生化工藝學(xué)第三章課件

生化工藝學(xué)課件

第三章氨基酸的提取分離第三章氨基酸的提取分離§3.1概述§3.2氨基酸的分類(lèi)§3.3氨基酸的理化性質(zhì)§3.4氨基酸的主要用途§3.5氨基酸的提取分離方法§3.6胱氨酸的提取分離技術(shù)§3.7精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸的制備§3.8亮氨酸的制備§3.1概述發(fā)現(xiàn)新氨基酸種類(lèi)和數(shù)量已由60年代50種左右，到現(xiàn)在已突破400種。在產(chǎn)量方面，60年代初世界氨基酸產(chǎn)量不過(guò)10萬(wàn)噸，到2000年年產(chǎn)值達(dá)到300億美元。氨基酸作為人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)添加劑、調(diào)味劑、飼料添加劑、醫(yī)藥等，在食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及人類(lèi)健康、保健等諸多方面有著廣泛的應(yīng)用。氨基酸產(chǎn)品的涵義已從傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)氨基酸發(fā)展到包括非蛋白質(zhì)氨基酸、氨基酸衍生物及短肽類(lèi)在內(nèi)的一大類(lèi)對(duì)人類(lèi)生活和生產(chǎn)起著愈來(lái)愈重要作用的產(chǎn)品類(lèi)群各國(guó)氨基酸工業(yè)現(xiàn)狀分析全世界氨基酸產(chǎn)量達(dá)120萬(wàn)t，其中作為調(diào)味品及食品添加劑的約占50％，飼料添加劑約30％，藥用和保健、化妝品及其他用途的氨基酸約為20％，但世界市場(chǎng)總需求量至少為200萬(wàn)t。日本市場(chǎng)占有率為35％，銷(xiāo)售額為50％，（Glu、Lys、Met），還控制著世界氨基酸輸液原料的一大部分市場(chǎng)

歐美廠商一方面鞏固和維持自己的傳統(tǒng)市場(chǎng)，一方面積極研究開(kāi)發(fā)新技術(shù)。法國(guó)Rhone-Poulene公司和德國(guó)Degussa公司控制著家畜飼料市場(chǎng)上占有最大份額的蛋氨酸市場(chǎng)日韓歐美等國(guó)都在積極開(kāi)展重組菌株生產(chǎn)氨基酸技術(shù)，如Lys、Thr、Phe、Trp、Arg等，美國(guó)則憑借基因重組技術(shù)在氨基酸生產(chǎn)方面處于世界前列。

我國(guó)的氨基酸工業(yè)現(xiàn)狀到2000年，用于輸液的十八種藥用氨基酸原料，除L－絲氨酸和L－色氨酸尚不能工業(yè)化生產(chǎn)，其他均已投產(chǎn)，國(guó)產(chǎn)化率達(dá)到80％以上。谷氨酸的產(chǎn)量已達(dá)世界最高，接近國(guó)際先進(jìn)水平；賴(lài)氨酸消費(fèi)主要用于飼料工業(yè)，國(guó)內(nèi)自給僅為35～40％，需求也逐年增長(zhǎng)。

L－苯丙氨酸通過(guò)海因酶法路線(xiàn)，成本明顯下降。已有工業(yè)化產(chǎn)品聚合氨基酸和氨基酸型螯合劑等，市場(chǎng)前景看好?！?.2氨基酸的分類(lèi)一、蛋白氨基酸甘Gly、丙Ala、纈Val、亮Leu、異Ile脂鏈絲Ser、蘇Thr、半Cys、蛋Met羥硫添天Asp、谷Glu、賴(lài)Lys、精Arg、組His酸堿脯pro、酪Tyr、苯Phe、色Trp雜芳環(huán)天冬酰胺Asn、谷氨酰胺Gln天然蛋白質(zhì)的構(gòu)成成分，共20種，大都以結(jié)合狀態(tài)存在，均為L(zhǎng)-α-氨基酸——編碼蛋白質(zhì)據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)分為：脂肪族、芳香族、雜環(huán)族氨基酸。據(jù)分子中氨基和羧基的數(shù)目不同，分為酸性、堿性、中性§3.3氨基酸的理化性質(zhì)一般為白色結(jié)晶體，熔點(diǎn)很高，熔融時(shí)易分解，可溶于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿中水中溶解度：Arg、Lys最大，胱氨酸、Tyr最小，Pro能溶于乙醇中，乙醚中氨基酸多不溶解兩性解離和等電點(diǎn)（有機(jī)溶劑萃取、離子交換等）成鹽反應(yīng)：與酸堿均可形成可溶于水的鹽，與Cu2＋、Ag＋、Hg2＋形成不溶于水的鹽與茚三酮顯色反應(yīng)（據(jù)產(chǎn)生CO2或顏色的深淺）氨基酸特殊基團(tuán)的反應(yīng)（米倫Tyr、坂口Arg、PaulyHis及Tyr反應(yīng)）§3.4氨基酸的主要用途一、食品工業(yè)眾多蛋白質(zhì)的生物功能與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類(lèi)、數(shù)量、排列順序及由其形成的空間構(gòu)象有密切關(guān)系——對(duì)維持體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡有極其重要的意義。許多蛋白質(zhì)具有其特定的藥理效應(yīng)Cys及Tyr可分別由Met及Phe合成——也稱(chēng)為半必需氨基酸；Arg及His合成速率低Lys對(duì)嬰幼兒來(lái)說(shuō)：促進(jìn)鈣的吸收，加快骨骼生長(zhǎng)，加快生長(zhǎng)發(fā)育主食如小麥中缺乏Lys、Thr及Trp——應(yīng)注意適量添加鮮味：谷氨酸單鈉、天冬氨酸鈉；甜味：Gly、DL-Ala、L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯二、飼料工業(yè)不同動(dòng)物種類(lèi)和動(dòng)物不同生長(zhǎng)期，其必需氨基酸的種類(lèi)和數(shù)量各有不同。雞的必需氨基酸為蛋氨酸、賴(lài)氨酸、甘氨酸等13種；豬的必需氨基酸為賴(lài)氨酸、蛋氨酸、色氨酸、精氨酸、蘇氨酸等10種；魚(yú)類(lèi)的必需氨基酸為精氨酸、組氨酸、異亮氨酸及亮氨酸等10種。動(dòng)物機(jī)體若缺乏某一種氨基酸，特別是必需氨基酸，將會(huì)嚴(yán)重影響正常的生長(zhǎng)發(fā)育一般飼料中缺乏Lys和Met——適量添加這兩種氨基酸可提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，促進(jìn)雞多產(chǎn)蛋與豬的生長(zhǎng)常用的氨基酸飼料添加劑氨基酸飼料添加劑由發(fā)酵法、化學(xué)合成法、酶與化學(xué)-酶法等方法工業(yè)化生產(chǎn)，主要品種有：L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽是賴(lài)氨酸的主要商品形式，也是最常用的賴(lài)氨酸。

DL-蛋氨酸是最常用的蛋氨酸飼料添加劑。蛋氨酸羥基類(lèi)似物蛋氨酸羥基類(lèi)似物又叫羥基蛋氨酸，或MHB。N-羥甲基蛋氨酸鈣是羥基蛋氨酸的鈣鹽DL-色氨酸價(jià)格較高，飼料添加劑中較為少用。L-蘇氨酸除特殊需要外，飼料中并不常見(jiàn)。

目前生產(chǎn)賴(lài)氨酸的方法主要是發(fā)酵法。產(chǎn)菌株的選育和最適發(fā)酵條件的選擇是影響賴(lài)氨酸產(chǎn)量和賴(lài)氨酸生產(chǎn)效益的主要因素。谷氨酸棒桿菌AS1.563是我國(guó)選育出的賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株。該菌為高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（Hom-或Hser-）、具有耐高賴(lài)氨酸等特征。以糖蜜為原料，該菌72h累積產(chǎn)賴(lài)氨酸量（產(chǎn)酸量）平均為3.14%。以AS1.563為出發(fā)菌株,通過(guò)亞硝基胍和紫外線(xiàn)照射處理，使菌體發(fā)生誘變。篩選出具有抗賴(lài)氨酸類(lèi)似物-S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（Hom-）、耐高糖和耐高賴(lài)氨酸的賴(lài)氨酸高產(chǎn)菌株---ZL9601菌株。該菌72h累積產(chǎn)賴(lài)氨酸量為6.11%全世界主要的蛋氨酸生產(chǎn)企業(yè)為德國(guó)德固賽公司、法國(guó)Rhone－poulenc公司、美國(guó)Novns公司、日本住友化學(xué)制藥株式會(huì)社等，約占世界蛋氨酸產(chǎn)量的90％左右。最大消費(fèi)市場(chǎng)是飼料添加劑，目前食品及醫(yī)藥用途的消費(fèi)量占總市場(chǎng)消費(fèi)份額約不足1％。不同用途的蛋氨酸產(chǎn)品采用的工藝、設(shè)備、技術(shù)有很大不同。飼料級(jí)蛋氨酸生產(chǎn)多為化學(xué)合成法，生產(chǎn)工藝是以甘油、丙烯醛、甲硫醇合成，得到的主要是DL-Met。藥用輸液和食品添加劑蛋氨酸一般以L(fǎng)-Met為主，以DL-Met為原料，采用生物酶拆分法，生產(chǎn)L-Met純品。單一構(gòu)型氨基酸的獲取獲得單一構(gòu)型的氨基酸方法主要有兩類(lèi)：蛋白質(zhì)水解、微生物發(fā)酵、利用酶或化學(xué)不對(duì)稱(chēng)合成，直接得到單一構(gòu)型的氨基酸通過(guò)化學(xué)法合成外消旋氨基酸，再進(jìn)行手性拆分才能得到單一構(gòu)型的氨基酸對(duì)于D、L型都有應(yīng)用價(jià)值的氨基酸而言，哪種方法更有應(yīng)用前景？有些氨基酸化學(xué)法合成步驟簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，拆分后的產(chǎn)品組分較前一方法易于分離，拆分時(shí)可利用酶法拆分（溫和、環(huán)保）三、醫(yī)藥工業(yè)1、個(gè)別氨基酸類(lèi)制劑1）治療消化道類(lèi)疾病的氨基酸及其衍生物：谷氨酸及其鹽酸鹽、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺鋁、甘氨酸及其鋁鹽、硫酸甘氨酸鐵、維生素U及組氨酸鹽酸鹽2）治療肝病的氨基酸藥物L(fēng)-Arg、L-鳥(niǎo)氨酸及L-爪氨酸是機(jī)體尿素循環(huán)中間體（加速肝臟解高血氨毒）；L-谷氨酸可促進(jìn)TCA循環(huán)，促進(jìn)血氨下降；蛋氨酸、乙酰蛋氨酸（機(jī)體內(nèi)膽堿合成的甲基供體，促進(jìn)磷脂酰膽堿的合成）；L－天冬氨酸有助于鳥(niǎo)氨酸循環(huán)，促進(jìn)氨和CO2形成尿素，降低血氨和CO23）治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸：谷氨酸鈣鹽及其鎂鹽，維持神經(jīng)肌肉正常興奮（神經(jīng)衰弱腦功能衰竭等）；γ-Tyr(激活體內(nèi)的葡萄糖代謝，促進(jìn)乙酰膽堿合成，恢復(fù)腦細(xì)胞功能)；L-Trp及5-羥色氨治療抑郁癥、精神分裂癥及酒精中毒等；左旋多巴治療帕金森病及控制錳中毒4）腫瘤治療：偶氮絲氨酸、氯苯丙氨酸、磷乙天冬氨酸及正氮氧代正亮氨酸等5）其它：胱氨酸及半胱氨酸（抗輻射損傷、重金屬中毒、肝炎等）高半胱氨酸促進(jìn)核酸代謝及肝細(xì)胞再生，預(yù)防藥物中毒（保肝作用）；乙酰半胱氨酸：呼吸道黏液溶解劑，促進(jìn)排痰；乙酰羥脯氨酸結(jié)締組織疾患；賴(lài)乳清酸肝損傷解毒二、復(fù)方氨基酸制劑為重癥患者提供合成蛋白質(zhì)的原料，以補(bǔ)充消化道攝入的不足1）水解蛋白注射液：天然蛋白質(zhì)酶解或酸解的復(fù)方制劑（因含有小肽物質(zhì)，不能長(zhǎng)期大量應(yīng)用），為復(fù)方氨基酸注射液代替（濃度高、體積小、無(wú)熱源與過(guò)敏物質(zhì)）2）復(fù)方氨基酸注射液：多種氨基酸據(jù)需要按一定比例配置而成，有時(shí)加入高能物質(zhì)、微生素、糖類(lèi)及電解質(zhì)3）要素膳：由多種氨基酸、糖類(lèi)、脂類(lèi)、維生素、微量元素等組成，經(jīng)口或鼻飼為病人提供營(yíng)養(yǎng)的代餐制劑氨基酸輸液：營(yíng)養(yǎng)輸液、代血漿用輸液、止血用氨基酸輸液、嬰幼兒用氨基酸輸液、治療用氨基酸輸液（94年1000萬(wàn)瓶，2000年則達(dá)1億瓶）；氨基酸口服液氨基酸聚合物——新的外科材料（以亮氨酸和酯化的谷氨酸或天門(mén)冬氨酸共聚而成的仿天然皮膚的層狀傷口裹敷物）多肽類(lèi)藥物如谷胱甘肽是一種用于治療肝病、藥物中毒、過(guò)敏性疾病及預(yù)防白內(nèi)障的有效藥物氨基酸衍生物還可作為抗生素和抗菌增效劑、抗腫瘤藥物醫(yī)藥用氨基酸歸類(lèi)§3.5氨基酸的提取分離方法（天然）一、蛋白質(zhì)水解：酸水解（6－10mol/LHClor4mol/LH2SO4）高溫水解12－24h除酸。優(yōu)點(diǎn)：水解完全，不引起消旋，Trp全部被破壞，Ser、Tyr部分破壞，腐蝕設(shè)備，為工業(yè)常用方法堿水解：6mol/LNaOHor2mol/LBa(OH)2，100度6h，水解完全，Trp不遭破壞，不腐蝕設(shè)備，但氨基酸發(fā)生消旋反應(yīng)，Ser、Thr、Arg、Cys大部分被破壞——少用酶水解法：胰酶、胰漿、微生物蛋白酶，反應(yīng)條件溫和、不破壞氨基酸、不消旋、設(shè)備簡(jiǎn)單但水解不完全，中間產(chǎn)物如肽類(lèi)較多，易染菌——常用于制備蛋白胨、水解蛋白，在氨基酸生產(chǎn)中應(yīng)用較少水解是否完全？常采用縮二脲法檢測(cè)，若無(wú)典型顯色反應(yīng)則表示水解完全因?yàn)榭s二脲反應(yīng)是肽鍵的特征反應(yīng)，即蛋白質(zhì)或多肽中的肽鍵在堿性條件下，與Cu2＋產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物。只有具有肽鍵的2肽或以上的多肽、蛋白質(zhì)才有這一特征反應(yīng)，若蛋白質(zhì)完全水解了，則無(wú)縮二脲反應(yīng)二、氨基酸的分離及精制1、溶解度或等電點(diǎn)分離水及乙醇中溶解度的差異。eg.Cys及Tyr水中難溶，——Tyr熱水中易溶，而Cys仍難溶，結(jié)合等電點(diǎn)2、利用沉淀法：與有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物結(jié)合，生成特殊性質(zhì)的結(jié)晶性衍生物（eg.組氨酸＋氯化汞）3、利用離子交換法分離（調(diào)氨基酸水解液至pH2——過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂升高pH——分部收集洗脫液——洗脫液茚三酮顯色定量測(cè)定）根據(jù)氨基酸的溶解度和等電性質(zhì)選擇條件，調(diào)pH至等電點(diǎn)附近，采用結(jié)晶的方法來(lái)提高純度§3.6胱氨酸的提取分離技術(shù)Cysteine/Cystine，胱氨酸比半胱氨酸穩(wěn)定

Cystine：六角形片狀白色結(jié)晶，無(wú)味，微溶于水，不溶于乙醇及其他溶劑，易溶于稀酸、堿液中，熱堿液中易分解促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、防止皮膚老化，臨床上用于治療膀胱炎、禿發(fā)、肝炎、神經(jīng)痛、中毒癥、放射損傷及各種原因引起的巨細(xì)胞減少癥。在毛發(fā)中廣泛存在，人發(fā)中最多17.6%最難溶于水的氨基酸：廢舊雜毛——酸水解結(jié)構(gòu)式：HOOC-CH-CH2-S-S-CH2-CH-COOHNH2NH2一、試劑與器材1、原料：干燥的人發(fā)或豬毛2、試劑及配制：各種試劑、規(guī)格及作用3、器材：玻璃鋼水解罐、耐酸鍋、陶瓷缸、不銹鋼桶；恒溫水浴、溫度計(jì)；布氏漏斗、垂熔漏斗、砂芯漏斗、離心機(jī)；酸度計(jì)二、提取工藝廢雜毛清洗清洗廢雜毛濾渣（棄去）濾液中和濾液（棄去）沉淀（粗品）粗品再溶上清液（回收氨基酸）沉淀物結(jié)晶濾液（棄去）晶體干燥成品提純工藝流程：水解三、注意幾點(diǎn)1、水解終點(diǎn)的判定：收率基本穩(wěn)定在3％-4%，平均最高收率7％-8%→主要取決于毛發(fā)的水解程度，水解是否完全采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下，與Cu2＋產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合反應(yīng)，與縮二脲在堿性條件下與Cu2＋的反應(yīng)相似2、酸濃度高及水解時(shí)間：酸濃度↑，水解速率↑；水解時(shí)間也很關(guān)鍵：時(shí)間短則水解不徹底；時(shí)間長(zhǎng)則氨基酸被破壞3、溫度的控制：pH調(diào)至4.84、如何提高產(chǎn)率：提取率多在4％-8%，人發(fā)提取率較高，生產(chǎn)過(guò)程中提取不完全、損失大。關(guān)鍵：水解、中和及過(guò)濾，水解時(shí)，水解罐應(yīng)裝有回流裝置。5、產(chǎn)品規(guī)格及含量測(cè)定：規(guī)格：外觀、熔點(diǎn)、比旋光度、干燥失重、澄明度、氯化物測(cè)定、殘?jiān)鼫y(cè)定、重金屬檢測(cè)、鐵鹽檢測(cè)、酪氨酸檢測(cè)含量測(cè)定：溴量法(氨基酸分析儀、液相色譜費(fèi)用較高)Br2→Br-；Br-+KI→I2；淀粉指示：

I2＋Na2S2O3→溴量法易受多種因素的影響,如水解液色澤較深,影響到對(duì)淀粉指示劑變色點(diǎn)的判斷、凡能氧化碘化鉀的物質(zhì)如Cｕ2+、Fｅ3+都嚴(yán)重干擾測(cè)定溴亞鐵法采用二苯胺磺酸鈉作指示劑,顏色由綠色變?yōu)樽仙?樣品本身的顏色對(duì)變色點(diǎn)的判斷影響相對(duì)較小§3.7

Arg、Lys、His的制備Lys必需，Arg、His半必需Lys必需，用于治療營(yíng)