新型AMPA受體調(diào)節(jié)劑抗呼吸抑制作用及機(jī)制研究

新型AMPA受體調(diào)節(jié)劑抗呼吸抑制作用及機(jī)制研究鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和麻醉類(lèi)藥物（如嗎啡、芬太尼、丙泊酚等）是臨床常用藥物,廣泛用于急慢性疼痛治療、輔助誘導(dǎo)麻醉和靜脈復(fù)合麻醉等。該類(lèi)藥物發(fā)揮效應(yīng)時(shí)均不可避免的產(chǎn)生呼吸抑制而成為致死的重要原因。目前用于急救鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和麻醉類(lèi)藥物所致呼吸抑制的首選治療藥是相應(yīng)靶點(diǎn)的拮抗劑（如納洛酮、氟馬西尼等）。但拮抗時(shí)普遍存在給藥方式單一、持續(xù)時(shí)間短、劑量不可控、需長(zhǎng)時(shí)間密切觀察等缺點(diǎn),更重要的是拮抗劑是靶向治療藥物,在未明確致呼吸抑制藥（毒）物類(lèi)型時(shí),無(wú)法第一時(shí)間選擇相應(yīng)拮抗劑進(jìn)行治療,從而錯(cuò)過(guò)急救時(shí)機(jī)。呼吸興奮劑（尼可剎米、洛貝林等）是非特異性抗呼吸抑制劑,但該類(lèi)藥物存在安全范圍窄、作用時(shí)間短、不良反應(yīng)多等弊端。因此,研制呼吸抑制的非特異性對(duì)癥治療藥物對(duì)鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和麻醉類(lèi)藥物的安全使用,提升臨床急救能力具有重要意義。近幾年眾多文獻(xiàn)報(bào)道調(diào)節(jié)AMPA受體可調(diào)控呼吸功能,AMPA受體在延髓呼吸中樞的前包欽格復(fù)合體廣泛分布,對(duì)呼吸節(jié)律的形成和呼吸沖動(dòng)的傳導(dǎo)發(fā)揮著關(guān)鍵作用;且已證實(shí)以Ampakine為代表的AMPA受體調(diào)節(jié)劑可以對(duì)抗多種藥（毒）物所致的呼吸抑制。AMPA受體調(diào)節(jié)劑潛在的鎮(zhèn)痛效應(yīng),改善學(xué)習(xí)記憶,神經(jīng)保護(hù)等作用可以使救治預(yù)后更好,因此AMPA受體調(diào)節(jié)劑有望成為非特異性抗呼吸抑制藥物,其廣譜作用特性與拮抗劑或呼吸興奮劑相比具有顯著優(yōu)勢(shì)?；诖?本所藥物化學(xué)研究室合成了一系列全新結(jié)構(gòu)AMPA受體正向調(diào)節(jié)劑,本室經(jīng)過(guò)抗呼吸抑制藥效學(xué)篩選,已初步證實(shí)LCX001具有抗呼吸抑制作用和鎮(zhèn)痛效應(yīng)。為了進(jìn)一步明確LCX001抗呼吸抑制作用是否具有廣譜性,本研究采用阿片類(lèi)、中樞抑制劑和麻醉藥致呼吸抑制的動(dòng)物模型,采用整體動(dòng)物肺功能檢測(cè)方法觀察LCX001抗呼吸抑制作用的廣譜性和非特異性作用特點(diǎn)。其次,為了解決LCX001水溶性較差及血腦屏障透過(guò)率低的問(wèn)題,基于LCX001化學(xué)結(jié)構(gòu),進(jìn)行腦靶向前藥化改造以提升血腦屏障透過(guò)率和中樞分布,并對(duì)所得化合物進(jìn)行了初步的抗呼吸抑制效應(yīng)的篩選和藥效評(píng)價(jià),以期獲得更為強(qiáng)效和安全的AMPA受體正向調(diào)節(jié)劑。最后,鑒于AMPA受體的膜定位程度和通道開(kāi)放狀態(tài)決定了AMPA受體的功能強(qiáng)弱,而這兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程都受到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控,我們利用電生理和細(xì)胞成像等技術(shù)測(cè)定了LCX001對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白stargazin表達(dá)的影響,觀察其導(dǎo)致AMPA受體（不同亞基）的膜定位程度的變化,并進(jìn)一步考察該變化對(duì)AMPA通道的開(kāi)放狀態(tài)產(chǎn)生的影響,最終導(dǎo)致的神經(jīng)元Ca²⁺內(nèi)流和細(xì)胞整體功能的變化來(lái)解釋LCX001正向調(diào)節(jié)AMPA受體功能的作用特點(diǎn)和抗呼吸抑制的作用機(jī)制。研究目的:確證新型化合物L(fēng)CX001抗呼吸抑制的作用特點(diǎn)和正向調(diào)節(jié)作用機(jī)制。研究方法:1.LCX001抗呼吸抑制廣譜性評(píng)價(jià):采用清醒無(wú)創(chuàng)全身體積描記法記錄LCX001對(duì)阿片類(lèi)（芬太尼、TH-030418）、丙泊酚和戊巴比妥等致呼吸抑制大鼠肺功能參數(shù)（呼吸頻率、通氣量）的影響。2.LCX001腦靶向前藥抗呼吸抑制藥效篩選和評(píng)價(jià):選擇強(qiáng)效阿片激動(dòng)劑TH-030418建立小鼠急性致死模型,篩選出可顯著提高小鼠存活率的LCX001腦靶向前藥化合物,通過(guò)考察候選化合物對(duì)阿片致模型小鼠急性毒性LD₅₀劑量的影響、對(duì)改善模型大鼠呼吸抑制效應(yīng)的時(shí)效量效研究、對(duì)動(dòng)脈血氧飽和度、二氧化碳分壓、pH的影響等方法綜合評(píng)價(jià)候選化合物改善呼吸抑制的效應(yīng),并與LCX001進(jìn)行比較研究。3.LCX001對(duì)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)和突觸定位的作用:3.1蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)考察LCX001處理對(duì)AMPA轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白stargazin蛋白表達(dá)的影響。3.2用細(xì)胞免疫熒光直接觀察和活細(xì)胞成像技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察LCX001引發(fā)pH敏感性熒光蛋白標(biāo)記的AMPA受體在細(xì)胞膜表面分布定位的變化,考察LCX001上調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白stargazin對(duì)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)定位的影響;4.LCX001對(duì)AMPA離子通道開(kāi)放特性和細(xì)胞興奮性的作用:采用膜片鉗全細(xì)胞記錄的方式研究LCX001對(duì)谷氨酸激活A(yù)MPA-GluA2（R）離子通道電流幅值、失敏常數(shù)等多項(xiàng)指標(biāo)的作用,考察化合物對(duì)離子通道開(kāi)放程度,電流的衰減快慢的影響,明確化合物是否具有促激動(dòng)活性及正性調(diào)節(jié)能力。5.LCX001對(duì)神經(jīng)元鈣內(nèi)流的調(diào)節(jié)作用:利用鈣成像檢測(cè)LCX001穩(wěn)定GluA2亞基神經(jīng)元膜表面的定位對(duì)神經(jīng)元鈣內(nèi)流產(chǎn)生的效應(yīng);研究結(jié)果:1.LCX001抗呼吸抑制具有廣譜性LCX001有效改善阿片、丙泊酚和戊巴比妥所致的呼吸抑制:靜脈給予芬太尼（120μg/kg）和TH-030418（20μg/kg）均導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸抑制,呼吸頻率（BPM）下降70-80%,通氣量（MV）下降50%;腹腔給予戊巴比妥（80mg/kg）使BPM與MV均下降約40%,靜脈給予丙泊酚（30mg/kg）后,BPM下降60%,通氣量下降約40%,引起中等程度的呼吸抑制。LCX001（10mg/kg）預(yù)防和急救給藥均可改善上述四種藥物所致的呼吸抑制,使大鼠的呼吸參數(shù)BPM與MV明顯上升。LCX001能夠快速恢復(fù)和穩(wěn)定阿片和丙泊酚致呼吸抑制大鼠的呼吸功能,使呼吸頻率和通氣量恢復(fù)到基礎(chǔ)水平,完全翻轉(zhuǎn)阿片和丙泊酚所致的大鼠呼吸抑制;LCX001同樣提升戊巴比妥致呼吸抑制大鼠的呼吸參數(shù),使BPM和MV值逐漸上升約20-30%,部分對(duì)抗戊巴比妥所致的大鼠呼吸抑制。2.LCX001腦靶向前藥抗呼吸抑制的藥效篩選和評(píng)價(jià)結(jié)果2.1LCX001腦靶向前藥XD-8-17C有效對(duì)抗阿片致小鼠急性死亡利用急性毒性實(shí)驗(yàn),對(duì)合成的系列LCX001前藥化合物進(jìn)行篩選,最終結(jié)果顯示靜脈給予LCX001腦靶向前藥化合物XD-8-17C（1、3、10mg/kg）可以有效對(duì)抗強(qiáng)阿片激動(dòng)劑TH-030418所致的小鼠急性死亡,使TH-030418致死的量效曲線右移,LD₅₀值提高到單藥的4.7倍。2.2XD-8-17C有效改善阿片致呼吸抑制大鼠的血?dú)鈪?shù)動(dòng)脈血?dú)鈪?shù)的檢測(cè)結(jié)果表明靜脈給予TH-030418（20μg/kg）誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生嚴(yán)重呼吸抑制,使動(dòng)脈血氧分壓（pO₂）迅速下降,由約90mmHg降至38mmHg,動(dòng)脈血氧飽合度（sO₂）迅速下降,由94%降至32%。與TH-030418處理組相比,靜脈給予LCX001（10mg/kg）或XD-8-17C（3mg/kg）均能夠快速逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈血氧分壓,氧飽和度的下降,改善了呼吸抑制狀態(tài),且在60min檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)上,XD-8-17C對(duì)抑制的pO₂和sO₂改善效果強(qiáng)于LCX001。2.3XD-8-17C有效改善阿片致呼吸抑制大鼠的肺功能參數(shù)肺功能參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示靜脈給予TH-030418（20μg/kg）誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生嚴(yán)重呼吸抑制,呼吸頻率降低至基礎(chǔ)值的30%左右,每分鐘通氣量降至基礎(chǔ)值的50%左右。與阿片類(lèi)藥物TH-030418處理組相比,10min后靜脈給予XD-8-17C（3mg/kg）進(jìn)行對(duì)抗治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)XD-8-17C可以快速有效的翻轉(zhuǎn)阿片所致的呼吸參數(shù)的下降,并逐漸恢復(fù)和穩(wěn)定呼吸參數(shù)至基線水平,且XD-8-17C（3mg/kg）與LCX001（10mg/kg）對(duì)呼吸參數(shù)的改善效果基本一致。3.LCX001增加轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白stargazin的表達(dá),促進(jìn)AMPA-GluA2（R）的膜定位和分布Westernblot結(jié)果提示,LCX001急性處理可以有效提高AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白stargazin的表達(dá)。免疫熒光法和活細(xì)胞成像結(jié)果表明,LCX001促進(jìn)包含GluA2亞基的AMPA受體的神經(jīng)元膜定位。LCX001在給藥后1min顯著增強(qiáng)SEP-GluA2（R）的熒光強(qiáng)度,增強(qiáng)效果在檢測(cè)結(jié)束前的7min內(nèi)仍持續(xù)存在,提示LCX001誘導(dǎo)AMPA-GluA2（R）在神經(jīng)細(xì)胞膜表面受體數(shù)量的上調(diào)與LCX001對(duì)AMPA受體正向調(diào)節(jié)的機(jī)制密切相關(guān)。4.LCX001對(duì)AMPA離子通道動(dòng)力學(xué)特性和細(xì)胞興奮性的影響結(jié)果:LCX001通過(guò)抑制受體失敏,增大電流幅值,提高細(xì)胞興奮性發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用:LCX001能夠使谷氨酸激活A(yù)MPA內(nèi)向電流的量效曲線明顯左移,EC₅₀值由3.43mM降至2.76mM,E_max值由902（pA）增至1142（pA）,提示LCX001可顯著增強(qiáng)谷氨酸對(duì)AMPA受體的親和力和敏感性;LCX001可使3.5和10mM谷氨酸激活受體的電流分別由432±27增至711±20和752±35增至1120±60（pA）,有效增強(qiáng)AMPA受體內(nèi)向電流幅值;LCX001顯著增加平臺(tái)期電流（steady-state）/幅值（peak）比值,表明LCX001有效抑制受體失敏,減緩電流衰減,實(shí)現(xiàn)電流幅值增強(qiáng)和正向調(diào)節(jié)效應(yīng)。5.LCX001限制延髓神經(jīng)元Ca²⁺內(nèi)流,緩解鈣超載效應(yīng)生理狀態(tài)下,GluA2亞基經(jīng)過(guò)特定位點(diǎn)編輯表現(xiàn)出對(duì)Ca²⁺的選擇性過(guò)濾,限制神經(jīng)元Ca²⁺內(nèi)流。鈣成像結(jié)果表明阿片類(lèi)藥物（芬太尼和TH-030418）均可使延髓原代神經(jīng)元內(nèi)Ca²⁺濃度迅速上升,并在檢測(cè)結(jié)束前的7-8min內(nèi)維持神經(jīng)元內(nèi)高Ca²⁺水平,引發(fā)的鈣超載效應(yīng),LCX001使原本阿片處理后神經(jīng)元內(nèi)的高Ca²⁺濃度部分下降,表明LCX001的加入快速上調(diào)神經(jīng)元表面具有Ca²⁺不通透特性的GluA2R亞基的數(shù)量,有效的限制Ca²⁺內(nèi)流,緩解鈣超載,起到神經(jīng)保護(hù)的作用,參與呼吸抑制的調(diào)節(jié)。結(jié)論:1.LCX001抗呼吸抑制具有廣譜性,對(duì)多種不同靶點(diǎn)藥物所引起的呼吸抑制均具有改善作用。2.LCX001腦靶向前藥化合物XD-8-17C以較低劑量達(dá)到與LCX001相當(dāng)或部分優(yōu)于LCX001的治療效果,表明XD-8-17C具有更強(qiáng)的抗阿片致呼吸抑制的效應(yīng)。