芳香新塔花總黃酮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)的抗動脈粥樣硬化作用及機(jī)制研究

芳香新塔花總黃酮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)的抗動脈粥樣硬化作用及機(jī)制研究目的:動脈粥樣硬化（AS）是心血管疾病的病理基礎(chǔ),嚴(yán)重影響人類的健康。課題組前期研究天香丹治療心血管疾病療效確切,而芳香新塔花（Ziziphoraclinopodioid-esLam.）是天香丹的主藥,是新疆的地產(chǎn)藥材,長期用于治療心血管疾病。研究證實芳香新塔花具有降壓、保護(hù)心血管和抗動脈粥樣硬化的功效,主要活性成分為黃酮類化合物,但其抗AS的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制不明確。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥是動脈粥樣硬化的重要發(fā)病機(jī)制,參與AS的發(fā)生和發(fā)展。因此保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和抑制炎癥是防治動脈粥樣硬化的重要靶點。本實驗對芳香新塔花總黃酮（TotalflavonoidsfromZiziphoraclinopodioidesLam,TFZC）進(jìn)行制備工藝優(yōu)化和成分分析,建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷和脂多糖誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）炎癥模型,探討其抗動脈粥樣硬化的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法:（1）利用單因素實驗考察各個提取因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度）對芳香新塔花總黃酮含量的影響,并利用正交實驗優(yōu)化方案,確定超聲波輔助提取工藝。以芳香新塔花總黃酮吸附率和解析率為考察指標(biāo),對4種不同型號的大孔吸附樹脂（AB-8、D101、HPD-100、HP-20）進(jìn)行篩選,確定適宜芳香新塔花總黃酮純化的樹脂。通過考察各個因素（上樣液濃度、pH值、徑高比、上樣液流速、洗脫劑濃度、洗脫流速、洗脫體積）,確定最佳純化工藝。利用超高效液相色譜/四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）,在電噴霧離子源（ESI）正負(fù)離子模式下分析芳香新塔花總黃酮的化學(xué)成分。（2）采用H₂O₂誘導(dǎo)HUVECs建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷細(xì)胞模型,給予藥物干預(yù),分為正常組、模型組、芳香新塔花總黃酮低、中、高劑量組,陽性藥維生素C組。用CCK-8法測定各組細(xì)胞存活率的變化,確定最佳作用濃度和時間。用試劑盒測定各組細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）和還原性谷胱甘肽（GSH）含量。用Hoechst33342熒光染色和AnnexinV-FITC/7-AAD雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;用流式細(xì)胞儀檢測各組線粒體膜電位和活性氧（ROS）的變化。用激光共聚焦觀察經(jīng)過Cyto-ID?Green染色的自噬體的變化。用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、cleavedCaspase-3、LC-3和Beclin-1蛋白的表達(dá)情況。（3）采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7建立炎癥細(xì)胞模型,給予藥物干預(yù),分為正常對照組,模型組,陽性藥阿托伐他汀鈣組,芳香新塔花總黃酮低、中、高劑量組,TAK-42（TLR4特異性阻斷劑）組。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT）檢測芳香新塔花總黃酮對RAW.264.7細(xì)胞活力的影響,Griess法測定細(xì)胞上清中一氧化氮（NO）,酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細(xì)胞上清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot法測定TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κBp65mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:（1）超聲波輔助提取芳香新塔花總黃酮工藝優(yōu)化,確認(rèn)了最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,料液比1∶50,提取時間50min,提取溫度60℃,提取2次。（2）篩選HP-20型大孔吸附樹脂純化芳香新塔花總黃酮,確認(rèn)了最佳純化工藝為:上樣液量為3mg/ml,pH為3,徑高比為1∶10,上樣液流速為3BV/h,最大上樣量為7BV,先用水洗脫,隨后用5BV、50%乙醇洗脫,洗脫流速為3BV/h。最終芳香新塔花總黃酮純度達(dá)63.1%。（3）利用超高效液相-質(zhì)譜技術(shù)共鑒定或推測出18個化合物,其中黃酮類化合物16個,分別為黃芩素（1）、山柰酚3-O-β-D-吡喃半乳糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷（2）、槲皮素（4）、山柰酚3,7-O-α-L-二鼠李糖苷（5）、金絲桃苷（6）、蘆丁（7）、山柰酚-7-O-新橘皮糖苷（8）、QuadranosideIII（9）、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖基（1→6）-α-L-鼠李糖苷（10）、芹菜素-7-O-新橘皮糖苷（11）、地奧司明（12）、白楊素-7-O-新橘皮糖苷（13）、5,7-二羥基二氫黃酮-7-O-β-D-吡喃半乳糖基（1→6）-α-L-鼠李糖苷（14）、蒙花苷（15）、山柰酚（16）、白楊素（17）。香豆素類化合物1個:東莨菪素（3）。倍半萜類化合物1個:對映-16β,17-二羥基貝殼杉烷-19-羧酸（18）。其中化合物2、3、5、8-11、13、14、18未見報道。（4）800μmol/LH₂O₂干預(yù)HUVECs4h,細(xì)胞變圓形、細(xì)胞膜邊緣模糊不清楚。CCK-8法檢測細(xì)胞存活率54.38±3.61%,建立H₂O₂誘導(dǎo)HUVECs模型。（5）芳香新塔花總黃酮在1¹00μg/ml范圍內(nèi)對HUVECs存活率無明顯影響。芳香新塔花總黃酮低、中、高劑量組和維生素C組可提高H₂O₂誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞的存活率、SOD活性和GSH含量,降低MDA和LDH含量（P<0.05或P<0.01）。（6）芳香新塔花總黃酮低、中、高劑量組和維生素C組可不同程度減輕H₂O₂誘導(dǎo)HUVECs凋亡,與正常組相比,模型組凋亡率明顯升高（29.30±4.59%Vs2.90±0.07%）,（P<0.01）;與模型組相比,芳香新塔花總黃酮低、中、高劑量組和維生素C組凋亡細(xì)胞比例顯著下降（分別是18.20±1.87%,12.85±1.28%,9.87±0.63%,14.13±1.63%）（P<0.01）。（7）流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位和ROS,線粒體膜電位結(jié)果示模型組線粒體膜電位顯著降低,而芳香新塔花總黃酮低、中、高劑量組和維生素C組線粒體膜電位顯著升高。模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,而芳香新塔花總黃酮組和維生素C組細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降（P<0.01）。（8）經(jīng)過Cyto-ID?Green染色后,激光共聚焦觀察正常對照組、模型組和維生素C組綠色點狀熒光較少,而芳香新塔花總黃酮組綠色點狀熒光增多,隨著劑量的增加,綠色熒光物質(zhì)逐漸增多。（9）芳香新塔花總黃酮和維生素C可顯著抑制H₂O₂誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞Bax和cleavedCaspase-3蛋白表達(dá)的上調(diào)及Bcl-2表達(dá)的下調(diào),并能上調(diào)LC3-Ⅱ和Bec1in-1蛋白的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。（10）LPS1μg/ml刺激RAW264.7細(xì)胞24h,可成功構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型。（11）芳香新塔花總黃酮在1¹00μg/ml濃度范圍內(nèi)對RAW264.7細(xì)胞的活力無影響。（12）芳香新塔花總黃酮低、中、高劑量組和阿托伐他汀組能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的釋放（P<0.01）,抑制率分別為19.12%、28.71%、32.05%和30.21%。而TAK-242可減弱TFZC抑制作用,抑制率為9.52%。芳香新塔花總黃酮低、中、高劑量組和阿托伐他汀組可下調(diào)LPS誘導(dǎo)RAW.264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌（P<0.05或P<0.01）,TAK-242能部分抵消TFZC下調(diào)TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的作用。（14）芳香新塔花總黃酮中、高劑量組和阿托伐他汀組可顯著降低RAW.264.7細(xì)胞TLR4、MyD88、TRAF-6和NF-κBp65mRNA和蛋白的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。芳香新塔花總黃酮低劑量組降低MyD88和NF-κBp65mRNA和蛋白的作用不顯著（P>0.05）,其中阿托伐他汀效果最為明顯;TAK-242能部分抵消TFZC降低TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κBp65mRNA和蛋白的作用。結(jié)論:（1）超聲提取和HP-20純化芳香新塔花總黃酮工藝穩(wěn)定,超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)初步分析其化學(xué)成分,為抗