在基因水平診斷疾病課件

在基因水平診斷疾病第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)

患者臨床表現(xiàn)：中醫(yī)的望聞問切與西醫(yī)的影像學(xué)檢查細(xì)胞形態(tài)、生化檢測及免疫學(xué)檢驗：生命活動的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)基礎(chǔ)

ConceptofGeneDiagnosis第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)基因診斷的概念基因診斷的出現(xiàn)：1976年加州大學(xué)華裔科學(xué)家KanYW用核酸分子雜交首次對一例α珠蛋白生成障礙性貧血進行診斷

狹義:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸雜交、基因重組、基因芯片等各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測特定基因存在與否、結(jié)構(gòu)變異和表達狀態(tài)的過程，對疾病作出診斷。Voguereferences：forensicmedicine,identificationofbiologicalspecies,etc.

基因診斷的概念第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)基因診斷的概念與傳統(tǒng)診斷的區(qū)別：直接以病理基因（致病基因、疾病相關(guān)基因和外源性病原生物基因等）為分析對象，即對待診生物材料某一（些）特定基因進行分析判斷。第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)

ConceptofGeneDiagnosisEssentialbasisofgenediagnosis遺傳物質(zhì)改變：一是DNA或RNA水平變化，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表達水平從低到高等；二是基因結(jié)構(gòu)變化即突變，如點突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活等。

Essentialbasisofgenediagnosis疾病或個體表型的本質(zhì)生物遺傳學(xué)基本規(guī)律分子生物學(xué)技術(shù)與方法第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)

ConceptofGeneDiagnosisHybridizationandPCRarebasictechniquesusedingenediagnosis（一）應(yīng)用核酸分子雜交可進行基因的特異識別和分析核酸雜交的基本原理：DenaturevsAnneal(Renature)第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)核酸變性和復(fù)性理論：（1）雙鏈DNA分子在某些理化因素作用下解旋，條件恢復(fù)后又可恢復(fù)其雙螺旋結(jié)構(gòu)；（2）具有互補堿基序列的異源核酸單鏈之間同樣可按堿基互補配對原則通過氫鍵結(jié)合為雙鏈。

核酸分子雜交和PCR擴增是基因診斷的基本技術(shù)

核酸雜交的基本過程：PreparationofSamplesandProbesPrehybridizationandHybridizationDetectionandAnalysisoftheResult第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)核酸分子雜交和PCR擴增是基因診斷的基本技術(shù)1.制備合適的探針是核酸雜交用于基因診斷的關(guān)鍵Whatisaprobe?標(biāo)記的已知序列核酸片段，包括DNA,cDNA,RNA,Oligonucleotide第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)針對具體情況選擇合適的探針序列是基因診斷準(zhǔn)確、特異、簡便、可靠的基礎(chǔ)。第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)核酸分子雜交和PCR擴增是基因診斷的基本技術(shù)2.不同形式的核酸分子雜交可用于不同的診斷目的

Southernblot

Northernblot

dothybridization

reversedothybridizationFISH:fluorescenceinsituhybridization2.不同形式的核酸分子雜交可用于不同的診斷目的

Southernblot一般過程：提取DNA→限制性內(nèi)切酶消化DNA以產(chǎn)生特定長度的片段→凝膠電泳分離（DNA分子有其獨特的限制性酶切圖譜，所以經(jīng)酶切消化和電泳分離后可在凝膠上形成特定的區(qū)帶）→變性處理→DNA轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合→預(yù)雜交及雜交→結(jié)果檢測與分析HybridizationandPCRarebasictechniquesusedingenediagnosis（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)

PrincipleofPolymeraseChainReaction第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)PCR原理示意圖

PCR是在試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化的反應(yīng)反復(fù)進行同一段DNA片段合成的過程（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)

N=N0(1+E）nN-擴增產(chǎn)物的量;N0-起始靶DNA分子數(shù)E-擴增效率；n-循環(huán)次數(shù)。理論上，從一個模板分子起始，經(jīng)過n次聚合反應(yīng)后可合成2n個分子。如進行30輪擴增，則可合成出230，即109個待檢分子；對一段500bp的DNA片段來說，約等于1μg。pgμg3.病毒性肺炎如冠狀病毒、腺病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒等。4.真菌性肺炎如白念珠菌、曲霉、放射菌等。5.其它病原體所致的肺炎如立克次體、弓形蟲、原蟲、寄生蟲如肺包蟲、肺吸蟲、肺血吸蟲）等。機體免疫力低下者（如艾滋病患者）容易伴發(fā)肺部卡氏肺包子蟲、軍團菌、鳥形分支桿菌、結(jié)核菌、弓形體等感染。6.理化因素所致的肺炎如放射性肺炎、胃酸吸入、藥物等引起的化學(xué)性肺炎等。7.支原體肺炎由肺炎支氣體引起。編輯本段發(fā)病原因

肺炎患肺炎的原因可能是：接觸到一些厲害的病菌或病毒身體抵抗力弱，如長期吸煙。上呼吸道感染時，沒有正確處理。例如是沒有正確地看醫(yī)生、沒有正確地看服藥，又或者是濫用止咳藥止咳以至痰和菌愈積愈多（Sputumretention)。如果一年內(nèi)有多過一次真正的肺炎（一些醫(yī)生誤看X光片或濫用了肺炎的診斷)，原因可能是：身體抵抗力弱（先天性或后天性)氣管有異物。尤其是幼童。心肺有其它病變：如癌病、氣管擴張、肺塵埃沉著病、沒有正確地看醫(yī)生、沒有正確地看服藥，又或者是濫用止咳藥止咳以至痰和菌愈積愈多（Sputumretention)工作環(huán)境有問題。注意改善空氣流通、冷氣系統(tǒng)。

打造最權(quán)威的專業(yè)課件醫(yī)學(xué)精品課件本文檔免費瀏覽閱讀，下載后可以編輯修改。（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)

PCR在基因診斷中的作用

從極少樣品即可擴增出肉眼可見的產(chǎn)物。放大待診信號，提高檢測靈敏度

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)

PCR及其衍生技術(shù)直接運用PCR擴增：異常缺失與存在PCR產(chǎn)物的限制性酶譜分析（PCR-RE)和限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP)RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphism

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)

PCR及其衍生技術(shù)PCR－RFLP：通過PCR將包含待測位點的DNA片段擴增后，用識別相應(yīng)位點的限制性核酸內(nèi)切酶水解，根據(jù)所產(chǎn)生限制性片段的數(shù)量和長度作出診斷。用于已知突變位點的驗證性診斷

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)

PCR及其衍生技術(shù)3.PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針斑點雜交(PCR-ASO，PCR-DB)

ASO:AlleleSpecificOligonucleotide1).wildprobevsmutantprobe2).已知突變的驗證性檢測3).可區(qū)分純合子和雜合子

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)

PCR及其衍生技術(shù)4.PCR產(chǎn)物的反向點雜交分析（PCR-RDB）

RDB:ReverseDotBlot固定探針

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)PCR及其衍生技術(shù)5.PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP)

將PCR產(chǎn)物變性為單鏈后進行非變性（中性）聚丙烯酰胺凝膠電泳，單個核苷酸的改變即可造成DNA單鏈構(gòu)象的改變，進而導(dǎo)致電泳速率變化，從而檢測出基因突變。1）單鏈核酸堿基-構(gòu)象-電泳速率2）中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR-SSCP分析原理示意（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)PCR及其衍生技術(shù)

6.PCR-變性梯度凝膠電泳分析（PCR-DGGE）DenaturingGradientGelElectrophoresis（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)PCR及其衍生技術(shù)7.甲基化特異性PCRMethylationspecificPCR,MS-PCR模板甲基化處理：Na2SO3C-U需設(shè)計特異性甲基化引物G:C/A:U3’GGACGTAGA5’非甲基化引物5’---CCTGCATCT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------CGCGATCCG---5’5’GCGCATGGC3’3’AAACATAAA5’甲基化引物5’---UUTGUATUT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------AUGUGATUU---5’5’TACACATAA3’3’GGACGTAGA5’5’---CCTGCmATCT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------CGCGATCmCmG---5’5’GCGCATGGC3’3’AAACATAAA5’5’---UUTGCmATUT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------UGUGATCmCmG--5’5’ACACATAAC3’若存在甲基化位點

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析Q-PCR,QuantitativePCR基本原理：PCR指數(shù)擴增規(guī)律N=N0(1+E）n

PCR擴增有限性-平臺期及平臺效應(yīng)（plateaueffect）PCR擴增的平臺效應(yīng)PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析（1）測定PCR產(chǎn)物量：

梯度（系列）稀釋法：先對已知量的靶DNA進行梯度稀釋（類似于比色）灰度掃描法

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)例：PCR產(chǎn)物定量PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析（2）極限稀釋法基本依據(jù)：PCR擴增的有效起始模板分子數(shù)為104～106個

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析（3）非競爭性對照法基本依據(jù)：同時擴增靶序列和內(nèi)標(biāo)序列（擴增效率相似）如看家基因（housekeeper)用于RT-PCR進行表達分析

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析（4）競爭抑制法需制備標(biāo)準(zhǔn)參照核酸

（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析（5）熒光標(biāo)記探針法分析：安全、簡便快捷、多重檢測

熒光定量PCR實時(realtime)PCRHybridizationandPCRarebasictechniquesusedingenediagnosis（三）DNA序列測定是最直接、最準(zhǔn)確的基因診斷技術(shù)第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)例：四色熒光自動測序分析結(jié)果病例SOX9基因HMGbox內(nèi)發(fā)生單堿基置換突變R178L(G→T)，如圖2所示，左側(cè)正常對照第225位堿基為C，而該患兒為A（反義鏈中）

例：序列分析用于基因診斷研究HybridizationandPCRarebasictechniquesusedingenediagnosis（四）DNA芯片技術(shù)是應(yīng)用前景廣闊的基因診斷技術(shù)（DNAchips)第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)生物芯片（biochip&bioarray)技術(shù)：根據(jù)生物分子間特異性相互作用，將生化分析過程集成于芯片表面，從而實現(xiàn)對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)等各種生物成分的高通量快速檢測分析。疾病診斷芯片個性化用藥芯片例：基因芯片雜交結(jié)果二.基因診斷有其獨特的優(yōu)點第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術(shù)高特異性：診斷目標(biāo)高靈敏度：分子生物學(xué)方法結(jié)果穩(wěn)定可靠：核酸的化學(xué)本質(zhì)早期診斷性：分子遺傳學(xué)規(guī)律應(yīng)用廣泛性：疾病與非疾病檢查第二節(jié)基因診斷策略在分子發(fā)病機制水平上對不同疾病的區(qū)分診斷策略各不相同第二節(jié)基因診斷策略不同的基因診斷策略致病基因檢測連鎖遺傳標(biāo)志檢測基因表達定量分析表型相關(guān)的系列基因克隆

CommonlyusedTechniquesSouthern印跡雜交限制性酶譜分析限制性片段長度多態(tài)性分析寡核苷酸探針雜交PCR及其衍生技術(shù)DNA芯片技術(shù)第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用前景第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用前景1.雜交基礎(chǔ)上的RFLP分析2.PCR及其衍生技術(shù)3.芯片陣列雜交基因診斷的發(fā)展歷史第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用前景1.理論2.技術(shù)3.倫理基因診斷的問題第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用前景However,genediagnosisispromisingindevelopment基因診斷技術(shù)途徑：①直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達是否異常的直接診斷途徑；②利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進行連鎖分析的間接診斷途徑。第四節(jié)遺傳病的基因診斷第四節(jié)遺傳病的基因診斷直接診斷：檢測已知致病基因必要條件①被檢基因的突變類型與疾病發(fā)病有直接的因果關(guān)系：②被檢基因的正常分子結(jié)構(gòu)已被確定；③被檢基因突變位點固定而且已知。1.點突變：（1）導(dǎo)致特異性限制性內(nèi)切酶位點改變

直接診斷：檢測已知致病基因鐮狀紅細(xì)胞貧血HBS-Beta株蛋白基因突變：

PCR-RE分析MstIICCTGAGG-CCTGTGGBeta株蛋白生成障礙性貧血-Beta株蛋白基因突變：PCR-RE分析MaeICAAG-CTAG1.點突變：（2）無限制性酶切位點改變直接診斷：檢測已知致病基因PCR-ASO斑點雜交或反向斑點雜交及等位基因特異PCR（allelespecificPCR，AS-PCR）或稱為等位基因特異性擴增（ASA）等技術(shù)。PCR-ASO斑點雜交或反向斑點雜交技術(shù)可快速、簡易地檢測已知突變。

反向點雜交示意：直接診斷：檢測已知致病基因在DNA序列上有較長一段序列的重新排布。包括大片段（數(shù)十個堿基甚至數(shù)千個堿基）的丟失、插入、取代、復(fù)制放大和倒位等，這些突變進而引起更大范圍內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)上的改變從而影響多個基因的功能，即染色體突變或畸變，包括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等2.基因重排：核酸分子探針雜交與PCR

（1）Southern印跡雜交、斑點雜交、原位雜交，通過設(shè)計一系列相應(yīng)于缺失區(qū)域的核苷酸探針，正常者出現(xiàn)雜交信號，而患者則因缺失這一區(qū)域，而檢測不到雜交信號（2）多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技術(shù)成功地同時擴增了人類杜氏肌營養(yǎng)不良蛋白基因的多個基因座

直接診斷：檢測已知致病基因3.基因表達異常mRNA的相對定量分析mRNA的絕對定量分析

mRNA長度分析直接診斷：檢測已知致病基因

Reversetranscription-PCR(RT-PCR)原理實時熒光定量RT-PCR（1）3.病毒性肺炎如冠狀病毒、腺病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒等。多種肺炎細(xì)菌均可引起大葉性肺炎，但絕大多數(shù)為肺炎鏈球菌，其中以Ⅲ型致病力最強。肺炎鏈球菌為革蘭陽性球菌，有莢膜，其致病力是由于高分子多糖體的莢膜對組織的侵襲作用。少數(shù)為肺炎桿菌、金黃*色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌等。肺炎鏈球菌為口腔及鼻咽部的正常寄生菌群，若呼吸道的排菌自凈功能及機體的抵抗力正常時，不引發(fā)肺炎。當(dāng)機體受寒、過度疲勞、醉酒、感冒、糖尿病、免疫功能低下等使呼吸道防御功能被削弱，細(xì)菌侵入肺泡通過變態(tài)反應(yīng)使肺泡壁毛細(xì)血管通透性增強，漿液及纖維素滲出，富含蛋白的滲出物中細(xì)菌迅速繁殖，并通過肺泡間孔或呼吸細(xì)支氣管向鄰近肺組織蔓延，波及一個肺段或整個肺葉。大葉間的蔓延系帶菌的滲出液經(jīng)葉支氣管播散所致。編輯本段臨床表現(xiàn)多數(shù)起病急驟，常有受涼淋雨、勞累、病毒感染等誘因，約1/3患病前有上呼吸道感染。病程7~10天。（一）寒戰(zhàn)、高熱：典型病例以突然寒戰(zhàn)起病，繼之高熱，體溫可高達39℃~40℃，呈稽留熱型，常伴有頭痛、全身肌肉酸痛，食量減少?？股厥褂煤鬅嵝涂刹坏湫?，年老體弱者可僅有低熱或不發(fā)熱。（二）咳嗽、咳痰：初期為刺激性干咳，繼而咳出白色粘液痰或帶血絲痰，經(jīng)1~2天后，可咳出粘液血性痰或鐵銹色痰，也可呈膿性痰，進入消散期痰量增多，痰黃而稀薄。（三）胸痛：多有劇烈側(cè)胸痛，常呈針刺樣，隨咳嗽或深呼吸而加劇，可放射至肩或腹部。如為下葉肺炎可刺激隔胸膜引起劇烈腹痛，易被誤診為急腹癥。（四）呼吸困難：由于肺實變通氣不足、胸痛以及毒血癥而引起呼吸困難、呼吸快而淺。病情嚴(yán)重時影響氣體交換，使動脈血氧飽和度下降而出現(xiàn)紫紺。打造最權(quán)威的專業(yè)課件本文檔免費瀏覽閱讀，下載后可以編輯修改。醫(yī)學(xué)精品課件實時熒光定量RT-PCR（2）間接診斷：檢測與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)志DNA多態(tài)性：指群體中的DNA分子存在至少兩種不同的類型，即個體間同一染色體的相同位置上DNA核苷酸序列存在一定的差異或變異。第四節(jié)遺傳病的基因診斷多態(tài)性在人群中出現(xiàn)的頻率應(yīng)大于1%（如小于1%常認(rèn)為是異常突變）。在生物進化過程中形成的，它本身并不致病或于遺傳病有直接聯(lián)系，故稱為“中性突變”。人類的23對染色體中，每一條上都帶有許多遺傳多態(tài)性位點，其中一些位點在染色體上的位置與致病基因靠的很近，甚至連鎖在一起遺傳，并且呈孟德爾式遺傳。因此，可利用這一多態(tài)性位點作為遺傳指示標(biāo)記。

第四節(jié)遺傳病的基因診斷間接診斷：檢測與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)志三代遺傳標(biāo)志：1.RFLP2.STR(shorttandemrepeats),VNTR(variablenumberoftandemrepeats)3.SNP(singlenucleotidepolymorphism)

間接診斷：檢測與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)志鐮狀紅細(xì)胞貧血HBSDNA指紋分析用于個體鑒定

人為什么長腫瘤物種的進化建立在基因突變的基礎(chǔ)之上，但是這必然也可能帶來副產(chǎn)品：人類惡性腫瘤的生長。這是人類進化必然要付出的代價。

我們要想根絕腫瘤，是不可能的。腫瘤發(fā)生是生物衰老在基因水平的機理之一，自然界不可能讓一個生物長生不死，生生不息。人的免疫功能減退，出現(xiàn)腫瘤，然后死亡，這是自然界宏觀的平衡調(diào)控機制起作用的結(jié)果，包含進化方面的積極意義，這就是為什么自然界要讓人類長腫瘤的原因。

群言堂第五節(jié)腫瘤的基因診斷當(dāng)前的一個誤區(qū)是對腫瘤過于偏激，聞癌色變，片面地把它當(dāng)作深惡痛絕的東西，導(dǎo)致治療上的誤區(qū)：想盡辦法去殺死它。利用放、化療技術(shù)殺死腫瘤細(xì)胞，結(jié)果把體內(nèi)很多良性細(xì)胞也殺死了。把80歲前病故的人都做一遍尸解，就會發(fā)現(xiàn)100%的人體內(nèi)都有腫瘤；人如果活到120歲，體內(nèi)會有3到4個惡性腫瘤，但不影響生活質(zhì)量。許多人不知道自己患有腫瘤，所以沒有精神恐懼和巨大的壓力。

第五節(jié)腫瘤的基因診斷70、80歲以后長腫瘤，屬生理現(xiàn)象，很正常；70歲以前長腫瘤則是是病理性的

腫瘤的危險主要在于發(fā)現(xiàn)得太晚，一旦發(fā)現(xiàn)就難以治愈，這樣給人們造成了極大的