大腸細菌的基因芯片鑒定課件

實驗三

基因芯片鑒定大腸細菌

基因芯片：

是指將特定的DNA或寡聚核苷酸片段通過物理化學方法固定于玻璃、尼龍甚至塑料片上,使多基因分析可同時進行的一種裝置。

基因芯片上可固定不同物種特定基因的探針，將從樣品中提取并經PCR擴增和熒光標記的特異基因片段與基因芯片上的探針雜交，利用專門的光學儀器，能夠檢測到這些雜交信號（帶有熒光標記的雙鏈核酸），雜交信號出現在某物種的探針位點上，說明樣品來自于該物種。基因芯片上固定探針的方法

通過化學修飾可以使玻片成為表面富含氨基的基片。在中性溶液中，基片上的氨基所帶的正電荷與核酸分子上的磷酸所帶的負電荷相互作用，使核酸吸附在基片表面。加熱和紫外照射可以增強固定效果，但紫外交聯容易導致DNA斷裂或DNA分子間形成干擾雜交的網狀結構，所以一般還是采用加熱固定。本實驗使用的基因芯片上固定有大腸桿菌HSP70基因和黃單胞菌HTPG基因的特異探針，可用于鑒定這兩種細菌?；蛐酒谱骱蜋z測的原理實驗方案

本實驗共分為四個部分：一、大腸桿菌培養(yǎng)二、提取大腸桿菌基因組DNA

三、PCR擴增其HSP70基因，電泳檢測擴增產物四、擴增產物與基因芯片雜交并檢測雜交信號第一部分細菌培養(yǎng)

配制100mlLB液體培養(yǎng)基，蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化鈉1g，加重蒸水100ml，用NaOH調pH至7.0，高壓滅菌。將大腸桿菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床上培養(yǎng)過夜，搖床轉速約為280r/min。5、加入與菌液等體積（1.6ml）的苯酚/氯仿/異戊醇混合液，用漩渦混合器混勻，4000r/min離心10min。注意吸取混合液前將混合液充分振蕩混勻。6、取上層水相至無菌離心管，再加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，用移液器反復吹打混勻，4000r/min離心10min。7、將上層水相轉移到另一個無菌離心管中，加入2μlRNaseA，37℃水浴中溫育30min。8、加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，充分振蕩，抽提殘留在水相中的苯酚。4000r/min離心10min。9、將上清液移至新的離心管中。10、加入上清液1/10體積的3mol/LNaAc溶液，以及上清液2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻以沉淀DNA。室溫下靜置10min，DNA形成白色（或淡黃色）絮狀沉淀。11、用移液器輕輕吸住白色絮狀沉淀，將其轉移到裝有適量75%乙醇的1.5ml離心管中。上下顛倒漂洗，洗去雜質。7500r/min離心5min。12、去上清液，沉淀干燥后溶解于100μlTE中。

取10μl提取的基因組DNA溶液加1.99ml水稀釋后測量OD260，蒸餾水作為空白，計算DNA產量（1OD260＝50μgDNA/ml）。

-20℃貯存其余基因組DNA，待下一實驗用作PCR反應的模板。

DNA產量測定試劑1、TE：10mmol/LTris·HCl，1mmol/LEDTA2、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）/NaCl：將4.1gNaCl溶解于80ml水中，緩慢加入10gCTAB，定容至100ml。3、苯酚/氯仿/異戊醇混合液：水飽和酚:氯仿:異戊醇=25:24:1（體積比）。4、氯仿/異戊醇混合液：氯仿:異戊醇=24:1（體積比）。5、10μg/μlRNaseA10%SDS

20mg/ml蛋白酶K5mol/LNaCl

3mol/LNaAc無水乙醇75%乙醇。第三部分PCR擴增組

分

劑

量（μl）

基因組DNA模板10-100ng10×TaqBuffer34×dNTP（各10mol/L）0.5上游引物（HEX標記）1下游引物（HEX標記）1TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)0.5dH2O（隨模板體積變化）總體積30PCR反應程序階段溫度時間

起始變性94℃3min變性94℃30s循環(huán)30次

退火60℃30s延伸72℃45s最后延伸72℃10min

第四部分

基因芯片雜交和檢測每個陣列的探針排布標記有HEX的核酸（無標記的大腸桿菌HSP70基因擴增產物）（無標記的黃單胞菌HtpG基因擴增產物）50%DMSO器材耗材軟件實驗步驟（1）準備芯片：去掉雜交圍欄上的膠紙，將雜交圍欄放在雜交模具中心的同樣形狀的凹槽中，膠面朝上，注意要使雜交圍欄與凹槽契合。用手捏著芯片上貼有標簽紙的一端，將芯片另一端頂著模具的頂端，然后將芯片正面（貼有標簽紙）朝下放入模具。在芯片背面相應位置用鑷子輕輕向下按，使雜交圍欄緊貼在芯片上。撕去圍欄上的保護紙貼圍欄第四部分實驗步驟（2）往雜交盒底部凹槽中均勻加入少量蒸餾水（約200μl），以防止雜交過程中雜交液大量揮發(fā)。把芯片有雜交圍欄的一面朝上放入雜交盒中，按芯片擺放方向蓋上蓋片，注意使蓋片上的凸面朝下。蓋片芯片標簽端蓋片正面觀往雜交盒底部的凹槽中加水將貼好圍欄的芯片放入雜交盒注意：圍欄朝上蓋上蓋片注意：蓋片的凸起面向下第四部分實驗步驟（3）雜交：將雜交液用移液器混勻后3000r/min離心30s，95℃熱變性3min。冰浴驟冷1min。用移液器將雜交液注入蓋片上的小孔。蓋上雜交盒的蓋板，兩側用兩個卡子扣上，確保雜交盒的密封性。在42℃水浴中雜交2小時。加雜交液蓋上盒蓋，插上卡子放入恒溫水浴中保溫第四部分實驗步驟（4）清洗：洗液先預熱至42℃。將芯片轉移到盛放洗液的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗。依次在洗液Ⅰ、Ⅱ中各清洗4分鐘。然后放在50ml錐形離心管中（標簽紙端朝下），1500r/min離心1分鐘以除去芯片表面的水分。（5）掃描及結果測定：啟動微陣列芯片掃描儀系統(tǒng)，進行芯片掃描，保存檢測結果。

清洗甩干基因芯片掃描儀微陣列芯片掃描儀EcoScan－100基因芯片掃描

儀工作原理基因芯片掃描儀工作流程軟件界面按鈕區(qū)狀態(tài)欄圖象顯示區(qū)控制區(qū)大腸桿菌的檢測結果黃單胞菌的檢測結果試劑（1）20×SSC：在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數滴HCl溶液調pH