植物基因工程導(dǎo)論

第9章植物基因工程〔plantgeneengineering〕植物的基因植物基因工程原理和方法轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展植物分子生物學(xué)與生物工程植物基因的結(jié)構(gòu)植物基因的表達(dá)調(diào)控葉綠體基因組線粒體基因組第一章、植物的基因第一節(jié)植物分子生物學(xué)與生物工程一、植物基因組方案及基因克隆基因組Genome：指一種生物的全套基因和染色體?；蚪M學(xué)Genomics：對基因組進(jìn)行作圖、測序和分析的學(xué)科。分成兩支：結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：構(gòu)建生物的遺傳圖譜、物理圖譜和轉(zhuǎn)錄本圖譜及其全序列測序。功能基因組學(xué)：研究和評價基因功能包括生化、細(xì)胞、發(fā)育、適應(yīng)等。植物基因組方案可從根本上奠定研究植物的遺傳——發(fā)育——進(jìn)化理論的新的根底。植物基因組方案以擬南芥和水稻最引人注目。擬南芥方案從1989年開始，目前全序列已在網(wǎng)上公布。國際水稻基因組方案〔IRCP〕從1991年啟動。另外一些植物的基因組方案在進(jìn)行之中，如玉米、大豆、番茄、油菜、桃、蘋果等。美國國家植物基因組方案國家植物基因組方案于1997年5月啟動，1998年1月工作組正式公布了國家植物基因組方案的前5年規(guī)劃。國家植物基因組方案是與人類基因組工程(HGP)并行的龐大的工程。

一、NPGI的內(nèi)容、目標(biāo)及進(jìn)展

NPGI的研究內(nèi)容分為三局部：第一，結(jié)構(gòu)基因組研究(StructuralGenomics)，即研究基因組的結(jié)構(gòu)和組織；第二，功能基因組研究(FunctionalGenomics)，即鑒別基因組序列的作用，研究基因組結(jié)構(gòu)和組織與植物功能在細(xì)胞、有機(jī)體和進(jìn)化上的關(guān)系；第三，將基因組的信息和知識用于開發(fā)改進(jìn)植物和以植物為根底的新型產(chǎn)品。

聯(lián)邦政府主要側(cè)重于第一和第二局部的研究，第三局部的應(yīng)用研究主要由私人部門承擔(dān)。

NPGI的長期目標(biāo)是了解那些對農(nóng)業(yè)、環(huán)境、能源和健康具有重要意義的植物基因的結(jié)構(gòu)和功能，并應(yīng)用這些知識來改善人類社會。1、擬南芥和水稻基因組測序

2、結(jié)構(gòu)基因組研究

結(jié)構(gòu)基因組研究旨在繪出包括玉米、大豆、小麥、大麥、高粱、水稻、棉花、西紅柿和松樹等10—12種具有經(jīng)濟(jì)價值的關(guān)鍵植物的基因圖譜。為了尋找在經(jīng)濟(jì)作物中缺少的或沒有表達(dá)的有用基因，少數(shù)非經(jīng)濟(jì)植物也在考慮之列。

截至1999年8月，已有玉米、水稻、西紅柿和大豆等13種植物的基因組草圖被保存在由美國國立醫(yī)學(xué)圖書館管理的基因庫(GeneBank)中。

3、功能基因組研究

擬南芥Arabidopsisthaliana

——植物界的“果蠅〞擬南芥是一種十字花科植物，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究，已成為一種典型的模式植物。Smallgenome(114.5Mb/125Mbtotal)hasbeensequencedintheyear2000.Extensivegeneticandphysicalmapsofall5chromosomes.Arapidlifecycle(about6weeksfromgerminationtomatureseed).Prolificseedproductionandeasycultivationinrestrictedspace.EfficienttransformationmethodsutilizingAgrobacteriumtumefaciens.Alargenumberofmutantlinesandgenomicresources.Multinationalresearchcommunityofacademic,governmentandindustrylaboratories.二、植物發(fā)育的分子生物學(xué)研究

遺傳——發(fā)育——進(jìn)化的研究將成為理論生物學(xué)關(guān)注的中心問題。如：花發(fā)育的分子機(jī)理——ABC模型胚胎發(fā)育的分子機(jī)理受精作用根的發(fā)育激素及各種信號分子對發(fā)育的影響等三、物質(zhì)代謝過程的分子生物學(xué)光合作用機(jī)理生物固氮〔固氮酶〕初生代謝調(diào)控次生代謝調(diào)控四、生物中心法那么的有關(guān)理論問題DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及轉(zhuǎn)錄后、翻譯后的加工轉(zhuǎn)基因中外源基因和宿主核基因組之間的關(guān)系轉(zhuǎn)基因中的共抑制現(xiàn)象〔外源基因轉(zhuǎn)入后抑制同源序列的功能，涉及轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后阻滯〕和基因沉默〔所轉(zhuǎn)基因不表達(dá)，并不是喪失或突變，而是失活〕五、植物抗性分子生物學(xué)提高抗性改進(jìn)品質(zhì)和提高產(chǎn)量生物反響器植物病毒分子生物學(xué)植物分子遺傳與分子進(jìn)化環(huán)境保護(hù)的分子生物學(xué)等第二節(jié)植物的基因基因的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。高等植物的核編碼基因與其他真核生物的基因結(jié)構(gòu)類似。高等植物的主要基因類型有：器官與組織專一性表達(dá)的基因和受環(huán)境因素誘導(dǎo)而表達(dá)的基因。一、器官與組織專一性表達(dá)的基因2、生殖器官中P2基因——編碼參與花粉管萌發(fā)與生長時果膠解聚作用的蛋白質(zhì)，在雄蕊的成熟花粉〔管〕中表達(dá)；Def基因——編碼轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)生突變造成雄性器官轉(zhuǎn)換成雌性器官，只在雌蕊中表達(dá)；PAL2基因——編碼苯丙氨酸解氨酶，參與花色素合成，只在花瓣中表達(dá)；3、種子中二、受環(huán)境因素誘導(dǎo)而表達(dá)的基因熱休克基因低溫誘導(dǎo)的基因水澇誘導(dǎo)基因脫水誘導(dǎo)基因創(chuàng)傷誘導(dǎo)基因病菌感染誘導(dǎo)基因三、植物編碼基因的結(jié)構(gòu)

高等植物的編碼基因主要包括以下四個區(qū)域：5’上游區(qū)5’非翻譯區(qū)編碼區(qū)3’非翻譯區(qū)A、5’上游區(qū)——指基因轉(zhuǎn)錄起始點5’上游包括啟動子在內(nèi)的一段很長的區(qū)域。其中包括與基因轉(zhuǎn)錄起始與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的許多元件。特點：在起始點附近具有一致順序：CTCATCA在轉(zhuǎn)錄起始點上游〔－32±7bp處〕有TATAbox，順序為TCACTATATAG的，在其上游-75bp附近還有CAATbox，順序為GC〔T/C〕CAATCT。TATAbox對RNA聚合酶Ⅱ準(zhǔn)確進(jìn)行起始轉(zhuǎn)錄是必需的，CAATbox有增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄的功能。還含調(diào)控元件，有增強(qiáng)或阻遏表達(dá)的；有決定基因在特定時空表達(dá)順序的；有對激素或外界脅迫有應(yīng)答作用的順序。由于他們與基因位于同一條DNA鏈上，又稱順式作用元件〔cis-actingelements〕。B、5’非翻譯區(qū)——基因的轉(zhuǎn)錄起始位點到翻譯起始密碼子之間的一段序列。該區(qū)的5’端是前體 mRNA加帽〔7-甲基鳥嘌呤核苷〕的位點。有些基因該區(qū)還有一些莖環(huán)結(jié)構(gòu)，它們與翻譯密碼子的旁鄰順序?qū)Ψg的效率有影響。有些植物在此區(qū)還有內(nèi)含子，有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用。C、編碼區(qū)——從翻譯起始密碼到終止密碼子之間的一段區(qū)域，或這一區(qū)域中所有外顯子成分。特點：大局部植物基因以5’端的第一個AUG作為翻譯起始密碼子；外顯子4種核苷酸的比例：單子葉AU約43%，雙子葉54%；主要差異在密碼子的第三個堿基上，單子葉偏向于選擇A和U。編碼區(qū)常含內(nèi)含子，有些可增強(qiáng)基因表達(dá)；D、3’非翻譯區(qū)

——指轉(zhuǎn)錄本終止密碼子后面的一段順序。其中有一些調(diào)控元件，對mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率起重要調(diào)節(jié)作用。在mRNA末端有1~2個加polyA信號，多數(shù)植物基因為AAUAAA。5’3’AGGA或CAATboxTATAbox加帽位點加尾信號AB信號肽序列翻譯起始翻譯終止123外顯子內(nèi)含子第三節(jié)植物基因的表達(dá)調(diào)控

植物基因表達(dá)的調(diào)控可在三個水平上進(jìn)行：轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后加工和翻譯水平。一、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

指從DNA在聚合酶Ⅱ作用下合成前體mRNA這一過程中的調(diào)節(jié)。主要從以下5個方面進(jìn)行：1、染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)壓縮與松散、解開2、DNA甲基化3、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物4、順式作用元件5、反式作用因子反式作用因子

在基因轉(zhuǎn)錄中，除轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物外，還有許多核蛋白起著重要調(diào)節(jié)作用，它們與相應(yīng)的順式作用元件相互作用以增強(qiáng)或阻遏基因的表達(dá)，或決定著基因表達(dá)的組織與發(fā)育階段專一性。這類核蛋白稱為反式作用因子，或轉(zhuǎn)錄因子。二、轉(zhuǎn)錄后加工編碼蛋白質(zhì)的核基因轉(zhuǎn)錄成前體RNA〔hnRNA〕后，要經(jīng)過5’端加帽〔mTG〕與3’端加尾〔polyA〕，同時將內(nèi)含子剪切掉，才形成成熟的mRNA。內(nèi)含子的剪接是有剪接體參與完成的，它由多種小分子的核糖核蛋白顆粒組成。剪接位點多是內(nèi)含子兩端的GU〔GU和AG〕。各種因素可影響剪接體正確正常地剪除內(nèi)含子。三、翻譯水平的調(diào)節(jié)遺傳信息從mRNA翻譯成多肽大致可分為起始、延伸和終止三個階段。一些蛋白因子與tRNA的濃度影響上述階段。5’翻譯區(qū)的莖——環(huán)結(jié)構(gòu)影響翻譯的速率，mRNA的polyA在翻譯上起重要作用。mRNA的穩(wěn)定性〔具帽、具尾的完整結(jié)構(gòu)的保持〕也是影響表達(dá)的因素之一。第四節(jié)葉綠體基因組和線粒體基因組

高等植物除具有核基因組外，還存在兩種半自主性器官——葉綠體和線粒體。它們具有基因組，和核基因組一起共同調(diào)控植物的生長發(fā)育。一、葉綠體基因組及其編碼的基因葉綠體遺傳物質(zhì)的研究始于1909年Bear等人對高等植物花斑病的研究；1962年Ris等首次證實葉綠體中存在著DNA；1975年第一次得到純化的完整的葉綠體基因組〔ctDNA〕；1976年建立了玉米的ctDNA物理圖譜；以后對ctDNA的多種RNA和蛋白質(zhì)基因進(jìn)行了定位。1、葉綠體基因組大局部植物的ctDNA分子在120~160kb之間，最小的是綠藻Codiumfrasile，只有8kb；最大的是巨大綠藻，約2000kb。ctDNA的顯著特點是含反向重復(fù)序列IR〔InvertedRepeat〕，它把ctDNA分成大單拷貝區(qū)LSC〔10~85kb〕和小單拷貝區(qū)SSC〔10~20kb〕。另一特點是：具相同或相關(guān)功能的質(zhì)體基因聚于同一操縱子組成復(fù)合操縱子，分布于ctDNA上。2、cpDNA所含的基因控制遺傳的基因光系統(tǒng)基因ndh基因3、cp基因的表達(dá)調(diào)控受核基因的調(diào)控光調(diào)控細(xì)胞分化調(diào)控4、cp遺傳工程將C3植物改造成C4植物將非豆科植物轉(zhuǎn)化成固氮植物葉綠體發(fā)育機(jī)理、光合作用機(jī)理等研究提高光合效率、開發(fā)次生代謝產(chǎn)物葉綠體轉(zhuǎn)化二、線粒體基因組線粒體基因組也叫線粒體DNA〔mtDNA〕，大小在200~2500kb之間。高等植物mtDNA在ATP產(chǎn)生、光呼吸和氨基酸碳骨架形成中有重要作用。其環(huán)狀DNA分子由主環(huán)和含有直接或倒置重復(fù)的小環(huán)組成。mtDNA所含的主要基因RNA基因rRNA基因〔rDNA〕tRNA基因〔tDNA〕蛋白質(zhì)基因r—蛋白基因細(xì)胞色素氧化酶基因ATP合成酶基因陰離子通道蛋白基因ndh1，2，3，4，5〔NADH去氫酶亞基的基因〕線粒體基因組除了這個高分子的主基因組外，某些植物的線粒體還含有較小的線性或環(huán)性DNA分子。在某些植物中還檢測到小的環(huán)狀的隱形質(zhì)粒。這些小的DNA分子有或無同細(xì)胞質(zhì)雄性不育〔CMS〕存在相關(guān)性。第二章植物基因工程原理和方法第一節(jié)植物基因工程開展簡史

自1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草、馬鈴薯以來，短短十余年間，植物基因工程的研究和開發(fā)進(jìn)展十分迅速。國際上獲得轉(zhuǎn)基因植株的植物已達(dá)100種以上，包括水稻、玉米、馬鈴薯等作物；棉花、大豆、油菜、亞麻、向日葵等經(jīng)濟(jì)作物；番茄、黃瓜、芥菜、甘藍(lán)、花椰菜、胡蘿卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三葉草等牧草；蘋果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牽牛、菊花、香石竹、伽藍(lán)菜等花卉；以及楊樹等造林樹種。應(yīng)該說轉(zhuǎn)基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性進(jìn)展。

第二節(jié)植物基因工程原理和方法一、基因工程的工具酶基因工程中的工具酶依用途分：限制性內(nèi)切酶如DNA限制性內(nèi)切酶和甲基化酶，通過切割DNA分子，對含有特定基因的片段進(jìn)行別離、分析連接酶如T4DNA連接酶，將兩段甚至數(shù)段DNA片段連接起來修飾酶如DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、堿性磷酸酶等，用于DNA分子的體外合成、體外突變、序列分析、修復(fù)等。二、目的基因別離和鑒定1、目的基因性質(zhì)抗病毒、細(xì)菌和真菌殺死害蟲或供害蟲拒食抵抗各種除草劑抵抗逆境提高植物體中蛋白質(zhì)或其它物質(zhì)的含量或品質(zhì)2、目的基因來源來自于植物本身來自動物和微生物人工合成1、通過基因產(chǎn)物的分析和鑒定

〔1〕基因標(biāo)簽法。該法是利用轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產(chǎn)生一些突變體，然后用相應(yīng)轉(zhuǎn)座子或T-DNA對突變體文庫進(jìn)行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物基因文庫別離目的基因。

2、通過遺傳表型分析3.從研究缺失突變體的表型著手別離基因5、從大的基因組區(qū)域直接別離編碼序列

三、植物表達(dá)載體構(gòu)建目的基因被別離后，往往需要經(jīng)過修飾才能應(yīng)用于植物基因工程。構(gòu)建植物表達(dá)載體就是：在目的基因的5’端加上啟動子，在基因的3’端加上終止子，以便使外源基因能在植物中有效表達(dá)，充分發(fā)揮其功能。四、受體的遺傳轉(zhuǎn)化1、植物基因轉(zhuǎn)化的受體非整株水平葉圓片原生質(zhì)體懸浮細(xì)胞胚性愈傷組織胚狀體小孢子其它：如子葉、胚軸、莖段、根等。2、基因轉(zhuǎn)化的方法外源基因直接導(dǎo)入〔物化方法〕農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化〔生物法〕轉(zhuǎn)化方法原理特點農(nóng)桿菌介導(dǎo)

1、共培養(yǎng)法（原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞、愈傷組織共培養(yǎng)）2、葉圓盤（片）法3、活體接種法含可轉(zhuǎn)移的T—DNA的質(zhì)粒作為外源DNA載體，通過農(nóng)桿菌對宿主的浸染而將目的基因?qū)胧荏w，并整合到受體基因組中進(jìn)行表達(dá)

1、受體類型廣泛，多水平；2、簡單易行、轉(zhuǎn)化效率高；3、受宿主范圍限制，單子葉植物常受限；4、轉(zhuǎn)化體常“嵌合”；5、影響因子少

直接導(dǎo)入法

1、圓球體法2、脂質(zhì)體法3、顯微注射法4、PEG法5、電激法6、基因槍法7、超聲波法8、激光微束法用不同的方法直接將外源基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞中

1、不受宿主限制；2、受體水平多層次；3、多數(shù)方法需原生質(zhì)體作受體（1~6），周期長，轉(zhuǎn)化效率低；4、部分方法需專門的設(shè)備儀器，操作復(fù)雜；5、影響轉(zhuǎn)化頻率的因素多，難以控制

花粉管通道法

將供體DNA從雌花頂部引入子房，使其沿著花粉管生長時在花柱中開辟的通道進(jìn)入胚囊。

簡單易行，可直接得到轉(zhuǎn)化的種子；但受季節(jié)限制

五、基因工程細(xì)胞和植株的篩選和鑒定

為了有效地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化中常用選擇標(biāo)記和報告基因。1、選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記的要求：能抑制植物細(xì)胞的正常生長，但并不殺死植物細(xì)胞；有簡便的方法可以檢測其在轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株中的表達(dá)。即使在選擇壓力下，也不是所以存活的細(xì)胞或再生植株都是轉(zhuǎn)化了的，總會有一些逃避過選擇。常用的選擇標(biāo)記基因標(biāo)記基因選擇劑特征檢測nptⅡ新氯霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因抗生素如卡那霉素、慶大霉素等編碼的酶通過磷酸化使抗生素失活存活者為轉(zhuǎn)化子雙親葉酸脫氫酶基因氨甲喋呤表達(dá)產(chǎn)物對氨甲喋呤產(chǎn)生抗性同上hpt潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因潮霉素B表達(dá)產(chǎn)物對潮霉素產(chǎn)生抗性同上cat氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因氯霉素編碼酶催化氯霉素形成乙酰氯霉素同上2、報告基因

一種理想的報告基因應(yīng)具有以下特征：在植物中的本底很低或沒有其產(chǎn)物對代謝沒有不利影響表達(dá)產(chǎn)物有適度的穩(wěn)定性以利于檢測測定方法應(yīng)簡單、靈敏，可以定量事實上，現(xiàn)用的報告基因中還沒有可滿足上述全部條件的。許多抗生素選擇標(biāo)記基因可作報告基因，如nptⅡ、cat等。常用報告基因報告基因編碼產(chǎn)物檢測特點冠癭堿合成酶基因來自農(nóng)桿菌T—DNA冠癭堿合成酶紙電泳檢測冠癭堿對大多數(shù)植物有效GUS基因來自大腸桿菌4—MUG4—MU在365nm下激發(fā)可產(chǎn)生熒光分光光度法定性、定量測定靈敏方便，應(yīng)用最廣，但在果實、種皮、胚乳等中存在假陽性現(xiàn)象LUC基因來自螢火蟲蘭色沉淀組織化學(xué)方法測定，通過染色定位迅速、靈敏、無害，但設(shè)備昂貴GFP基因來自水母綠色熒光蛋白在藍(lán)光或紫外光及有氧存在時發(fā)綠色熒光不需底物，迅速、靈敏、無害，但設(shè)備昂貴花青素生物合成調(diào)控基因C1、B、R來自玉米色素目測受細(xì)胞類型及發(fā)育時期影響3、轉(zhuǎn)基因植株鑒定抗性標(biāo)記和報告基因進(jìn)行快速鑒定分子生物學(xué)檢測

SouthernBlotNorthernBlotWesternBlotPCR生物學(xué)鑒定第三章轉(zhuǎn)基因植物研究進(jìn)展一、植物轉(zhuǎn)基因的目的：以某一植物種的優(yōu)良的栽培品種或有希望推廣應(yīng)用的品種作起始材料，針對其某一缺點或缺乏之處轉(zhuǎn)進(jìn)一個或幾個控制特定性狀的目的基因〔抗蟲，抗病，抗除草劑基因〕，使轉(zhuǎn)基因植物既保存原有的各種優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，同時又增加一個或幾個新的目的基因控制的性狀。二、轉(zhuǎn)基因植物研究概況

植物轉(zhuǎn)基因研究起始于70年代末和80年代初，首例轉(zhuǎn)基因植物于1983年在煙草和馬鈴薯上獲得成功，至2002年底，現(xiàn)有230余種植物轉(zhuǎn)基因已獲成功。1、提高抗性：抗蟲、抗病、抗除草劑、抗鹽堿、抗衰老、抗熱及抗冷凍等。2、改進(jìn)作物品質(zhì)：改變蛋白質(zhì)、碳水化合物、油脂組分、維生素、礦物元素含量等。主要應(yīng)用領(lǐng)域1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化〔Agrobacterium-mediatedtransformation〕。2、以原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或胚性細(xì)胞團(tuán)塊作為受體的直接基因轉(zhuǎn)化(Directgenetransformation)。3、種質(zhì)系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)化(Germlinetransformation):利用子房、幼穗、種胚注射外源基因，DNA溶液浸泡萌動的種胚以及剛受精的花粉管通道途徑向剛啟動分裂的合子胚導(dǎo)入外源基因。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化流程圖（以潮霉素作為篩選劑為例）生根[MS+Met2+NAA0.5+CH500+S20g/L+Hm50+Cb250(pH5.8)]3-4w預(yù)培養(yǎng)(取受粉10-14d的未成熟種子剝?nèi)∮着?水稻幼胚于[NB+2,4-D2(mg/L,下同)+NAA0.5+KT0.5+CH500+S40g/L+Gelrite1.8g/L(pH5.8)]上4-5d

農(nóng)桿菌感染

愈傷組織