第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法1課件

細(xì)胞生物學(xué)

研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法分類1．形態(tài)學(xué)觀察方面：顯微成像技術(shù)2．生化分析方面：分離技術(shù)、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)3．生理測(cè)定方面：細(xì)胞電泳技術(shù)、膜電位測(cè)定4．實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面：細(xì)胞工程技術(shù)、單克隆技術(shù)本章內(nèi)容

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法?

光學(xué)顯微鏡技術(shù)：以可見光（或紫外線）為光源。?

電子顯微鏡技術(shù)：以電子束為光源。分辨率

Resolution分辨率是指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離的能力。人眼分辨率：0.1~0.2mm

光學(xué)顯微鏡：0.2

m

掃描電鏡：3nm

透射電鏡：2nm

掃描隧道電鏡：0.1nm

（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)1.構(gòu)成：①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。4.光鏡樣本制作

整體觀察：足夠透明的活的或死亡的物體用透射光直接進(jìn)行觀察。切片觀察：固定包埋

切片染色觀察

（二）相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)Differential1、特點(diǎn)

把透過標(biāo)本的可見光的光程差或相位差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。1.環(huán)形光闌：位于光源與聚光器之間。2.相位板：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。2.用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本微分干涉差顯微鏡Differential

interferencecontrastmicroscope（DIC）利用兩組平面偏振光的干涉加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。明視野、相差、微分干涉反差顯微鏡觀察到的細(xì)胞的比較（三）熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）1.原理

熒光顯微鏡是以紫外光或藍(lán)紫光作光源，激發(fā)標(biāo)本產(chǎn)生熒光，從而用于細(xì)胞特殊成分和結(jié)構(gòu)的觀察。熒光染料或熒光基團(tuán)吸收不可見的紫外光，釋放出部分波長(zhǎng)較長(zhǎng)的可見光，該現(xiàn)象稱為發(fā)熒光。

熒光顯微鏡及其光路圖2.熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)特點(diǎn)：光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；有特殊的濾鏡：激發(fā)濾鏡、阻斷濾鏡、二向色鏡；特殊的“UV”物鏡。3.熒光顯微鏡的用途用途：免疫熒光觀察特異性大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)、DNA、RNA、抗原等的定性、定量、定位研究疾病診斷4.熒光標(biāo)記技術(shù)（1）熒光素直接標(biāo)記技術(shù)：觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。（2）免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：將熒光染料與抗體結(jié)合，制備成熒光抗體，用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位的技術(shù)。如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用。如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

構(gòu)建GFP的編碼區(qū)與被研究的蛋白質(zhì)的編碼基因重組DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞組成融合蛋白在熒光顯微鏡下跟蹤定位揭示蛋白參與的動(dòng)力學(xué)活動(dòng)。（四）激光共聚焦掃描顯微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM?用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。?分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。?用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。LCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)（五）熒光漂白恢復(fù)技術(shù)利用高能量激光速的照射，是特定區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬滅。光漂白區(qū)熒光的恢復(fù)，由非漂白區(qū)熒光標(biāo)記分子的運(yùn)動(dòng)來完成。用于檢測(cè)活體細(xì)胞內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)等。（六）當(dāng)代光學(xué)顯微鏡的

發(fā)展趨勢(shì)?

采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。?自動(dòng)化與電子化。二、電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡的誕生

電子顯微鏡是在1931年，由德國(guó)科學(xué)家EnestRuska和MaxKnoll首先發(fā)明的。1986年，世界上第一臺(tái)透射電鏡的發(fā)明者E．Ruska與發(fā)明掃描隧道顯微鏡的科學(xué)家G．Binnng和H．Rohrer一起榮獲諾貝爾物理獎(jiǎng)。（一）電子顯微鏡的基本知識(shí)不同光線的波長(zhǎng)

名稱可見光紫外光X射線α-射線電子束10Kv波長(zhǎng)（nm）390~760130~3900.05~130.005~10.01221.電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別2.電鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)電鏡的分辨本領(lǐng)是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率。

由于電磁透鏡在成像過程中存在的各種像差、色差、衍射差，再加上生物樣品本身等因素的影響，一般用透射電鏡觀察生物樣品時(shí)，能分辨清楚的兩個(gè)點(diǎn)之間的距離為0.5～1nm。其有效放大倍數(shù)可達(dá)100萬倍，如果超過100萬倍，所得的圖像就模糊不清了，我們把這種多余的放大稱為“空放大”。透射式電子顯微鏡1）電子照明系統(tǒng)以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束的波長(zhǎng)短，并且波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。2）電磁透鏡成像系統(tǒng)：物鏡、中間鏡、放大鏡為中空?qǐng)A柱體，由線圈調(diào)節(jié)電流大小，以次改變磁場(chǎng)強(qiáng)度。3）真空系統(tǒng)：真空泵，一般分機(jī)械泵和擴(kuò)散泵兩級(jí)4）記錄系統(tǒng)：熒光屏、感光膠片3.電鏡的基本構(gòu)造電鏡成像的原理

在真空條件下，電子束經(jīng)高壓加速后形成極細(xì)的快速電子束流，即電子射線。當(dāng)它與樣品發(fā)生作用時(shí)，由于樣品的厚度和質(zhì)量有差異，能產(chǎn)生多種帶有樣品信息的訊號(hào)。這些帶有樣品信息的電子束流經(jīng)物鏡作用產(chǎn)生樣品的最初放大像，接著經(jīng)中間鏡和投影鏡兩種電磁透鏡再次放大之后，帶有樣品信息的電子最終激發(fā)熒光屏，形成能用肉眼觀察的電子顯微圖像。電鏡與光鏡光路圖比較（二）主要電鏡制樣技術(shù)

表現(xiàn)樣品的二維超微結(jié)構(gòu)、應(yīng)用廣泛的超薄切片技術(shù)；顯示表面超微結(jié)構(gòu)、立體感較強(qiáng)的掃描電鏡樣品制備技術(shù)呈現(xiàn)生物膜的斷裂面超微結(jié)構(gòu)的冷凍蝕刻技術(shù)；用于細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的定性和定位研究的電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)；進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)抗原（抗體）的定性和定位研究的免疫電鏡技術(shù)；探測(cè)細(xì)胞內(nèi)大分子合成、運(yùn)輸動(dòng)態(tài)過程的電鏡放射自顯影技術(shù)；研究病毒和生物大分子等懸浮材料的負(fù)染術(shù).1.超薄切片技術(shù)

普通超薄切片術(shù)指不需要特殊的冷凍條件的常規(guī)包埋切片技術(shù)。它包括取材、固定，脫水、滲透、包埋、聚合、切片、染色等幾大部分。其中每一部分都是重要的環(huán)節(jié)，與觀察結(jié)果密切相關(guān)，所以為了得到可靠和滿意的結(jié)果，需要步步謹(jǐn)慎認(rèn)真。超薄切片技術(shù)1）取材和固定取材和固定要遵照“準(zhǔn)”、“快”、“輕”、“優(yōu)”的操作原則。固定液：2％～5％戊二醛

1％四氧化鋨（即鋨酸）2）脫水原因：A.生物樣品中水分的比例可達(dá)70％～80％以上，而水中又有85％～90％為游離態(tài)水，如包埋前不徹底除去游離態(tài)水，將造成切片困難和成像模糊等。

B.單純的烘干會(huì)使樣品收縮，破壞其超微空間結(jié)構(gòu)。脫水劑的配制和脫水方法

最常用的是乙醇和丙酮。一般用乙醇脫水時(shí)，其濃度梯度為30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％，每步10～15分鐘。另外，100％一步要重復(fù)一次，70％以前需在4℃條件下操作，從80％起可轉(zhuǎn)至室溫。3）包埋與聚合包埋的目的是聚合成硬塊的單體樹脂，一方面要支撐樣品本身的超微結(jié)構(gòu)，另一方面使能切片。把具有這種特性的單體樹脂稱為包埋劑。環(huán)氧樹脂類包埋劑4）超薄切片與染色修塊制刀切片載網(wǎng)支持膜電子染色醋酸雙氧鈾對(duì)富含有羧基和磷?；慕Y(jié)構(gòu)有廣泛而明顯的染色效果，如：脫氧核糖核酸（DNA）、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織等。檸檬酸鉛細(xì)胞核與核蛋白顆粒對(duì)鉛離子的親和力強(qiáng)。電鏡的標(biāo)本制備－超薄切片技術(shù)電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)2.負(fù)染技術(shù)

用重金屬鹽(如磷鎢酸)對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedActin3.冰凍蝕刻freeze-etching

亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。冰凍蝕刻技術(shù)樣品冷凍斷裂蝕刻噴鍍復(fù)型深度蝕刻技術(shù)顯示原生動(dòng)物四膜蟲纖毛軸絲的電鏡照片。箭頭指出一排特意動(dòng)力蛋白外臂。4.電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主要實(shí)驗(yàn)手段。ATP合成酶由X-射線晶體衍射(2.8A)所揭示的核小體三維結(jié)構(gòu)（引自K.Luger等，1997）a.通過DNA超螺旋中心軸所顯示的核小體核心顆粒8個(gè)組蛋白分子的位置；b．垂直與中心軸的角度所見到的核小體核心顆粒的盤狀結(jié)構(gòu)；

c．半個(gè)核小體核心顆粒的示意模型，一圈DNA超螺旋（73bp）和4種核心組蛋白分子，每種組蛋白由3個(gè)α螺旋和一個(gè)伸展的N-端尾部組成。N-端尾部有序排列，參與核小體之間的相互作用，以形成螺線管等高級(jí)結(jié)構(gòu)。5.掃描電子顯微鏡

（Scanningelectronmicroscope，SEM）20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。?分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。

工作原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。?為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。三.掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）分辨率0.1nm大氣介質(zhì)、液體環(huán)境、直接觀察分子量子力學(xué)原理：

I

Vbexp（-A

1/2S）

I真空隧道電流；Vb外加電壓；exp指數(shù)；A常數(shù)；

平均功函數(shù)；S導(dǎo)體間或探針與樣品間的距離原理

根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。諾貝爾獎(jiǎng)得主（從左到右）：電鏡的發(fā)明者ErnstRuska,

掃描隧道電鏡的發(fā)明者GerdBinnig&HeinrichRohrer

裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。

特點(diǎn)：（1）分辨本領(lǐng)高，（側(cè)分辨率為0.1