜；②使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。（2）有機溶劑沉淀法

蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

處理條件：①低溫操作；②沉淀完全后盡快分離；（2）有機溶劑沉淀法

蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法

機制：破壞電荷，等電點沉淀。（3）酸沉淀法01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（1）重金屬鹽沉淀法（2）生物堿試劑沉淀法（除蛋白作用）（3）熱凝固沉淀法（4）抗體對抗原蛋白質(zhì)的沉淀3.沉淀方法：

沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法

沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法四、蛋白質(zhì)的沉淀作用01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)2.茚三酮反應(yīng)3.考馬斯亮藍(lán)G2504.福林酚試劑反應(yīng)5.黃色反應(yīng)--芳香族氨基酸的特有反應(yīng)6.米倫氏反應(yīng)—酪氨酸的特有反應(yīng)7.乙醛酸反應(yīng)—色氨酸的特有反應(yīng)8.坂口反應(yīng)—精氨酸特有的反應(yīng)01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)

兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色復(fù)合物含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣反應(yīng)肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深，粉紅，紫紅，藍(lán)紫受蛋白質(zhì)特異性影響小蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)2.茚三酮反應(yīng)

靈敏度差。3.考馬斯亮藍(lán)G-250本身為棕色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色與蛋白的親和力強，靈敏度高11000微克/毫升01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)4.福林酚試劑反應(yīng)酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)）福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸與雙縮脲法結(jié)合Lowry法在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物靈敏度提高100倍01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)5.黃色反應(yīng)--芳香族氨基酸的特有反應(yīng)濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)生成黃色化合物指甲、皮膚、毛發(fā)6.米倫氏反應(yīng)—酪氨酸的特有反應(yīng)酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)）米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)7.乙醛酸反應(yīng)—色氨酸的特有反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸明膠中不含色氨酸01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)8.坂口反應(yīng)—精氨酸特有的反應(yīng)精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)）精氨酸與α-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸定量測定精氨酸01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm

附近顯示強的吸收?？梢詫Φ鞍踪|(zhì)進行定性和定量檢測。蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）

=1.45A280—0.74A26001_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的分離純化01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、分離純化的基本方法1、鹽析與等電點沉淀根據(jù)溶解度不同分離2、層析法離子交換層析法根據(jù)電荷不同分離凝膠過濾法根據(jù)分子量、分子形狀不同分離親和層析根據(jù)特異性親和力不同分離3、梯度離心法01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)2、層析層析（chromatography）是一種利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離分析的技術(shù)方法。What’schromatography?01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)主要的層析技術(shù)有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等。01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)離子交換層析分離蛋白質(zhì)01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)凝膠過濾分離蛋白質(zhì)01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)3、超速離心：利用物質(zhì)密度的不同，經(jīng)超速離心后，分布于不同的液層而分離。超速離心也可用來測定蛋白質(zhì)的分子量，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比。01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)二、蛋白質(zhì)含量的測定1、凱氏定氮法2、雙縮脲法3、福林酚試劑法4、紫外吸收法三、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定1、化學(xué)測定法2、超離心沉降速度法3、凝膠過濾法4、SDS01_蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）

。電泳：

What’selectrophoresis?一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點