DB2312T 088-2023禽用油乳劑滅活疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢驗(yàn)技術(shù)操作規(guī)程

CCSB41DB2312綏化市市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB2312/T088—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由綏化市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局歸口。本文件起草單位：黑龍江省百洲生物工程有限公司、明水縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)。本文件主要起草人：張?jiān)?、張洪楠、李山峰、汪洋、王海楠、王東升。DB2312/T088—2023本文件規(guī)定了禽用油乳劑滅活疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢驗(yàn)方法，本法為凝膠法是利用鱟試劑檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素的方法。本文件適用于獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)以及經(jīng)營企業(yè)對禽用油乳劑滅活疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素含量范圍的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件?！吨腥A人民共和國獸藥典》（2020版）一部附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”。3術(shù)語和定義《中華人民共和國獸藥典》（2020版）一部附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”界定的術(shù)語和定義適用于本文件。4主要技術(shù)內(nèi)容4.1被檢疫苗處理隨機(jī)抽取油乳劑滅活疫苗1瓶，置-20℃以下條件下冷凍24h～48h，待其完全凍結(jié)后，將其取出置室溫條件下融化24h～48h，如此反復(fù)凍融3次～4次，使被檢疫苗破乳分層，取適量疫苗3500r/min離心15min后，用無熱源吸管吸取下層液體作為供試品溶液。4.2供試品溶液稀釋用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素小于0.015EU/ml的無菌水）將供試品溶液做一系列稀釋，稀釋10倍、100倍、500倍、1000倍等不同系列，通過對供試品不同稀釋倍數(shù)下的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，用相應(yīng)稀釋倍數(shù)乘以鱟試劑靈敏度λ,計(jì)算供試品中所含細(xì)菌內(nèi)毒素的范圍。4.2.1鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或?qū)嶒?yàn)條件發(fā)生了任何可改變實(shí)驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》現(xiàn)行版一部附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)，確定鱟試劑的靈敏度與標(biāo)示值相符。4.2.2供試品干擾試驗(yàn)供試品初次進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)之前，需根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》現(xiàn)行版一部附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”先進(jìn)行干擾試驗(yàn)，以檢測供試品對內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)是否有干擾或抑制作用，供試品如對實(shí)驗(yàn)有干擾，可通過對供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排除干擾。4.3檢測步驟DB2312/T088—20234.3.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備4.3.1.1主要儀器超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、旋渦混合儀、離心機(jī)、移液槍、無熱源槍頭（或去熱源的刻度吸管）、耐高溫玻璃試管（外徑10×75mm，250℃干烤1h）。4.3.1.2試劑鱟試劑（0.1ml/支）、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（10EU/支）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素小于4.3.2操作步驟按照《中華人民共和國獸藥典》現(xiàn)行版一部附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行檢驗(yàn),制備供試品溶液、供試品陽性對照、陽性對照和陰性對照。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。取0.1ml/支的鱟試劑原安瓿若干支，其中：①供試品溶液管：每個(gè)待測濃度系列各取2支，各加入0.1ml供試液；②供試品陽性對照管：根據(jù)供試品的不同目標(biāo)稀釋倍數(shù)，每個(gè)目標(biāo)稀釋倍數(shù)下選取2支，每個(gè)待測稀釋倍數(shù)下各加入0.1ml濃度為λ的內(nèi)毒素供試液溶液（分別用相對應(yīng)的待測稀釋倍數(shù)下的供試品溶液稀釋內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，使其溶度為λ);③陽性對照管：2支，各加入0.1ml濃度為λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（用內(nèi)毒素檢查用水稀釋內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，使其溶度為λ);④陰性對照管：2支，各加入0.1ml內(nèi)毒素檢查用水。將各瓶中溶液輕輕混勻后，封閉瓶口，垂直放入37℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中，孵育60min±2min。將安瓿從恒溫培養(yǎng)箱中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°。若管內(nèi)形成凝膠并且凝膠不變形、不從管壁脫落者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁脫落者為陰性。記錄結(jié)果。4.4結(jié)果判定若陰性對照管均為陰性，陽性對照管均為陽性，供試品陽性對照管均為陽性，判定試驗(yàn)有效。若供試品管均為陰性，判定供試品內(nèi)毒素含量小于測定值。若供試品管均為陽性，則判定供試品內(nèi)毒素含量大于測定值。若供試品出現(xiàn)陽性管和陰性管，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)供試品管需做4支平行管，所有平行管需均為陰性或者均為陽性，則實(shí)驗(yàn)成立