發(fā)酵工程在功能性食品中的應用

發(fā)酵工程在功能性食品中的運用江學文1功能性食品功能性食品是指強調(diào)其成分對人體能充分顯示機體防御功能的工業(yè)化食品，是新時代對傳統(tǒng)食品的深層次要求。開發(fā)功能性食品的最終目的，就是要最大限制地滿足人類本身的安康需求。開發(fā)功能性食品，要對其“平安性〞和“功能性〞進展科學評價，這就需求明確其中起關鍵作用的、真正具有生理作用的效果成分，或稱活性成分，功能因子。1.1效果成分顯然，效果成分是消費功能性食品的關鍵。就目前而言，業(yè)已確認的效果成分，主要包括以下8類：⑴功能性碳水化合物：如真菌多糖、功能性低聚糖、功能性單雙糖。⑵功能性脂類：如ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸、磷脂等。⑶氨基酸、肽與蛋白質(zhì)：如?；撬?、酪蛋白磷肽、降壓肽、免疫球蛋白、酶蛋白等。⑷維生素和維生素類似物：包括水溶性維生素、油溶性維生素、生物類黃酮等。⑸礦物元素：包括常量、微量元素等。⑹植物活性成分：如皂苷、生物堿、萜類化合物、有機硫化物等。⑺益生菌：主要是乳酸菌類，尤其是雙歧桿菌。⑻低能量食品成分：包括蔗糖替代品、脂肪替代品等。功能性食品的出現(xiàn)，標志著作為食品中的關鍵組分，開場從重點要求大量的傳統(tǒng)營養(yǎng)素，轉(zhuǎn)向重點要求微量的效果成分。1.2高新技術由于效果成分普遍具有“微量〞、“高效〞和“不穩(wěn)定〞的特點，運用傳統(tǒng)的工程技術，已不能順應微量成分的制造，不能開發(fā)出高科技的功能性食品?，F(xiàn)代食品工程高新技術的出現(xiàn)，將有力地促進這個問題的圓滿處理。高新技術在功能性食品消費中所占的比重不斷增大，特別是生物技術的運用得以長足的開展，尤其是用在功能性食品配料〔即效果成分〕的消費上，有力地推進了食品工業(yè)革命性的變化。就目前而言，生物技術已在功能性食品消費上得到有效運用，上述的8類效果成分中，除植物活性成分普通采用提取分別法外，其他的均可用生物技術來高效消費。生物技術，是運用自然科學及工程學原理，依托微生物動物植物細胞及其產(chǎn)生的活性物質(zhì)，作為某種化學反響的執(zhí)行者，將原料進展加工成某種產(chǎn)品來為社會效力的技術。生物技術包括基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程，其中基因工程、細胞工程和酶工程在功能性食品產(chǎn)業(yè)的運用已有相關專著和文獻報導，可做參考。以下主要就發(fā)酵工程在功能性食品的某些運用作一概述，并簡單回想一下發(fā)酵技術的開展歷史。2.發(fā)酵工程與功能性食品產(chǎn)業(yè)2.1發(fā)酵技術的沿革2.1.1傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵技術－天然發(fā)酵主要產(chǎn)品有酒、醋、醬油、泡菜、干酪等，特點是發(fā)酵過程很難人為控制，消費只能憑閱歷，口傳心授。2.2.2第一代微生物發(fā)酵技術－純培育技術的建立德國人柯赫首先建立了微生物的純培育技術，開創(chuàng)了人為控制發(fā)酵過程的時期，加上簡單密封式發(fā)酵罐的發(fā)明，發(fā)酵管理技術的改良，發(fā)酵工業(yè)進入了近代化學工業(yè)的行列。這時期產(chǎn)品有酒精、丙酮、丁醇、有機酸、酶制劑等，主要是一些厭氧發(fā)酵和外表固體發(fā)酵產(chǎn)生的初級代謝產(chǎn)物。2.2.3第二代〔近代〕微生物發(fā)酵技術－深層培育技術可分為兩個時期，前一時期抗生素工業(yè)的開展，以青霉素的消費為代表，構成規(guī)?；M，同時采用了深層培育技術，即機械攪拌通氣技術，從而推進了抗生素工業(yè)乃至整個發(fā)酵工業(yè)的快速開展。這時期的產(chǎn)品主要是好氧發(fā)酵的次級代謝產(chǎn)物。后一時期是20世紀50年代氨基酸發(fā)酵工業(yè)，在引進了“代謝控制發(fā)酵技術〞后，得以快速開展，即將微生物經(jīng)過人工誘變，獲得代謝發(fā)生改動的突變株，在控制條件下，選擇性地大量消費某種人們所需求的產(chǎn)品。這項技術也被用于核苷酸、有機酸和抗生素的消費中。這個時期是近代發(fā)酵工業(yè)的鼎盛時代。新產(chǎn)品、新技術、新工藝、新設備不斷出現(xiàn)，運用范圍也日益擴展，如能源開發(fā)、環(huán)境維護等。2..2.4第三代微生物發(fā)酵技術－發(fā)酵工程又稱微生物工程，以基因工程、細胞工程、蛋白質(zhì)工程等現(xiàn)代生物技術為支撐，利用微生物的生長和代謝活動，經(jīng)過現(xiàn)代化工程技術手段進展工業(yè)規(guī)模消費的技術，是微生物〔菌種〕、發(fā)酵工藝和發(fā)酵設備的協(xié)調(diào)，根據(jù)發(fā)酵目的對微生物的采集、分別和選育提出要求，對發(fā)酵工藝進展設計和優(yōu)化，對發(fā)酵設備提出改良和配套選型的工程技術。它的主要內(nèi)容包括：工業(yè)消費菌種的選育，最正確發(fā)酵條件的選擇和控制，生化反響器的設計以及產(chǎn)品的分別提取和精制等過程。在功能性食品領域，發(fā)酵工程在消費多元糖醇、大型真菌菌絲體、微藻、維生素和維生素類似物、多不飽和脂肪酸、功能性乳制品等方面都已到實踐運用，并已產(chǎn)生明顯的經(jīng)濟效益和深遠的社會效益。2.2木糖醇的發(fā)酵法消費木糖醇為多元糖醇，溶于水會吸熱，其吸熱值在糖醇類甜味劑中最大，因此食用時會產(chǎn)生涼爽的口感，在體內(nèi)代謝不需求胰島素參與，能防齲齒，也可作為非腸道營養(yǎng)的能量來源。木糖醇的消費方法有三種：提取、化學合成、生物合成。目前，工業(yè)消費主要采用化學合成法：半纖維素加酸催化水解，得到含木糖的水解液，經(jīng)純化脫色，在一定條件下經(jīng)過戊糖加氫反響消費木糖醇，轉(zhuǎn)化率50～60％。生物合成法是利用微生物中的復原酶，以木糖為底物來消費木糖醇，可有效降低木糖醇的消費本錢：不僅省去木糖純化步驟，而且簡化木糖醇的分別步驟，是一種很有出路的消費方法。2.2.1原料：主要運用植物半纖維素的水解產(chǎn)物，半纖維素的主要成分是木聚糖，在無機酸作用下水解成木糖，可作為基質(zhì)。2.2.2菌種：以木糖為基質(zhì)消費木糖醇，主要思索2種酶：一是木糖復原酶〔以NADPH或NADH為輔酶〕，一是木糖醇脫氫酶〔以NAD+或NADP+為輔酶〕。選擇木糖醇消費菌種的原那么：高木糖復原酶活性或低木糖醇脫氫酶活性。根據(jù)該原那么，選擇了膜醭假絲酵母，木糖代謝途徑：木糖NADPHNADP+木糖醇NAD+NADH木酮糖5－磷酸木酮糖單磷酸己糖途徑2.2.3影響要素2.2.3.1通氣率通氣培育能提高木糖向木糖醇的轉(zhuǎn)化量，由于木糖醇的消費直接同生物量的添加相聯(lián)絡。并且受氧氣耗費量的影響極大。要有效消費木糖醇，首先思索的是微生物細胞在培育基中快速積累，這可經(jīng)過在介質(zhì)中溶解氧來處理，但木糖醇的消費需求缺氧條件，在整個培育過程中介質(zhì)維持高程度的溶解氧會導致木糖醇氧化成木酮糖。因此，應在培育早期維持高程度的溶解氧，然后在產(chǎn)木糖醇的時期降低微生物的呼吸率。2.2.3.2木糖含量培育基中的木糖含量會顯著影響木糖醇的產(chǎn)量。普通來講，在批量處置中，假設微生物可以耐受高含量的糖分和高浸透壓，初始糖含量的添加能提高消費速率和轉(zhuǎn)化率。根據(jù)實驗初始木糖含量在80g～120g／L比較適宜。2.2.3.3氮源氮源和通氣率都是非常重要，經(jīng)過比較8種無機氮源和4種有機氮源，發(fā)現(xiàn)銨鹽是最好的無機氮源，酵母提取物是最好的有機氮源。運用這兩種氮源時，木糖醇轉(zhuǎn)化率分別為16.7g／L和30.6g／L。2.2.3.4培育基中的其它糖類往基質(zhì)中參與葡萄糖，會對酵母發(fā)酵木糖生成木糖醇產(chǎn)生反作用，葡萄糖對木糖耗費的禁阻效應，只需很短時間就就能到達最大值，一旦葡萄糖含量降低到一定值時，對木糖的轉(zhuǎn)化很快又重新開場。這闡明其調(diào)理機制并不是代謝產(chǎn)物阻遏〔阻遏酶合成〕，而是反響抑制〔抑制酶活性〕。當葡萄糖含量低于5g／L時，木糖醇的產(chǎn)量不會降低，由于此時葡萄糖進展的是有氧代謝，不會產(chǎn)生乙醇。而當葡萄糖含量超越5g／L時，多于部分會經(jīng)過無氧代謝生成乙醇，此反響和木糖復原生成木糖醇同為復原反響，相互之間競爭氧化復原勢，導致木糖醇產(chǎn)量降低。2.2.3.5pH和溫度假絲酵母菌株最適pH4～6，最適溫度范圍28～30℃。2.2大型真菌的發(fā)酵法消費許多大型真菌含有多種活性物質(zhì)，如多糖、多肽、生物堿、萜類化合物、甾醇、苷類、酚類、酶、維生素、植物激素等。具有提高免疫力、抗腫瘤、抗炎和抗?jié)兊刃Ч?。大型真菌的深層發(fā)酵是在抗菌素發(fā)酵技術的根底上開展起來的，與傳統(tǒng)栽培真菌子實體的方法不同。它是在大型發(fā)酵罐內(nèi)進展，經(jīng)過調(diào)整培育基組成和發(fā)酵工藝，在短時間內(nèi)得到大量的真菌菌絲體。分析闡明，這樣得到的真菌菌絲體與傳統(tǒng)栽培真菌子實體，在化學組成和生理功能上均很類似。用發(fā)酵菌絲體中的真菌多糖、真菌蛋白及其他活性物質(zhì)，來調(diào)制消費功能性食品，這類食品具有加強機體免疫力和明顯的抗腫瘤活性，很有開展出路。這種方法的最大優(yōu)點是，易于實現(xiàn)工業(yè)化消費，規(guī)模大、產(chǎn)量高、周期短、效益高。缺陷是，一次性投資大，部分菌絲體缺乏子實體特有的風味。經(jīng)研討以為適宜于深層發(fā)酵的食用或藥用大型真菌多達80余種，但真正實現(xiàn)工業(yè)化消費的尚不太多。發(fā)酵法消費真菌的主要工藝是：母種搖瓶培育種子罐發(fā)酵罐深層發(fā)酵。2..2.1靈芝的發(fā)酵法消費2.2.1.1工藝斜面母種〔26～28℃，5d〕一級搖瓶培育〔500ml，24～26℃，200r／min，2～3d〕二級搖瓶培育〔500ml,26～28℃,90r／min,2d)種子罐培育〔40L，26～28℃,，200r／min,1:0.3～0.5VVm,接種量5%,4d〕發(fā)酵罐培育〔200L，26～28℃，200r/min，1:0.5VVm，6～7d〕放罐2.2.1.2培育基組成〔略〕2.2.1.3培育條件⑴溫度靈芝深層培育適宜溫度為27～30℃，低于27℃菌絲生長緩慢，高于30℃菌絲易老化，36～38℃菌絲停頓生長。溫度能影響多糖的產(chǎn)量。在發(fā)酵過程中，前期0～30h以稍高的溫度促進菌絲迅速生長，在30～150h以稍低的溫度盡能夠延伸有效物質(zhì)的生成期，150h后，溫度稍提高，以促進有效物質(zhì)的分泌。⑵通氣通氣的目的是保證最好的溶氧性，以提供靈芝菌絲體生長所需的氧，此外還可除去二氧化碳和代謝產(chǎn)物。深層培育供氧情況對菌體的生長和有效物質(zhì)的積累意義艱苦，特別是發(fā)酵初期12～16h，由于菌絲量顯著添加，菌絲耗氧率到達頂峰，對溶解氧極為敏感，需特別留意供氧情況，否那么引起異常發(fā)酵，出現(xiàn)菌絲自溶或原生質(zhì)凝集，導致明顯的代謝變化、產(chǎn)量下降甚至發(fā)酵失敗。⑶攪拌由于氧難溶于水，為加大其溶解度，必需進展攪拌，轉(zhuǎn)速100～200r/min，過快會把菌絲打得很碎，對菌體生長不利。還應根據(jù)培育基得性質(zhì)，決議攪拌器方式，攪拌流型等問題，靈芝菌絲體深層培育基粘度大液面高，常采用兩檔或三檔攪拌器，大型發(fā)酵罐多至四檔。目前國內(nèi)外已開展瘦長型無機械攪拌發(fā)酵罐〔H:D=12～16〕,罐身高，空氣量大，氧利用率高。由于無機械攪拌，罐體易堅持嚴密，染菌率低，普通在0.2%以下。⑷消泡靈芝深層培育基中含有蛋白質(zhì)類物質(zhì)，在通氣和攪拌下易構成泡沫，導致培育液上升，呵斥大量的逃液，添加染菌時機。同時由于泡沫過多，還會影響通氣和攪拌的正常進展。泡沫產(chǎn)生的主要緣由有兩點：一是通氣攪拌程度；二是培育基的原料性質(zhì)。消除泡沫的方法有機械消泡和消泡劑消泡兩種，普通采用后一種。靈芝深層培育的消泡劑為植物油，用量0.03%。⑸pH靈芝深層培育要求一定的pH范圍，最適生長的pH5.0～6.0，發(fā)酵初期pH4.0～5.4，到了發(fā)酵中期菌絲體生長旺盛，菌體干物質(zhì)和有效成分積累，pH急劇下降到2.5～3.5之間，進入發(fā)酵后期菌絲生長緩慢，出現(xiàn)菌體自溶，pH上升。發(fā)酵過程中pH的變化也與培育基組成有親密的關系，如采用玉米粉－蔗糖－酵母粉培育基，到發(fā)酵中后期pH會急劇下降，而采用花生餅粉－蔗糖培育基pH變化不大。在發(fā)酵中遇到急劇下降或上升，普通參與酸或堿調(diào)理，參與磷酸鹽作緩沖。⑹菌齡與接種量靈芝深層培育菌種的菌齡普通為48h左右,接種量5％～10％，接種量少了會延伸發(fā)酵周期，接種量太多菌絲老化快，降低有效物質(zhì)的積累，也給后處置帶來困難。2.3維生素C的發(fā)酵法消費維生素C，又名L－抗壞血酸，為人體所必需的維生素，并作為許多具有重要生理功能的金屬酶的輔助因子，參與膠原蛋白的羥基化、肉堿生物合成、多巴胺羥基化等多種代謝活動。同時維生素C還是一種重要的自在基去除劑，可去除超氧陰離子〔O2–·〕、羥自在基〔OH·〕和烷過氧基〔ROO·〕等，這些自在基被以為與癌癥、心血管疾病等親密相關。維生素C廣泛用于食品、功能性食品、藥品和化裝品中，目前世界總產(chǎn)量每年近80000t，總值超越6億美圓，市場前景寬廣。2.3.1萊氏法工藝不斷為消費維生素C的普遍方法，其根本原理是：D－葡萄糖H2/NiD－山梨醇弱氧化醋酸桿菌L－山梨糖丙酮/H2SO4雙丙酮－L－山梨糖高錳酸鉀雙丙酮－L－古洛酸水解2－酮基－L－古洛酸內(nèi)酯化、烯醇化L－抗壞血酸2.3.2兩次發(fā)酵工藝由于萊氏工藝道路繁雜冗長，輔助原料耗費量大，自20世紀60年代開場研討重點集中于微生物發(fā)酵，希望能將D－山梨醇或L－山梨糖直接轉(zhuǎn)化為2－酮基－L－古洛酸。我國從1969年開場在微生物發(fā)酵－化學合成法的根底上進展維生素C的兩次發(fā)酵工藝的研討，在1974年獲得很大勝利，挑選得到以氧化葡萄糖酸桿菌為主要產(chǎn)酸菌，以條紋假單胞菌為伴生菌的自然共生菌絲，兩者共生發(fā)酵時，能L－山梨糖直接轉(zhuǎn)化為2－酮基－L－古洛酸，省去了萊氏法中的丙酮維護步驟，防止了丙酮、酸、堿或苯等有機溶劑的大量運用，其工藝簡單，可節(jié)省大量化工原料，平安衛(wèi)生，三廢和污染較小，已為國內(nèi)大部分廠家采用。2.3.3消費菌種將D－山梨醇轉(zhuǎn)化為L－山梨糖的微生物除弱氧化醋酸桿菌，還可用生黑醋酸桿菌。將L－山梨糖轉(zhuǎn)化為2－酮基－L－古洛酸所用的主要產(chǎn)酸菌是氧化葡萄糖酸桿菌，除與條紋假單胞菌共生發(fā)酵外，還可與熒光假單胞菌、雙黃假單胞桿菌和綠葉假單胞菌等共生發(fā)酵。2.3.4發(fā)酵工藝消費時可直接用葡萄糖或淀粉水解液為原料，經(jīng)復原葡萄糖成山梨醇。反響終了后，過濾除去催化劑，離子交換除去離子雜質(zhì)，活性炭脫色，濃縮得到符合要求的山梨醇溶液、將山梨醇溶液泵入內(nèi)循環(huán)氣升式發(fā)酵罐中。加水調(diào)理山梨醇含量至10％～35％，通常在發(fā)酵初期濃度較低，待菌體繁衍至對數(shù)期再提高含量。接種弱氧化醋酸桿菌進展發(fā)酵，調(diào)pH6.2～6.8，溫度28～30℃，罐內(nèi)壓力0.02～0.1MPa，通氣量0.6～1vvm，罐內(nèi)裝填率70％～80％。經(jīng)14～30h發(fā)酵終了，山梨醇得率可達96.5%，培育基組成〔略〕。第一次發(fā)酵終了后，將發(fā)酵醪升溫至80℃堅持10min滅菌，補充所需原輔料，調(diào)pH6.7～7.0，接種氧化葡萄糖酸桿菌和條紋假單胞菌，在30℃溫度下進展共生發(fā)酵。為保證產(chǎn)酸的正常進展應定期補充堿維持pH7.0。經(jīng)20～36h，將山梨糖耗盡，發(fā)酵到達終點。發(fā)酵終了后，過濾或離心除去菌體蛋白，發(fā)酵液經(jīng)靜置、廓清、離子交換、濃縮、枯燥后可得2－酮基－L－古洛糖酸晶體，再經(jīng)后續(xù)的化學合成階段得到終產(chǎn)品維生素C，總得率為44.5%～46.7%。共生發(fā)酵種子和發(fā)酵罐培育基〔略〕2..3.5發(fā)酵法消費維生素C的研討進展⑴2－酮基－L－古洛糖酸轉(zhuǎn)化率的提高L－山梨糖生物氧化成2－酮基－L－古洛糖酸是由細胞膜界面或細胞內(nèi)的山梨糖酮脫氫酶所催化，生成L－山梨糖酮中間體，進入細胞質(zhì)，然后經(jīng)胞內(nèi)脫氫酶進一步作用，在細胞質(zhì)山梨糖酮復原酶和山梨糖復原酶作用下生成木酮糖，進入磷酸戊糖途徑，生成6－磷酸葡萄糖，進入糖醛酸途徑，生成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸〔UDP葡萄糖醛酸〕，再經(jīng)糖醛酸復原酶催化，以NADPH為氫供體復原成L－古洛糖酸，然后由內(nèi)酯酶催化脫水構成L－古洛糖酸內(nèi)酯，最后由L－古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶氧化成抗壞血酸。靈長目動物和人由于缺乏L－古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶，故不能合成抗壞血酸，而大多數(shù)動植物都具有這一途徑。在這一途徑中，UDP-葡萄糖醛酸在差向異構酶催化下，C5上的基團差向異構，生成UDP-艾杜糖醛酸。國外有研討將李氏醋桿菌細胞膜界面上的山梨糖酮脫氫酶基因，在含細胞質(zhì)山梨糖酮脫氫酶的氧化葡萄糖酸桿菌中表達，使L－山梨糖氧化為2－酮基－L－古洛糖酸的轉(zhuǎn)化率提高35％。在發(fā)酵過程中，由于UDP-艾杜糖醛酸的生成，導致2－酮基－L－古洛糖酸的產(chǎn)量下降。經(jīng)過化學誘變，可使UDP-艾杜糖醛酸的合成數(shù)量大幅度減少，從而提高2－酮基－L－古洛糖酸的得率。另外，也有人提出經(jīng)過2,5–二酮基–D–葡萄糖酸途徑，來合成2－酮基－L－古洛糖酸。先由歐文氏菌突變株將D－葡萄糖轉(zhuǎn)化為2,5–二酮基–D–葡萄糖酸，然后將整個培育基經(jīng)十二烷基硫酸鈉處置以降低細胞活力，再參與葡萄糖，最后經(jīng)棒狀桿菌變異菌株作用生成2－酮基－L－古洛糖酸。在整個消費過程中，葡萄糖轉(zhuǎn)化率最高可達85％，2－酮基－L－古洛糖酸的最終含量為10.5g/L。⑵由2－酮基－L－古洛糖酸生物轉(zhuǎn)化為L－抗壞血