微生物的培養(yǎng)與應用

專題2微生物的培育與運用了解有關(guān)微生物及培育基的根底知識，進展無菌技術(shù)的操作，進展微生物的培育。一、課標題的：掌握培育基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等根本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進展無菌操作，勝利地培育微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點和難點：三、技藝目的：微生物包括哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物特點：構(gòu)造簡單,形體微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才干看到，有的甚至沒有細胞構(gòu)造.且體內(nèi)普通不含有葉綠素.不能進展光協(xié)作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、根底知識：

(一)微生物細菌的外形與大小細菌：單細胞不分枝的原核微生物。細菌細胞微小而透明，通常用適當染料染色后顯微鏡察看圖1-1常見的三種細菌典型形狀A.球菌B.桿菌C.弧菌細菌細胞由外向里依次有鞭毛、菌〔纖〕毛、莢膜、細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)，細胞質(zhì)中又有液泡、儲存性顆粒、核質(zhì)等。細菌的構(gòu)造圖1-3細菌的構(gòu)造*細胞壁構(gòu)造特點：堅韌且有彈性細胞壁有哪些功能？①固定細胞外形；②維護細胞免受外力的損傷；③阻攔大分子物質(zhì)進人細胞；④使細胞具有致病性及對噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細胞壁中含毒素芽孢有些細菌在一定的條件下，細胞里面構(gòu)成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜〔如溫度、水分適宜〕的時候，芽孢又可以萌生，構(gòu)成一個細菌.菌落：單個或少數(shù)細菌在固體培育基上大量繁衍時，就會構(gòu)成一個肉眼可見的，具有一定形狀構(gòu)造的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要根據(jù)。菌落細菌的菌落特征因種而異細菌的營養(yǎng)類型根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同，將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:分類,舉例?異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌光合自養(yǎng)型:光合細菌化能自養(yǎng)型:硝化細菌,鐵細菌,硫細菌放線菌1、構(gòu)造：單細胞原核分支狀的菌絲〔基內(nèi)菌絲、氣生菌絲〕鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生的運用:病毒的構(gòu)造2、病毒的增殖：真菌一、根底知識：〔二〕培育基培育基〔培育液〕是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁衍運用的混合營養(yǎng)液。〔1〕按物理形狀分：固體培育基和液體培育基、半固體培育基。其中固體培育基用于菌種保管及分別、鑒定菌落、活菌計數(shù)等，半固體培育基可察看微生物的運動，液體培育基常用于發(fā)酵工業(yè)?！?〕按功能分：選擇培育基和鑒別培育基?！?〕按成分分：天然培育基和合成培育基。1.培育基的類型和用途選擇培育基參與青霉素的培育基:分別酵母菌、霉菌等真菌參與高濃度食鹽的培育基:分別金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培育基:分別固氮菌不加含碳有機物的無碳培育基:分別自養(yǎng)型微生物參與青霉素等抗生素的培育基:分別導入了目的基因的受體細胞參與氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培育基:分別雜交瘤細胞天然培育基有血清、血漿、和組織提取液〔如雞胚和牛胚浸液〕。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培育效果好缺陷：來源受限;成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培育基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：規(guī)范化消費，組分和含量相對固定;本錢低缺陷：短少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需求。合成培育基:天然培育基：血清中含有：①多種蛋白質(zhì)〔白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等〕②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分人工合成培育基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁衍，還需補充一定量的天然培育基〔如血清〕。液體培育基：外表生長均勻混濁生長沉淀生長固體培育基：菌落，菌苔半固體培育基：無動力有動力(彌散)(能否運動)2.不同的微生物往往需求采用不同的培育基配方(參考教材附錄內(nèi)容)3.不論哪種培育基，普通都含有水、碳源、和氮源、無機鹽、等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需求滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細菌生長必需，而本身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、浸透壓等的要求。4.培育基的用途液體培育基：增菌固體培育基：純化，增菌半固體培育基：動力檢測，保種二、無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念無菌操作泛指在培育微生物的操作中，一切防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需求做到“無菌〞，即防止雜菌污染。只需熟練、規(guī)范地進展無菌操作，才能夠勝利地培育微生物。〔１〕消毒定義：利用化學或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。區(qū)分為高程度消毒〔High-levelDisinfection〕、中程度消毒〔Intermediate-levelDisinfection〕、低程度消毒〔Low-levelDisinfection〕三種方式。2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別〔2〕滅菌的定義：以化學劑或物理方法消滅一切微生物，包括一切細菌的繁衍體、芽孢、霉菌及病毒，而到達完全無菌之過程。

滅菌消毒技術(shù)是微生物有關(guān)任務中最普通也是最重要的技術(shù)。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進展皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌的方法：最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅一切的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以根本堅持培育基的營養(yǎng)成分不被破壞。

有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣經(jīng)過，而空氣中的其他微生物不能經(jīng)過。

而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設計的。分類定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學法：醛類、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線、含氯劑、臭氧、復配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外的致病微生物超聲波、碘類、醇類、酚類低效消毒法殺滅細菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子無菌技術(shù)3.微生物實驗室培育的根本操作程序1、器具的滅菌2、培育基的配制3、培育基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培育7、菌種的保管1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培育物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請他判別以下資料或器具能否需求消毒或滅菌。假設需求，請選擇適宜的方法?！?〕培育細菌用的培育基與培育皿〔2〕玻棒、試管、燒瓶和吸管〔3〕實驗操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效防止操作者本身被微生物感染。答：〔1〕、〔2〕需求滅菌；〔3〕需求消毒。三、實驗操作1.制備牛肉膏蛋白胨培育基〔用于培育細菌〕1．計算、稱量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．64．過濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過程中留意不要使培育基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超越三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎操作步驟8．滅菌:將50ml培育基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培育基用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。9．倒平板:待培育基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板?！驳蛊桨宀僮饕娬n本〕2d后察看平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢查：將滅菌的培育基放入37℃的溫室中培育24—48小時，以檢查滅菌能否徹底。倒平板技術(shù)1.培育基滅菌后，需求冷卻到50℃左右時，才干用來倒平板。他用什么方法來估計培育基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培育基的錐形瓶，覺得錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進展倒平板了。2.為什么需求使錐形瓶的瓶口經(jīng)過火焰？答：經(jīng)過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培育基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，假設不小心將培育基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培育微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培育基外表的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培育基外表的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培育基，呵斥污染。答：空氣中的微生物能夠在皿蓋與皿底之間的培育基上繁殖，因此最好不要用這個平板培育微生物。2、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法平板劃線法:經(jīng)過接種環(huán)在瓊脂固體培育基外表延續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐漸稀釋分散到培育基的外表.在數(shù)次畫線后,可以分別到由一個細胞繁衍而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)平板劃線的操作方法交叉劃線法延續(xù)劃線法平板劃線時不能劃破培育基的緣由一旦劃破，會呵斥劃線不均勻，難以到達分別單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法構(gòu)成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會構(gòu)成一個條狀的菌落。問題討論1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作終了時，依然需求灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了防止接種環(huán)上能夠存在的微生物污染培育物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線終了后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而經(jīng)過劃線次數(shù)的添加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線終了后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，防止細菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進展劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開場劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開場，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的添加而逐漸減少，最終能得到由單個細菌繁衍而來的菌落。問題討論涂布平板的一切操作都應在火焰附近進展。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進展無菌操作？應從操作的各個細節(jié)保證“無菌〞。例如，酒精燈與培育皿的間隔要適宜、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。微生物的恒溫培育微生物的恒溫培育菌種的保管1、暫時保藏：接種到固體斜面培育基，菌落長成后置于4℃冰箱保管。2、長期保管：甘油冷凍管藏法四、課題成果評價〔一〕培育基的制造能否合格假設未接種的培育基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，闡明培育基的制備是勝利的，否那么需求重新制備?！捕辰臃N操作能否符合無菌要求假設培育基上生長的菌落的顏色、外形、大小根本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，那么闡明接種操作是符合要求的；假設培育基上出現(xiàn)了其他菌落，那么闡明接種過程中，無菌操作還未到達要求，需求分析緣由，再次練習?！踩衬芊襁M展了及時細致的察看與記錄培育12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時察看記錄的同窗會發(fā)現(xiàn)這一點，并能察看到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培育學生良好的科學態(tài)度與習慣。本課題知識小結(jié):【典例解析】例1．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的表達中，正確的A.是碳源的物質(zhì)不能夠同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽D.無機氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的詳細情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完好的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl那么只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌的了解不正確的選項是A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培育基和發(fā)酵設備都必需滅菌D.滅菌必需在接種前答案：B解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)