第十一單元 現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題?選修3?

第十一單元eq\b\lc\|\rc\(\a\vs4\al\co1(現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題選修3))第一講基因工程知識(shí)點(diǎn)一基因工程[系統(tǒng)主干知識(shí)]一、基因工程的概念分析二、基因工程的操作工具1．限制性核酸內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶)(1)來(lái)源：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。(2)作用：識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并切開(kāi)特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。(3)結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。[特別提醒]正確認(rèn)識(shí)限制酶①限制酶是一類(lèi)酶，而不是一種酶。②將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來(lái)，需要切兩處，同時(shí)產(chǎn)生四個(gè)黏性末端或平末端。③不同DNA分子用同一種限制酶切割，產(chǎn)生的末端都相同，同一個(gè)DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的末端一般不相同。④限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便進(jìn)行檢測(cè)。⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。2．DNA連接酶種類(lèi)E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源大腸桿菌T4噬菌體特點(diǎn)只縫合黏性末端縫合黏性末端和平末端作用恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，連接兩個(gè)DNA片段3．載體(1)作用：攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞。(2)種類(lèi)：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。(3)條件eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(能自我復(fù)制,有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn),有特殊的標(biāo)記基因))[特別提醒]基因載體與膜載體的區(qū)別基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)，它能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，并可對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。三、基因工程的基本操作程序1．目的基因的獲取(1)目的基因：主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子。(2)獲取方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(從基因文庫(kù)中獲取,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,人工合成))2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成：3．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞項(xiàng)目植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)Ca2＋處理法受體細(xì)胞受精卵、體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞4．目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)目的檢測(cè)方法判斷標(biāo)準(zhǔn)目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNADNA分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶個(gè)體水平的檢測(cè)如抗蟲(chóng)、抗病的接種實(shí)驗(yàn)是否表現(xiàn)出相應(yīng)的特性四、基因工程的應(yīng)用1．動(dòng)物基因工程：提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度從而提高產(chǎn)品產(chǎn)量；改善畜產(chǎn)品品質(zhì)；用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物；用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體等。2．植物基因工程：培育抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物(如抗蟲(chóng)棉)、抗病轉(zhuǎn)基因植物(如轉(zhuǎn)基因煙草)和抗逆轉(zhuǎn)基因植物(如抗寒番茄)；利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)(如新花色矮牽牛)。3．基因診斷與基因治療(1)基因診斷：又稱(chēng)為DNA診斷，是采用基因檢測(cè)的方法來(lái)判斷患者是否出現(xiàn)了基因異?；驍y帶病原體。(2)基因治療概念把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的成果將腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入取自患者的淋巴細(xì)胞中，使淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生腺苷酸脫氨酶，然后，再將這種淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)，從而治療復(fù)合型免疫缺陷癥類(lèi)型體外基因治療從病人體內(nèi)獲得某種細(xì)胞，在體外完成基因轉(zhuǎn)移，再輸回患者體內(nèi)體內(nèi)基因治療直接向人體組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因[聚焦關(guān)鍵微點(diǎn)]一、澄清概念——所用教材的關(guān)鍵語(yǔ)句要理解透1．實(shí)現(xiàn)基因精確的操作過(guò)程至少需要三種工具，即準(zhǔn)確切割DNA的“手術(shù)刀”、將DNA片段再連接起來(lái)的“縫合針”、將體外重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的“運(yùn)輸工具”。(1)限制酶只能用于切割DNA獲得目的基因。(×)(2)切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列。(×)(3)DNA連接酶能將兩堿基間通過(guò)氫鍵連接起來(lái)。(×)(4)E·coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。(×)(5)質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體。(√)(6)用于載體的質(zhì)粒DNA分子上至少含一個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)。(√)2．基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)步驟，即目的基因獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。(1)外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制。(×)(2)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)。(×)(3)用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列。(√)(4)表達(dá)載體的復(fù)制和胰島素基因的表達(dá)均啟動(dòng)于復(fù)制原點(diǎn)。(×)(5)目的基因?qū)腚p子葉植物細(xì)胞一般采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(√)(6)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可用抗原－抗體雜交技術(shù)。(×)3．植物基因工程技術(shù)主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能力(如抗除草劑、抗蟲(chóng)、抗病、抗干旱和抗鹽堿等)，以及改良農(nóng)作物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物等方面。(1)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體。(×)(2)動(dòng)物基因工程的實(shí)施主要是為了改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)，不一定是為了產(chǎn)生體型巨大的個(gè)體。(√)(3)利用乳腺生物反應(yīng)器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品，如人的血清白蛋白，這是因?yàn)閷⑷说难灏椎鞍谆驅(qū)肓藙?dòng)物的乳腺細(xì)胞中。(×)(4)由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應(yīng)用。(×)二、科學(xué)思維——高考常見(jiàn)的結(jié)論性語(yǔ)句需記牢靠1．DNA重組技術(shù)的基本工具(1)基因工程操作的基本工具有限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體。(2)限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識(shí)別DNA分子中某種特定的堿基序列，并在特定的位點(diǎn)上進(jìn)行切割。(3)E·coliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶既能連接黏性末端也能連接平末端。(4)質(zhì)粒是基因工程常用的載體，需具備的條件有：能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并自我復(fù)制；具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；具有標(biāo)記基因。2．基因工程的基本操作程序(1)基因工程的基本操作程序：目的基因的獲取→基因表達(dá)載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定。(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。(3)目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用顯微注射法，導(dǎo)入微生物細(xì)胞常用感受態(tài)細(xì)胞法(Ca2＋處理法)。(4)培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，受體細(xì)胞必須是受精卵；培育轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，受體細(xì)胞可以是受精卵，也可以是體細(xì)胞。(5)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因常用DNA分子雜交技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA同樣是采用分子雜交技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)常用抗原—抗體雜交技術(shù)。[深化拓展提能]一、基因工程的理論基礎(chǔ)二、基因工程的工具1．比較與DNA有關(guān)的六種酶名稱(chēng)作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將DNA切成兩個(gè)片段DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子DNA聚合酶或熱穩(wěn)定DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸解旋酶堿基對(duì)之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長(zhǎng)鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵核糖核苷酸將單個(gè)核糖核苷酸依次連接到單鏈末端2．明確載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，原理如圖所示：三、基因工程的基本操作程序1．比較幾種獲取目的基因的方法方法從基因文庫(kù)中獲取人工合成從基因組文庫(kù)中獲取從部分基因文庫(kù)，如cDNA文庫(kù)中獲取化學(xué)合成法逆轉(zhuǎn)錄法過(guò)程2．歸納概括目的基因檢測(cè)與鑒定的方法3．歸納概括PCR技術(shù)的操作原理和過(guò)程(1)PCR反應(yīng)的原理：DNA復(fù)制原理，即：eq\x(雙鏈DNA)eq\o(,\s\up15(加熱，雙螺旋結(jié)構(gòu)解體),\s\do15(緩慢冷卻，分離的DNA鏈重新結(jié)合))eq\x(\a\al(單鏈,DNA))(2)PCR反應(yīng)過(guò)程過(guò)程說(shuō)明圖解變性溫度上升到90℃退火溫度下降到55℃延伸溫度上升到72℃左右，Taq酶從引物起始合成互補(bǔ)鏈，可使新鏈由5′端向3′(3)結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。[題點(diǎn)全訓(xùn)過(guò)關(guān)]題點(diǎn)(一)基因工程的基本工具[典例1](2019·江蘇高考)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(Tetr)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)EcoRⅤ酶切位點(diǎn)為eq\a\vs4\al(…GAT↓ATC…,…CTA↑TAG…)，EcoRⅤ酶切出來(lái)的線(xiàn)性載體P1為_(kāi)_______末端。(2)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為_(kāi)_________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類(lèi)菌落，其生長(zhǎng)情況如表(“＋”代表生長(zhǎng)，“－”代表不生長(zhǎng))。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是________(填表中字母)類(lèi)，另外兩類(lèi)菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是________________、____________________。菌落類(lèi)型ABC無(wú)抗生素＋＋＋氨芐青霉素＋＋－四環(huán)素＋－－氨芐青霉素＋四環(huán)素＋－－(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________。[解析](1)從圖中可以看出，EcoRⅤ酶切出來(lái)的載體質(zhì)粒為平末端。(2)從圖中可以看出，目的基因的兩端各有一個(gè)游離的腺嘌呤脫氧核苷酸，由于載體P1為平末端，所以載體P1的兩端應(yīng)該各添加一個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷酸，形成P2，這樣在DNA連接酶的作用下才能把目的基因和載體P2連接起來(lái)。(3)由題意可知，構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)四環(huán)素抗性基因被破壞，所以導(dǎo)入目的基因的菌落只能在沒(méi)有抗生素或含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中存活，應(yīng)該選B類(lèi)菌落。A類(lèi)菌落能在表中所示條件下存活，說(shuō)明導(dǎo)入的是P0質(zhì)粒。C類(lèi)菌落只能在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中存活，說(shuō)明C類(lèi)菌落沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒。(4)據(jù)圖分析，目的基因的外側(cè)鏈只能用丙作引物，內(nèi)側(cè)鏈可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，則無(wú)論目的基因是否插入正確，都能通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增大量目的基因；如果用乙、丙作為引物，當(dāng)目的基因插入不正確(反向插入)時(shí)，則乙、丙兩引物都結(jié)合在外側(cè)，PCR不能正常進(jìn)行，無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，因此只能選用乙、丙作為引物，通過(guò)PCR鑒定目的基因是否插入正確。若擴(kuò)增出的DNA片段為400bp，則正好是目的基因反向連接后，外側(cè)鏈用乙作引物，內(nèi)側(cè)鏈用甲作引物擴(kuò)增出的片段。[答案](1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA連接(3)BA類(lèi)菌落含有P0C類(lèi)菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒(4)乙、丙目的基因反向連接eq\a\vs4\al([規(guī)律方法])選擇限制酶的技巧(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保具有相同的黏性末端。②質(zhì)粒作為載體，必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶SmaⅠ會(huì)破壞標(biāo)記基因。[對(duì)點(diǎn)訓(xùn)練]1．(2021·濰坊質(zhì)檢)如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關(guān)的酶作用位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是()A．甲、乙、丙都屬于黏性末端B．甲、乙片段可形成重組DNA分子，但甲、丙不能C．DNA連接酶的作用位點(diǎn)在乙圖中b處D．切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子解析：選C由圖可知，甲、乙、丙都屬于黏性末端，A正確；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它們之間不能形成重組DNA分子，B正確；DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子，作用部位是磷酸二酯鍵，C錯(cuò)誤；切割甲的限制酶的識(shí)別序列為：GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為：GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。2．Cre/loxP重組酶系統(tǒng)是對(duì)轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞DNA上的特定序列進(jìn)行定點(diǎn)切割和重新連接，從而在基因或染色體水平上對(duì)生物基因進(jìn)行遺傳改造的一種技術(shù)。其原理是重組酶Cre能識(shí)別loxP位點(diǎn)(特定的DNA序列)，并使loxP位點(diǎn)間的基因序列被重組或刪除。受此啟發(fā)，科學(xué)家在檢測(cè)抗蟲(chóng)基因成功導(dǎo)入煙草細(xì)胞后，嘗試用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞內(nèi)的抗除草劑基因，其技術(shù)過(guò)程如圖2(其中■表示啟動(dòng)子)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)通過(guò)基因改造獲得抗蟲(chóng)煙草過(guò)程中，為大量獲得抗蟲(chóng)基因，可選擇圖1中引物______(用圖中羅馬數(shù)字表示)組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增時(shí)，為確保抗蟲(chóng)基因和表達(dá)載體充分連接，常在基因上、下游引物的______端添加不同的限制酶切位點(diǎn)，其目的是________________________________________________________________________。(2)loxP是一種含34個(gè)堿基對(duì)的小型DNA片段，由一個(gè)不對(duì)稱(chēng)的間隔區(qū)和兩個(gè)反向重復(fù)序列組成。Cre酶能特異性地識(shí)別反向重復(fù)序列并于特定位置切開(kāi)磷酸二酯鍵，類(lèi)似于基因工程中的________酶，從遺傳學(xué)角度分析，Cre酶改變質(zhì)粒的原理是________________。(3)通常用______________法把攜帶抗蟲(chóng)基因的重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入煙草細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)導(dǎo)入成功后，抗除草劑基因即失去用途，繼續(xù)留在煙草體內(nèi)可能會(huì)引發(fā)的生物環(huán)境安全問(wèn)題是________________________________________________________________________。(4)經(jīng)Cre酶處理后，質(zhì)粒中的兩個(gè)loxP序列分別被切開(kāi)，得到圖2右側(cè)的兩個(gè)環(huán)狀DNA分子。由于____________________________________________，抗除草劑基因不再表達(dá)，之后會(huì)在培養(yǎng)過(guò)程中消失。解析：(1)由于DNA聚合酶只能從5′端向3′端延伸子鏈，因此為大量獲得抗蟲(chóng)基因，應(yīng)該選擇圖1中引物Ⅱ、Ⅲ組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增時(shí)，為確?？瓜x(chóng)基因和表達(dá)載體充分連接，常在基因上、下游引物的5′端添加不同的限制酶切位點(diǎn)，其目的是減少DNA自連，使抗蟲(chóng)基因能定向插入表達(dá)載體。(2)Cre酶能特異性地識(shí)別反向重復(fù)序列并于特定位置切開(kāi)磷酸二酯鍵，類(lèi)似于基因工程中的限制酶；從遺傳學(xué)角度分析，Cre酶改變質(zhì)粒的原理是基因重組。(3)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；抗除草劑基因繼續(xù)留在煙草體內(nèi)可能會(huì)引發(fā)生物環(huán)境安全問(wèn)題，如抗除草劑基因可能轉(zhuǎn)移到雜草中，造成基因污染。(4)經(jīng)Cre酶處理后，質(zhì)粒中的兩個(gè)loxP序列分別被切開(kāi)，得到圖2右側(cè)的兩個(gè)環(huán)狀DNA分子。由于質(zhì)粒乙的抗除草劑基因前沒(méi)有啟動(dòng)子，抗除草劑基因不再表達(dá)，之后會(huì)在培養(yǎng)過(guò)程中消失。答案：(1)Ⅱ、Ⅲ5′減少DNA自連，使抗蟲(chóng)基因能定向插入表達(dá)載體(2)限制基因重組(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化抗除草劑基因可能轉(zhuǎn)移到雜草中，造成基因污染(4)質(zhì)粒乙的抗除草劑基因前沒(méi)有啟動(dòng)子題點(diǎn)(二)基因工程的基本操作程序和應(yīng)用[典例2](2020·山東等級(jí)考)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強(qiáng)?？蒲腥藛T將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列轉(zhuǎn)入水稻，實(shí)現(xiàn)了對(duì)直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動(dòng)子序列的定點(diǎn)編輯，從而獲得了3個(gè)突變品系。(1)將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時(shí)，所需的酶是____________________，重組載體進(jìn)入水稻細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程稱(chēng)為_(kāi)_______。(2)根據(jù)啟動(dòng)子的作用推測(cè)，Wx基因啟動(dòng)子序列的改變影響了__________________，從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平。與野生型水稻相比，3個(gè)突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“發(fā)生”或“不發(fā)生”)改變，原因是________________________________________________________________________________________________。(3)為檢測(cè)啟動(dòng)子變化對(duì)Wx基因表達(dá)的影響，科研人員需要檢測(cè)Wx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA(WxmRNA)的量。檢測(cè)時(shí)分別提取各品系胚乳中的總RNA，經(jīng)______________過(guò)程獲得總cDNA。通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專(zhuān)一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________。(4)各品系WxmRNA量的檢測(cè)結(jié)果如圖所示，據(jù)圖推測(cè)糯性最強(qiáng)的品系為_(kāi)_______，原因是______________________________________________________________________________________________________。[解析](1)限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)；DNA連接酶能將DNA片段拼接起來(lái)。將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時(shí)，需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的參與。轉(zhuǎn)化是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。(2)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。Wx基因啟動(dòng)子序列的改變影響了RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別和結(jié)合，從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平，使直鏈淀粉合成酶基因的表達(dá)量改變。根據(jù)題干信息可知，基因編輯系統(tǒng)是對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯，由于編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動(dòng)子，所以與野生型水稻相比，3個(gè)突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列沒(méi)有發(fā)生變化。(3)用提取的各品系胚乳中的總RNA合成總cDNA的過(guò)程為逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄)，需要逆轉(zhuǎn)錄酶的參與。由于引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合，故通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專(zhuān)一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白質(zhì)合成的直接模板，根據(jù)題圖分析可知，3個(gè)突變品系中品系3的WxmRNA量最低，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強(qiáng)。[答案](1)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶轉(zhuǎn)化(2)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別和結(jié)合不發(fā)生編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動(dòng)子(3)逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄)引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)(4)品系3品系3的WxmRNA最少，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強(qiáng)[對(duì)點(diǎn)訓(xùn)練]3．Ⅰ型糖尿病是因免疫系統(tǒng)將自身胰島素作為抗原識(shí)別而引起的自身免疫病。小腸黏膜長(zhǎng)期少量吸收胰島素抗原，能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)識(shí)別該抗原后應(yīng)答減弱，從而緩解癥狀?？蒲腥藛T利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，使乳酸菌在小鼠腸道內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生人胰島素抗原，為此構(gòu)建重組表達(dá)載體，技術(shù)路線(xiàn)如下。據(jù)圖回答：(1)為使人胰島素在乳酸菌中高效表達(dá)，需改造其編碼序列。下圖是改造前后人胰島素B鏈編碼序列的起始30個(gè)核苷酸序列。據(jù)圖分析，轉(zhuǎn)錄形成的mRNA中，該段序列所對(duì)應(yīng)的片段內(nèi)存在堿基替換的密碼子數(shù)有________個(gè)。(2)在人胰島素A、B肽鏈編碼序列間引入一段短肽編碼序列，確保等比例表達(dá)A、B肽鏈。下列有關(guān)分析正確的是________。(填字母，多選)A．引入短肽編碼序列不能含終止子序列B．引入短肽編碼序列不能含終止密碼子編碼序列C．引入短肽不能改變A鏈氨基酸序列D．引入短肽不能改變?cè)艘葝u素抗原性(3)在重組表達(dá)載體中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶僅有圖示的酶切位點(diǎn)。用這兩種酶充分酶切重組表達(dá)載體，可形成________種DNA片段。(4)檢測(cè)轉(zhuǎn)化的乳酸菌發(fā)現(xiàn)，信號(hào)肽－重組人胰島素分布在細(xì)胞壁上。由此推測(cè)，信號(hào)肽的合成和運(yùn)輸所經(jīng)歷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)依次是________________________________。(5)用轉(zhuǎn)化的乳酸菌飼喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段時(shí)間后，小鼠體內(nèi)出現(xiàn)人胰島素抗原，能夠特異性識(shí)別它的免疫細(xì)胞有________。(填字母，多選)A．B細(xì)胞 B．T細(xì)胞C．吞噬細(xì)胞 D．漿細(xì)胞解析：(1)從圖示可知，改造前后人胰島素B鏈編碼序列的起始30個(gè)核苷酸序列有7個(gè)核苷酸發(fā)生了替換，則其轉(zhuǎn)錄形成的mRNA中，也會(huì)有7個(gè)核苷酸發(fā)生改變，一個(gè)密碼子由mRNA上決定一個(gè)氨基酸的三個(gè)連續(xù)的堿基組成，由此可知，該段序列所對(duì)應(yīng)的片段內(nèi)存在堿基替換的密碼子數(shù)有6個(gè)。(2)要確保等比例表達(dá)A、B肽鏈，則需A、B肽鏈一起合成，即啟動(dòng)子和終止子在人胰島素A、B鏈編碼序列兩端，在其中間加入一段短肽編碼序列后，序列中間不能出現(xiàn)終止子，所轉(zhuǎn)錄得到的mRNA中間也不能出現(xiàn)終止密碼子，同時(shí)不能改變肽鏈的氨基酸序列和它的功能。(3)在重組表達(dá)載體中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶酶切位點(diǎn)分別有2個(gè)和1個(gè)，當(dāng)將重組表達(dá)載體用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，會(huì)形成3個(gè)缺口，得到3種不同的DNA片段。(4)乳酸菌屬于原核細(xì)胞，其細(xì)胞壁上的信號(hào)肽在核糖體上合成后，到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中加工，再將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞壁。(5)人胰島素抗原能引起小鼠的特異性免疫，在特異性免疫過(guò)程中，B細(xì)胞和T細(xì)胞能特異性識(shí)別抗原，而吞噬細(xì)胞能識(shí)別抗原，但不是特異性識(shí)別，漿細(xì)胞不能識(shí)別抗原。答案：(1)6(2)ABCD(3)3(4)核糖體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁(5)AB4．(2021年1月新高考8省聯(lián)考·河北卷)我國(guó)約在7000年前就開(kāi)始種植水稻，現(xiàn)在水稻已經(jīng)成為我國(guó)廣泛種植的重要作物。提高水分利用效率對(duì)于旱作水稻的生產(chǎn)有重要意義?？茖W(xué)家從擬南芥中獲取功能基因HARDY(HRD)，并將其轉(zhuǎn)入水稻中過(guò)量表達(dá)，提高了水稻的水分利用效率?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)科學(xué)家在獲取擬南芥HRD基因過(guò)程中，采用了增強(qiáng)子作為篩選工具。增強(qiáng)子是一段能增強(qiáng)與其相連基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，將增強(qiáng)子插入到基因組中可得到若干個(gè)突變株系。增強(qiáng)子插入到基因外部，可獲得基因_____________突變株；增強(qiáng)子插入到基因內(nèi)部，可獲得基因______________突變株。(2)提取擬南芥總RNA，經(jīng)_____________過(guò)程獲得總cDNA，利用PCR技術(shù)選擇性擴(kuò)增HRD基因的cDNA。以上過(guò)程依次需要用到____________和____________兩種工具酶。(3)將HRD的cDNA插入到Ti質(zhì)粒的________上構(gòu)建重組載體，利用農(nóng)桿菌侵染水稻細(xì)胞并將HRD的cDNA整合到水稻細(xì)胞染色體上。為了便于轉(zhuǎn)基因植物的篩選，重組Ti質(zhì)粒中必需包括________。(4)在干旱條件下，野生型(WT)和HRD增強(qiáng)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株A、B(HRDA、HRDB)的根生物量(根系干重)及葉片蒸騰速率的測(cè)定結(jié)果如圖所示。據(jù)圖分析轉(zhuǎn)基因水稻耐旱能力增強(qiáng)的原因包括_____________________________和__________________________。解析：(1)增強(qiáng)子能增強(qiáng)與其相連的基因的轉(zhuǎn)錄，所以插入到外部(啟動(dòng)子的上游)可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄獲得基因激活突變株。增強(qiáng)子屬于調(diào)控序列，插入內(nèi)部不起作用，甚至有可能破壞基因，獲得基因失活突變株。(2)RNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，逆轉(zhuǎn)錄要用到逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR擴(kuò)增要用到Taq酶。(3)將HRD的cDNA插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上構(gòu)建重組載體，Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，利用農(nóng)桿菌侵染水稻細(xì)胞可將HRD的cDNA整合到水稻細(xì)胞染色體上。重組Ti質(zhì)粒應(yīng)包含標(biāo)記基因，其作用是供重組DNA的鑒定與選擇。(4)由圖1可知，轉(zhuǎn)基因水稻的根生物量多于非轉(zhuǎn)基因水稻，吸水能力增強(qiáng)了，同時(shí)由圖2可知，轉(zhuǎn)基因水稻蒸騰速率小于非轉(zhuǎn)基因水稻，失水減少，從而使得轉(zhuǎn)基因水稻抗旱能力增強(qiáng)。答案：(1)激活失活(2)逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶Taq酶(3)T-DNA標(biāo)記基因(4)根生物量增加，吸水能力增強(qiáng)蒸騰速率下降，失水減少[系統(tǒng)主干知識(shí)]一、蛋白質(zhì)工程二、DNA的粗提取與鑒定1．實(shí)驗(yàn)原理(1)提取原理①DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。②DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑具有耐受性。③DNA不溶于酒精溶液。(2)鑒定原理：DNA＋二苯胺試劑eq\o(→,\s\up7(沸水浴))藍(lán)色。2．實(shí)驗(yàn)流程[聚焦關(guān)鍵微點(diǎn)]一、澄清概念——所用教材的關(guān)鍵語(yǔ)句要理解透1．基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。(1)天然存在的蛋白質(zhì)是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化形成的。(√)(2)自然界天然存在的蛋白質(zhì)完全符合人類(lèi)生產(chǎn)和生活的需要。(×)(3)基因工程中可利用抗原抗體雜交技術(shù)檢測(cè)目的基因是否表達(dá)成功。(√)(4)基因工程的實(shí)質(zhì)是將一種生物的基因轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)并產(chǎn)生新性狀。(√)2．蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿(mǎn)足人類(lèi)的生產(chǎn)和生活的需求。(1)蛋白質(zhì)工程的目的是改造或合成人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)。(√)(2)蛋白質(zhì)工程可以合成自然界中不存在的蛋白質(zhì)。(√)(3)蛋白質(zhì)工程是在分子水平上對(duì)蛋白質(zhì)分子直接進(jìn)行操作，定向改變分子的結(jié)構(gòu)。(×)(4)蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來(lái)的第二代基因工程，是包含多學(xué)科的綜合科技工程領(lǐng)域。(√)二、科學(xué)思維——高考常見(jiàn)的結(jié)論性語(yǔ)句需記牢靠(1)蛋白質(zhì)工程的操作過(guò)程：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)→基因表達(dá)→產(chǎn)生需要的蛋白質(zhì)。(2)DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，在濃度為0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。(3)DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可溶于酒精，可利用冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化。(4)在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色。(5)哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞不含細(xì)胞核，不能作為提取DNA的實(shí)驗(yàn)材料。若選取肝臟細(xì)胞或植物細(xì)胞，則必須充分研磨。[深化拓展提能]一、概括蛋白質(zhì)工程與基因工程的關(guān)系項(xiàng)目蛋白質(zhì)工程基因工程區(qū)別過(guò)程預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定實(shí)質(zhì)定向改造或生產(chǎn)人類(lèi)所需的蛋白質(zhì)定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類(lèi)所需的類(lèi)型或生物產(chǎn)品結(jié)果可生產(chǎn)自然界沒(méi)有的蛋白質(zhì)只能生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì)聯(lián)系①蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上延伸出來(lái)的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶需要通過(guò)蛋白質(zhì)工程進(jìn)行修飾、改造二、DNA的粗提取與鑒定1．比較DNA與蛋白質(zhì)在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同物質(zhì)溶解規(guī)律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白質(zhì)NaCl溶液物質(zhì)的量濃度從2mol/L逐漸降低的過(guò)程中，溶解度逐漸增大部分發(fā)生鹽析沉淀溶解2．歸納DNA粗提取中的注意事項(xiàng)(1)本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核(無(wú)DNA)?？蛇x用雞血細(xì)胞作材料。(2)加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。(3)二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。(4)提取植物細(xì)胞的DNA時(shí)，加入的洗滌劑能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。(5)在DNA進(jìn)一步提純時(shí)，選用冷卻的95%的酒精的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。[題點(diǎn)全訓(xùn)過(guò)關(guān)]題點(diǎn)(一)蛋白質(zhì)工程[典例1](2019·海南高考)人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生某種具有臨床價(jià)值的蛋白質(zhì)(Y)，該蛋白質(zhì)由一條多肽鏈組成。目前可以利用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)Y。回答下列問(wèn)題。(1)若要獲得Y的基因，可從人的T細(xì)胞中提取______作為模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。(2)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。若將上述所得Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的______中，得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒，則可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將該基因?qū)肽撤N植物的葉肉細(xì)胞中。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織，則說(shuō)明Y的基因已經(jīng)_______________。(3)天然的Y通常需要在低溫條件下保存。假設(shè)將Y的第6位氨基酸甲改變?yōu)榘被嵋铱商岣咂錈岱€(wěn)定性，若要根據(jù)蛋白質(zhì)工程的原理對(duì)Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性，具體思路是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。[解析](1)由于人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)Y，要獲得Y的基因，可從人的T細(xì)胞中提取mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，利用四種游離的脫氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，T-DNA可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，故需要Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA中得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒，把重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，再讓含目的基因的農(nóng)桿菌侵染植物的葉肉細(xì)胞。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織，則說(shuō)明Y的基因已經(jīng)整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上。(3)蛋白質(zhì)工程需要從預(yù)期的蛋白質(zhì)的功能出發(fā)，設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推出相應(yīng)的氨基酸序列，找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列，故對(duì)Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性，需要找到第6位氨基酸中的堿基所在的基因位置，參照密碼子表，將第6位氨基酸甲的堿基替換為氨基酸乙的堿基。[答案](1)mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(2)T-DNA整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上(3)找到第6位氨基酸中的堿基所在的基因位置，參照密碼子表，將第6位氨基酸甲的堿基替換為氨基酸乙的堿基eq\a\vs4\al([歸納拓展])蛋白質(zhì)工程中通過(guò)基因操作來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造的原因分析①蛋白質(zhì)一般具有十分復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，容易改造。②改造后的基因可以遺傳給下一代，被改造的蛋白質(zhì)無(wú)法直接遺傳。[對(duì)點(diǎn)訓(xùn)練]1．已知生物體內(nèi)有一種蛋白質(zhì)(P)，該蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由305個(gè)氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(zhì)(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列問(wèn)題：(1)從上述資料可知，若要改變蛋白質(zhì)的功能，可以考慮對(duì)蛋白質(zhì)的___________________進(jìn)行改造。(2)以P基因序列為基礎(chǔ)，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因，所獲得的基因表達(dá)時(shí)是遵循中心法則的，中心法則的全部?jī)?nèi)容包括________的復(fù)制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動(dòng)，即：______________________________________________________________________________________________________________________。(3)蛋白質(zhì)工程也被稱(chēng)為第二代基因工程，其基本途徑是從預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)，通過(guò)________________和________________，進(jìn)而確定相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，再經(jīng)表達(dá)、純化獲得蛋白質(zhì)，之后還需要對(duì)蛋白質(zhì)的生物________進(jìn)行鑒定。解析：(1)從題中所述資料可知，將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸后，該蛋白質(zhì)的功能發(fā)生了改變，此過(guò)程是通過(guò)對(duì)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的排列順序進(jìn)行改造，進(jìn)而改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改變了蛋白質(zhì)的功能。(2)在蛋白質(zhì)工程中，目的基因可以以P基因序列為基礎(chǔ)，對(duì)生物體內(nèi)原有P基因進(jìn)行修飾，也可以通過(guò)人工合成法合成新的P1基因。中心法則的內(nèi)容如下圖所示：由圖可知，中心法則的全部?jī)?nèi)容包括：DNA以自身為模板進(jìn)行的復(fù)制，DNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給RNA，最后RNA通過(guò)翻譯將遺傳信息表達(dá)成蛋白質(zhì)；在某些病毒中RNA可自我復(fù)制(如煙草花葉病毒等)，在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成DNA(如HIV)，這是對(duì)中心法則的補(bǔ)充。(3)蛋白質(zhì)工程的基本途徑是預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→合成DNA→表達(dá)出蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)該過(guò)程得到的蛋白質(zhì)，需要對(duì)其生物功能進(jìn)行鑒定，以保證其發(fā)揮正常作用。答案：(1)氨基酸序列(或結(jié)構(gòu))(合理即可)(2)PP1DNA和RNA(或遺傳物質(zhì))DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(zhì)(或轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯)(3)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測(cè)氨基酸序列功能2．干擾素可以用于治療病毒感染和癌癥，但在體外保存相當(dāng)困難。如果將其分子上的一個(gè)半胱氨酸變成絲氨酸，那么，在－70℃(1)天然蛋白質(zhì)的合成過(guò)程是按照________進(jìn)行的，而蛋白質(zhì)工程與之相反。蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)__________________，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造新的蛋白質(zhì)，以滿(mǎn)足人類(lèi)生產(chǎn)和生活的需要。(2)若將干擾素的一個(gè)半胱氨酸變成絲氨酸，推測(cè)相應(yīng)的脫氧核苷酸序列__________(填“是”或“不是”)唯一的。可利用PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)基因，該技術(shù)的前提是要有一段________________________，以便根據(jù)這一序列合成引物。(3)干擾素基因是否翻譯出蛋白質(zhì)，可用______________(物質(zhì))進(jìn)行檢測(cè)。解析：(1)天然蛋白質(zhì)的合成過(guò)程是按照中心法則中轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程進(jìn)行的，而蛋白質(zhì)工程與之相反。根據(jù)蛋白質(zhì)工程的概念可知，蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造新的蛋白質(zhì)，以滿(mǎn)足人類(lèi)生產(chǎn)和生活的需要。(2)由于絲氨酸由多種密碼子來(lái)決定，因此通過(guò)題述方法獲得的脫氧核苷酸序列不是唯一的。在PCR技術(shù)中擴(kuò)增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。(3)檢測(cè)干擾素的基因是否表達(dá)，可用抗原抗體雜交法進(jìn)行檢測(cè)，即用(干擾素的)抗體進(jìn)行檢測(cè)。答案：(1)中心法則基因修飾或基因合成(2)不是已知目的基因的核苷酸序列(3)(干擾素)抗體題點(diǎn)(二)DNA的粗提取與鑒定[典例2](2019·江蘇高考)下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是()A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近B．DNA析出過(guò)程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂C．預(yù)冷的乙醇可用來(lái)進(jìn)一步純化粗提的DNAD．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱[解析]哺乳動(dòng)物(如兔)成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核和細(xì)胞器，細(xì)胞內(nèi)基本不含DNA，故兔血不宜作為該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料，A錯(cuò)誤；DNA析出過(guò)程中，攪拌要輕柔且沿著一個(gè)方向，以防止DNA斷裂，B正確；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入適量預(yù)冷的乙醇溶液，會(huì)使DNA析出，從而進(jìn)一步提純DNA，C正確；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴加熱數(shù)分鐘，溶液出現(xiàn)藍(lán)色，D正確。[答案]A[歸納拓展]DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中的“2、4、4加蒸餾水2次①加到雞血細(xì)胞液中，使血細(xì)胞吸水破裂；②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度下降到0.14mol/L，使DNA析出用紗布過(guò)濾4次①過(guò)濾血細(xì)胞破裂液，得到含細(xì)胞核物質(zhì)的濾液；②過(guò)濾溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液；③濾取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④再次過(guò)濾溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的細(xì)胞核物質(zhì)；②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA[對(duì)點(diǎn)訓(xùn)練]3．下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是()A．酵母菌和菜花均可作為提取DNA的材料B．DNA既溶于2mol/LNaCl溶液也溶于蒸餾水C．向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水?dāng)嚢?，可?jiàn)玻璃棒上有白色絮狀物D．DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱，冷卻后變藍(lán)解析：選C原則上含DNA的生物材料都可用來(lái)提取DNA，只是選用DNA含量高的生物組織，成功的可能性更大；DNA在2mol/LNaCl溶液和蒸餾水中溶解度都較大；向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水?dāng)嚢瑁u血細(xì)胞會(huì)吸水破裂，但在蒸餾水中不會(huì)析出DNA；DNA溶液加入二苯胺試劑后需沸水浴加熱，待冷卻后溶液變藍(lán)。4．下列是“肝臟細(xì)胞DNA粗提取”實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)關(guān)鍵操作步驟，相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．步驟1中，加入檸檬酸鈉緩沖液的目的是維持pH的穩(wěn)定B．步驟1中，冰浴處理的主要原理是低溫下DNA酶容易變性C．步驟2中，異戊醇的作用可能是使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因變性而沉淀D．步驟2中，離心后應(yīng)取上清液，因?yàn)镈NA在2mol/LNaCl溶液中溶解度比較大解析：選B步驟1中，加入檸檬酸鈉緩沖液的目的是維持pH的穩(wěn)定，A正確；低溫不會(huì)使酶變性失活，只能降低酶的活性，B錯(cuò)誤；步驟2中，異戊醇的作用可能是使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因變性而沉淀，C正確；DNA在2mol/L的NaCl溶液中的溶解度比較大，因此加固體NaCl使溶液濃度達(dá)到2mol/L后再離心過(guò)濾取上清液，D正確。eq\a\vs4\al([課時(shí)跟蹤檢測(cè)])一、對(duì)點(diǎn)練小題，落實(shí)主干知識(shí)1．為了增加牡丹花色類(lèi)型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖?)A．用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和DNA連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒B．用含C基因的農(nóng)桿菌侵染牡丹愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞C．在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞D．用分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上解析：選C目的基因C和質(zhì)粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位點(diǎn)，另外需要DNA連接酶將切好的目的基因和質(zhì)粒連接起來(lái)；愈傷組織細(xì)胞的全能性較高，是理想的植物受體細(xì)胞，將目的基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞的方法通常為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；質(zhì)粒中含有潮霉素抗性基因，因此選擇培養(yǎng)基中應(yīng)該加入潮霉素；使用分子雜交方法可檢測(cè)目的基因是否整合到受體染色體上。2．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)分別如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—如圖表示某一目的基因片段與質(zhì)粒拼接形成重組質(zhì)粒的過(guò)程，相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．用限制酶EcoRⅠ切割目的基因，同時(shí)用限制酶MunⅠ切割質(zhì)粒B．兩種限制酶切割后形成的黏性末端的堿基可以互補(bǔ)配對(duì)C．限制酶能使特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)D．將重組質(zhì)粒同時(shí)用2種限制酶切割則會(huì)形成2種DNA片段解析：選D由圖可知，目的基因兩側(cè)都是限制酶EcoRⅠ的切割位點(diǎn)，因此應(yīng)選用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子；質(zhì)粒中含有限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的切割位點(diǎn)，但EcoRⅠ的切割位點(diǎn)位于標(biāo)記基因中，用其切割會(huì)破壞標(biāo)記基因，因此為保證重組質(zhì)粒表達(dá)載體的準(zhǔn)確構(gòu)建，應(yīng)選用限制酶MunⅠ切割質(zhì)粒。圖中兩種限制酶切割后形成的黏性末端的堿基可以互補(bǔ)配對(duì)。限制酶的作用是使DNA分子中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。將重組質(zhì)粒同時(shí)用2種限制酶切割，則會(huì)形成3種DNA片段。3．(2021·南通模擬)下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是()A．雞的紅細(xì)胞和菜花均可作為提取DNA的材料，但處理方法有所不同B．在切碎的菜花中加入一定量的洗滌劑和食鹽，充分研磨，過(guò)濾收集濾液C．將NaCl溶液濃度調(diào)至2mol/L，用單層濾紙過(guò)濾獲取析出物D．利用某些蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度大于DNA在酒精中的溶解度的原理，可以提純DNA解析：選C雞的紅細(xì)胞和菜花均可作為提取DNA的材料，處理方法有所不同，動(dòng)物細(xì)胞只要加蒸餾水使細(xì)胞吸水破裂，植物細(xì)胞需要加洗滌劑和食鹽研磨；在切碎的菜花中加入一定量的洗滌劑和食鹽，充分研磨，過(guò)濾收集濾液；將NaCl溶液濃度調(diào)至2mol/L，用多層紗布過(guò)濾獲取濾液；利用某些蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度大于DNA在酒精中的溶解度的原理，可以提純DNA。4．如圖為科學(xué)家利用耐鹽堿植物中的耐鹽基因培育耐鹽水稻新品系的過(guò)程。下列相關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是()A．階段Ⅰ、Ⅱ應(yīng)用的技術(shù)分別是DNA重組技術(shù)、植物組織培養(yǎng)技術(shù)B．對(duì)耐鹽基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)可采用抗原抗體雜交技術(shù)C．可用抗生素抗性基因作為探針來(lái)檢測(cè)受體細(xì)胞中是否進(jìn)入了目的基因D．可用分子雜交技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞中的耐鹽基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA解析：選C階段Ⅰ將目的基因?qū)胨炯?xì)胞需要采用DNA重組技術(shù)，階段Ⅱ?qū)⑺炯?xì)胞培養(yǎng)成完整植株需要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，A正確；耐鹽基因表達(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，可用抗原抗體雜交技術(shù)檢測(cè)，B正確；可以用含有耐鹽基因的DNA探針檢測(cè)細(xì)胞中是否插入了目的基因，而不是用抗生素抗性基因作為探針來(lái)檢測(cè)，C錯(cuò)誤；可用分子雜交技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞中的耐鹽基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，D正確。5．Bar基因存在于青麻、黑麥草等生物體內(nèi)，其編碼的酶可使除草劑草丁膦失去毒害作用。培育轉(zhuǎn)Bar基因大豆，對(duì)于控制豆田雜草有重要意義。為了把Bar基因?qū)氪蠖辜?xì)胞，需將Bar基因插入pUcl8質(zhì)粒中構(gòu)建中間表達(dá)載體，然后與Ti質(zhì)粒重組為重組表達(dá)載體系統(tǒng)。如圖為pUcl8質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，回答下列問(wèn)題：(1)不能利用黑麥草與大豆進(jìn)行有性雜交的方法讓大豆獲得Bar基因，原因是________________________________________________________________________。(2)構(gòu)建中間表達(dá)載體時(shí)，為了便于篩選出含有Bar基因的重組質(zhì)粒，需將Bar基因插入到pUcl8質(zhì)粒的________中形成重組質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌，然后在添加________________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌，菌落呈白色的即為含中間表達(dá)載體的大腸桿菌。(3)中間表達(dá)載體需插入到Ti質(zhì)粒的________中才能將Bar基因整合到植物細(xì)胞的染色體DNA上，原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)可通過(guò)____________法直接將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞的原生質(zhì)體。導(dǎo)入Bar基因的原生質(zhì)體需________________，經(jīng)脫分化形成____________，再進(jìn)一步分化才能獲得轉(zhuǎn)Bar基因大豆植株。解析：(1)由于黑麥草與大豆之間存在生殖隔離，因此不能利用黑麥草與大豆進(jìn)行有性雜交的方法讓大豆獲得Bar基因。(2)根據(jù)圖中信息可知，lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶可以將培養(yǎng)基中的X-gal水解，使菌落呈藍(lán)色，否則菌落呈白色。因此，構(gòu)建中間表達(dá)載體時(shí)，為了便于篩選出含有Bar基因的重組質(zhì)粒，需將Bar基因插入到pUcl8質(zhì)粒的lacZ中形成重組質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌，然后在添加氨芐青霉素和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌，菌落呈白色的即為含中間表達(dá)載體的大腸桿菌。(3)Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。根據(jù)這一特點(diǎn)，如果將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以把目的基因整合到植物細(xì)胞中染色體的DNA上。(4)可通過(guò)顯微注射法直接將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞的原生質(zhì)體。導(dǎo)入Bar基因的原生質(zhì)體需再生出細(xì)胞壁，經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再進(jìn)一步分化才能獲得轉(zhuǎn)Bar基因大豆植株。答案：(1)黑麥草與大豆之間存在生殖隔離(2)lacZ氨芐青霉素和X-gal(3)T-DNAT-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上(4)顯微注射再生出細(xì)胞壁愈傷組織6．如圖1所示為用PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段示意圖；圖2所示為三種質(zhì)粒示意圖，圖中AmpR為氨芐青霉素抗性基因，Tetr為四環(huán)素抗性基因，EcoRⅠ、PvuⅠ等為限制酶及其切割的位點(diǎn)。復(fù)制原點(diǎn)是在基因組上復(fù)制起始的一段序列，是指質(zhì)粒在受體細(xì)胞中復(fù)制時(shí)的起點(diǎn)。請(qǐng)回答：(1)組成片段D的基本骨架與細(xì)胞膜的基本骨架相同的元素是____________。(2)圖2中質(zhì)粒A、質(zhì)粒C能否作為目的基因載體最理想的質(zhì)粒？________(填“能”或“否”)，請(qǐng)說(shuō)明理由。_________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的概率一般僅為10－7。用質(zhì)粒B構(gòu)建重組質(zhì)粒，為了篩選出導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，在導(dǎo)入完成后，將所有大腸桿菌分別在含有四環(huán)素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，大腸桿菌在兩種培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況不可能的是__________________________________________________，可能性最大的是________________________________________________。(4)若想在山羊的乳汁中收獲上述目的基因的表達(dá)產(chǎn)物，則需要將重組質(zhì)粒導(dǎo)入至山羊的________(細(xì)胞)中。解析：(1)脫氧核糖和磷酸交替連接，構(gòu)成DNA片段(D)的基本骨架，脫氧核糖由C、H、O三種元素組成，組成磷酸的元素是H、P、O；磷脂雙分子層構(gòu)成細(xì)胞膜的基本骨架，磷脂分子是由C、H、O、N、P組成，可見(jiàn)組成片段D的基本骨架與細(xì)胞膜的基本骨架相同的元素是C、H、O、P。(2)分析圖2可知，質(zhì)粒A缺少標(biāo)記基因，質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時(shí)，復(fù)制原點(diǎn)會(huì)被限制酶切割，進(jìn)而影響重組質(zhì)粒的自主復(fù)制，所以質(zhì)粒A、質(zhì)粒C均不能作為目的基因載體最理想的質(zhì)粒。(3)用質(zhì)粒B構(gòu)建重組質(zhì)粒，當(dāng)用和目的基因相同的限制酶(PvuⅠ)切割時(shí)，Tetr(四環(huán)素抗性基因)遭到破壞，而AmpR(氨芐青霉素抗性基因)結(jié)構(gòu)完好，因此在重組質(zhì)粒導(dǎo)入完成后，將所有大腸桿菌分別在含有四環(huán)素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，大腸桿菌在兩種培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況不可能的是在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)，在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)。因重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的概率一般僅為10－7，所以可能性最大的是在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上都不能正常生長(zhǎng)。(4)若想在山羊的乳汁中收獲上述目的基因的表達(dá)產(chǎn)物，則需要將重組質(zhì)粒導(dǎo)入山羊的受精卵中。答案：(1)C、H、O、P(2)否質(zhì)粒A缺少標(biāo)記基因，質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時(shí)，復(fù)制原點(diǎn)會(huì)被限制酶切割，會(huì)影響重組質(zhì)粒的自主復(fù)制(3)在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)，在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上都不能正常生長(zhǎng)(4)受精卵二、仿真練高考，注重答題規(guī)范7．已知鐮刀型細(xì)胞貧血癥是一種單基因遺傳病，患者的血紅蛋白分子β肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸代替，導(dǎo)致功能異常；而人類(lèi)是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染的最有效方法。乙型肝炎疫苗的研制先后經(jīng)歷了血源性疫苗和基因工程疫苗階段?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)將正常的血紅蛋白基因?qū)牖颊叩墓撬柙煅杉?xì)胞中，可以合成正常的血紅蛋白達(dá)到治療的目的。此操作________(填“屬于”或“不屬于”)蛋白質(zhì)工程，理由是該操作________________________________。(2)用基因工程方法制備血紅蛋白時(shí)，可先提取早期紅細(xì)胞中的______，以其作為模板，在____酶的作用下反(逆)轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA與載體需在限制酶和__________酶的作用下，構(gòu)建基因表達(dá)載體，導(dǎo)入受體菌后進(jìn)行表達(dá)。(3)如圖為“乙肝基因工程疫苗”的生產(chǎn)和使用過(guò)程，質(zhì)粒中l(wèi)acZ基因可使細(xì)菌利用加入培養(yǎng)基的物質(zhì)X-gal，從而使菌落顯現(xiàn)出藍(lán)色，若無(wú)該基因，菌落則成白色。圖中過(guò)程①有兩種限制酶選擇方案，它們分別是____________________或______________________。(4)獲取目的基因的方法除了圖中用酶切的方法從細(xì)胞中分離以外，還可以通過(guò)______________________________來(lái)獲得。據(jù)圖可知，該目的基因的具體功能是_________________________________。(5)為了篩選含目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可在培養(yǎng)大腸桿菌的通用培養(yǎng)基中加入_________________，培養(yǎng)一段時(shí)間挑選出________色的菌落進(jìn)一步培養(yǎng)獲得大量目的菌。解析：(1)蛋白質(zhì)工程通過(guò)基因修飾或基因合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造或制造新蛋白質(zhì)，由于該操作中沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或基因進(jìn)行修飾，因此不屬于蛋白質(zhì)工程。(2)因?yàn)檠t蛋白基因只在早期紅細(xì)胞中表達(dá)，所以可從其中提取mRNA，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反(逆)轉(zhuǎn)錄合成cDNA。構(gòu)建基因表達(dá)載體需要限制酶和DNA連接酶協(xié)助。(3)根據(jù)圖解可知，含有目的基因的外源DNA和載體上都有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRV的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，用EcoRV切割會(huì)破壞目的基因，因此圖中過(guò)程①有兩種限制酶選擇方案，它們分別是只用BamHⅠ或同時(shí)用EcoRⅠ和BamHⅠ。(4)獲取目的基因的方法有：從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。根據(jù)圖中④目的基因最終產(chǎn)生乙肝病毒外殼進(jìn)行接種，說(shuō)明該目的基因具體功能是指導(dǎo)合成乙肝病毒蛋白。(5)用限制酶BamHⅠ切割時(shí)破壞了lacZ基因，但沒(méi)有破壞青霉素抗性基因，因此為了篩選含目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可在培養(yǎng)大腸桿菌的通用培養(yǎng)基中加入青霉素和X-gal，根據(jù)題干信息“質(zhì)粒中l(wèi)acZ基因可使細(xì)菌利用加入培養(yǎng)基的物質(zhì)X-gal，從而使菌落顯現(xiàn)出藍(lán)色，若無(wú)該基因，菌落則成白色”可知，培養(yǎng)一段時(shí)間挑選出白色的菌落進(jìn)一步培養(yǎng)獲得大量目的菌。答案：(1)不屬于沒(méi)有對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造(或沒(méi)有對(duì)基因進(jìn)行修飾)(2)mRNA(或RNA)逆轉(zhuǎn)錄DNA連接(3)只用BamHⅠ或同時(shí)用EcoRⅠ和BamHⅠ(4)人工合成(或PCR技術(shù)擴(kuò)增)指導(dǎo)乙肝病毒蛋白質(zhì)外殼的合成(5)青霉素和X-gal白8．(2021年1月新高考8省聯(lián)考·廣東卷)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以按照人們的意愿精準(zhǔn)剪切、改變?nèi)我獍谢虻倪z傳信息，對(duì)該研究有突出貢獻(xiàn)的科學(xué)家被授予2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。我國(guó)科學(xué)家領(lǐng)銜的團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9等技術(shù)，將人的亨廷頓舞蹈病致病基因(HTT基因)第1外顯子(其中含150個(gè)CAG三核苷酸重復(fù)序列)“敲入”豬基因組內(nèi)，獲得了人豬“鑲嵌”HTT基因，利用胚胎工程技術(shù)成功地構(gòu)建了亨廷頓舞蹈病的動(dòng)物模型。回答下列問(wèn)題：(1)PCR技術(shù)是獲得人HTT基因常用的方法，制備PCR反應(yīng)體系時(shí)，向緩沖溶液中分別加入人HTT基因模板、4種脫氧核糖核苷酸及____________等，最后補(bǔ)足H2O。(2)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，SgRNA是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的引導(dǎo)RNA，準(zhǔn)確引導(dǎo)Cas9切割與SgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列，由此可見(jiàn)，Cas9在功能上屬于________酶。與CRISPR/Cas9相比，限制酶的特性決定了其具有____________的局限性。(3)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為確認(rèn)實(shí)驗(yàn)豬細(xì)胞基因組內(nèi)是否含有人豬“鑲嵌”HTT基因，常用的檢測(cè)手段包括PCR技術(shù)及________。(4)含有“敲入”序列的豬胚胎成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)通過(guò)細(xì)胞分裂，數(shù)量不斷增加，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為_(kāi)___________。貼滿(mǎn)瓶壁的細(xì)胞常用____________進(jìn)行消化處理，以便進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(5)將含有“敲入”序列的豬胚胎成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核導(dǎo)入去核的卵母細(xì)胞的過(guò)程，稱(chēng)為_(kāi)___________。此后進(jìn)行體外胚胎培養(yǎng)并移植到代孕母豬體內(nèi)，最終獲得亨廷頓舞蹈病動(dòng)物模型。解析：(1)PCR技術(shù)需要的條件是基因模板、4種脫氧核糖核苷酸作為原料及引物和Taq酶等。(2)Cas9可以切割與SgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列，由此可見(jiàn)，Cas9在功能上屬于限制性核酸內(nèi)切酶。與CRISPR/Cas9相比，限制酶只能識(shí)別和切割特定序列，這一特性決定了其具有作用對(duì)象單一的局限性。(3)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為確認(rèn)實(shí)驗(yàn)豬細(xì)胞基因組內(nèi)是否含有人豬“鑲嵌”HTT基因，可以通過(guò)PCR技術(shù)及基因探針技術(shù)來(lái)檢測(cè)。(4)當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為接觸抑制。貼滿(mǎn)瓶壁的細(xì)胞常用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，以便進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(5)將含有“敲入”序列的豬胚胎成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核導(dǎo)入去核的卵母細(xì)胞的過(guò)程，稱(chēng)為核移植。答案：(1)引物和Taq酶(2)限制性核酸內(nèi)切作用對(duì)象單一(3)基因探針技術(shù)(4)接觸抑制胰蛋白酶(5)核移植9．(2021·濱州一模)基因工程的第一步是篩選獲取目的基因，利用PCR技術(shù)獲取目的基因是一種常用的手段。圖示某DNA分子經(jīng)酶切后，DNA片段自身環(huán)化并利用PCR技術(shù)擴(kuò)增的部分過(guò)程。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)PCR與生物體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程不同，解旋時(shí)不需要________催化，而是通過(guò)______________實(shí)現(xiàn)的，因此PCR技術(shù)使用的DNA聚合酶必須是________________的。(2)如果在某基因組中定位了一個(gè)目的基因X，其堿基序列未知，但已知X臨近區(qū)域的一段DNA序列，此時(shí)可利用圖示方法進(jìn)行目的基因的篩選和擴(kuò)增。作用于圖示多個(gè)酶切點(diǎn)的限制酶種類(lèi)應(yīng)________(填“相同”或“不同”)。操作時(shí)根據(jù)圖中的________設(shè)計(jì)引物，將含有目的基因的DNA片段克隆出來(lái)。為便于目的基因與載體結(jié)合，可在________添加特定的限制酶識(shí)別序列。解析：(1)PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的不同之處主要表現(xiàn)在溫度環(huán)境的不同，在PCR中先用90～95℃高溫處理的目的是使DNA變性(使DNA的兩條鏈解開(kāi))，而這一過(guò)程中在細(xì)胞內(nèi)是通過(guò)解旋酶的催化實(shí)現(xiàn)的。所以PCR技術(shù)解旋不需要解旋酶，通過(guò)90～95℃高溫處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。PCR反應(yīng)包含多次循環(huán)，每次循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸，PCR技術(shù)在較高溫度下進(jìn)行，因此需要耐高溫(耐熱或熱穩(wěn)定)的DNA聚合酶。(2)根據(jù)圖示，用PCR技術(shù)擴(kuò)增X基因時(shí)，酶切后有自身環(huán)化現(xiàn)象，說(shuō)明酶切后形成的末端堿基序列相同，所以作用于圖示多個(gè)酶切點(diǎn)的限制酶種類(lèi)應(yīng)該相同。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。題中目的基因X堿基序列未知，X臨近區(qū)域的一段DNA序列已知。操作時(shí)需要根據(jù)圖中已知序列的一段DNA序列設(shè)計(jì)引物。為了便于擴(kuò)增后的X基因與質(zhì)粒連接，常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入特定的限制酶識(shí)別序列，主要目的是使X基因能定向插入表達(dá)載體。答案：(1)解旋酶90～95℃高溫處理耐高溫(耐熱或熱穩(wěn)定)(2)相同已知序列兩條引物10．(2021·汕頭校級(jí)模擬)人體內(nèi)的tPA蛋白能高效降解由纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥。然而，為心梗患者注射大劑量的基因工程tPA會(huì)誘發(fā)顱內(nèi)出血，其原因在于tPA與纖維蛋白結(jié)合的特異性不高。研究證實(shí)，將tPA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低出血副作用。據(jù)此，先對(duì)天然的tPA基因進(jìn)行序列改造，然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達(dá)該改造后的基因，可制造出性能優(yōu)異的改良tPA蛋白(注：如圖表示相關(guān)的目的基因、載體、限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，pCLY11為質(zhì)粒，新霉素為抗生素)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)以上制造出性能優(yōu)異的改良tPA蛋白的過(guò)程被稱(chēng)為_(kāi)___________工程。(2)已知人tPA基因序列已測(cè)出，且第84位半胱氨酸的模板鏈堿基序列為ACA，而絲氨酸的模板鏈堿基序列為AGA，因此要獲得改造后的目的基因最好采用____________________方法獲得。(3)若tPA改良基因的黏性末端如圖所示，那么需選用限制酶XmaⅠ和__________切開(kāi)質(zhì)粒pCLY11，才能與tPA改良基因高效連接。在基因工程中，最核心的一步為_(kāi)_______________________________。(4)一般選擇在未加入新霉素的培養(yǎng)基中生存的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，目的是__________________________________________。在加入新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細(xì)胞并非都是目的菌株，原因是______________________________________________，這時(shí)需選擇呈__________色的菌落，進(jìn)一步培養(yǎng)、檢測(cè)和鑒定，以選育出能生產(chǎn)改良tPA蛋白的工程菌株。解析：(1)在原有的tPA蛋白基礎(chǔ)上改良蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，屬于蛋白質(zhì)工程。(2)由于tPA蛋白基因的序列已知，因此可以使用化學(xué)方法人工合成的方法獲得目的基因。(3)目的基因的黏性末端圖中已經(jīng)給出，觀察各限制酶的識(shí)別序列可知所使用的限制酶為XmaⅠ和BglⅡ，要想把目的基因與載體拼接起來(lái)需要得到相同的黏性末端，因此載體也需要XmaⅠ和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一個(gè)環(huán)節(jié)為基因表達(dá)載體的構(gòu)建。(4)選擇未加入新霉素的培養(yǎng)基中生存的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，這些細(xì)胞沒(méi)有新霉素的抗性，當(dāng)其導(dǎo)入重組質(zhì)粒后，質(zhì)粒上的標(biāo)記基因使得大腸桿菌具有新霉素抗性，這樣可以選擇導(dǎo)入質(zhì)粒pCLY11的大腸桿菌；由于標(biāo)記基因存在于原有質(zhì)粒上，若未連目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，這些大腸桿菌也可以獲得新霉素的抗性；而區(qū)分重組質(zhì)粒和原有質(zhì)粒的一個(gè)標(biāo)志可以觀察mlacZ基因的表達(dá)情況，由于重組質(zhì)粒拼接了目的基因，破壞了mlacZ基因，因此在重組質(zhì)粒中該基因不表達(dá)，菌落呈現(xiàn)白色，而導(dǎo)入非重組質(zhì)粒的大腸桿菌由于該基因保存完整，可以表達(dá)，所以菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。答案：(1)蛋白質(zhì)(2)化學(xué)方法人工合成(3)BglⅡ基因表達(dá)載體的構(gòu)建(4)以便篩選出導(dǎo)入質(zhì)粒pCLY11的大腸桿菌含有未連目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)白第二講細(xì)胞工程知識(shí)點(diǎn)一植物細(xì)胞工程[系統(tǒng)主干知識(shí)]一、細(xì)胞工程的概念原理和方法細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)操作水平細(xì)胞水平或細(xì)胞器水平目的按照人的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品二、植物細(xì)胞的全能性概念具有某種生物全部遺傳信息的任何一個(gè)細(xì)胞，都具有發(fā)育成完整生物體的潛能原理細(xì)胞內(nèi)含有本物種的全部遺傳信息全能性表達(dá)條件具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，處于離體狀態(tài)，提供一定的營(yíng)養(yǎng)、激素和其他適宜外界條件三、植物組織培養(yǎng)1．理論基礎(chǔ)：植物細(xì)胞具有全能性。2．基本過(guò)程3．應(yīng)用(1)植物繁殖的新途徑：微型繁殖、作物脫毒、制備人工種子。①微型繁殖優(yōu)點(diǎn)：能夠保持親本的優(yōu)良性狀。②作物脫毒：利用莖尖、根尖等無(wú)毒組織進(jìn)行微型繁殖。③培育人工種子：可以解決某些植物結(jié)實(shí)率低、繁殖困難的問(wèn)題。(2)作物新品種的培育：?jiǎn)伪扼w育種、突變體的利用。(3)細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。四、植物體細(xì)胞雜交1．理論基礎(chǔ)：植物體細(xì)胞融合利用了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，雜種細(xì)胞培育成雜種植株利用了植物細(xì)胞的全能性。2．基本過(guò)程3．意義：克服了不同種生物遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙。[特別提醒]體內(nèi)細(xì)胞未表現(xiàn)全能性的原因是基因的表達(dá)具有選擇性。[聚焦關(guān)鍵微點(diǎn)]一、澄清概念——所用教材的關(guān)鍵語(yǔ)句要理解透1．具有某種生物全部遺傳信息的任何一個(gè)細(xì)胞，都具有發(fā)育成完整生物體的潛能，也就是說(shuō)，每個(gè)生物細(xì)胞都具有全能性的特點(diǎn)。(1)棉花根尖細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)形成幼苗能體現(xiàn)細(xì)胞的全能性。(√)(2)物種不同，細(xì)胞的全能性不同，一般是植物細(xì)胞>動(dòng)物細(xì)胞。(√)(3)一般情況下，分化程度越高的細(xì)胞其全能性越低。(√)(4)由于已分化的細(xì)胞都有一整套和受精卵相同的核DNA分子，因此細(xì)胞具有全能性。(√)(5)一般情況下植物體細(xì)胞不表達(dá)細(xì)胞的全能性。(√)2．植物組織培養(yǎng)就是在無(wú)菌和人工控制條件下，將離體植物器官、組織、細(xì)胞培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織、叢芽，最終形成完整植株。(1)愈傷組織是外植體通過(guò)脫分化和再分化后形成的。(×)(2)植物組織培養(yǎng)時(shí)，固體培養(yǎng)基中的瓊脂提供營(yíng)養(yǎng)成分。(×)(3)常選用胡蘿卜根的形成層進(jìn)行組織培養(yǎng)。(√)(4)植物組織培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比值始終不變。(×)(5)植物組織培養(yǎng)過(guò)程中所用器械需要進(jìn)行消毒處理。(×)3．植物體細(xì)胞雜交是指將不同種的植物體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的技術(shù)。(1)利用物理法或化學(xué)法可以直接將兩個(gè)植物細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)融合。(×)(2)再生出細(xì)胞壁是原生質(zhì)體融合成功的標(biāo)志。(√)(3)誘導(dǎo)細(xì)胞融合時(shí)，化學(xué)法一般是用聚乙二醇作為誘導(dǎo)劑。(√)(4)形成雜種細(xì)胞就完成了植物體細(xì)胞雜交過(guò)程。(×)(5)細(xì)胞融合時(shí)不只形成雜種細(xì)胞，還形成同種細(xì)胞融合的細(xì)胞。(√)二、科學(xué)思維——高考常見(jiàn)的結(jié)論性語(yǔ)句需記牢靠(1)植物組織培養(yǎng)的基本過(guò)程eq\x(外植體)eq\o(→,\s\up7(脫分化),\s\do5())eq\x(愈傷組織)eq\o(→,\s\up7(再分化),\s\do5())eq\x(根、芽)→eq\x(植物體)(2)植物體細(xì)胞雜交的理論基礎(chǔ)是細(xì)胞膜的流動(dòng)性和植物細(xì)胞的全能性，動(dòng)物細(xì)胞融合的理論基礎(chǔ)是細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞增殖。(3)植物體細(xì)胞雜交用到的酶是纖維素酶和果膠酶，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用到的酶是胰蛋白酶或膠原蛋白酶。(4)人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法分為物理法和化學(xué)法，物理法包括離心、振動(dòng)、電激等，化學(xué)法一般是用聚乙二醇作為誘導(dǎo)劑；動(dòng)物細(xì)胞融合常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電激等。[深化拓展提能]1．植物組織培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)利用原理細(xì)胞全能性細(xì)胞增殖培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)象離體的植物器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體由愈傷組織分散得到的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程外植體→脫分化→再分化→芽、根→植物幼苗愈傷組織→分散成懸浮細(xì)胞→繼代培養(yǎng)→細(xì)胞代謝產(chǎn)物培養(yǎng)目的植物幼苗細(xì)胞的代謝產(chǎn)物二者關(guān)系植物細(xì)胞培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)；它們都屬于植物細(xì)胞工程的范疇2．比較植物組織培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交名稱(chēng)植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交原理細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性和細(xì)胞的全能性過(guò)程選材選取根尖、莖尖、形成層部位，最容易誘導(dǎo)脫分化