第12專題-分子生物學技術在昆蟲分類學中發(fā)展

江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植保系王建國2023-11-03分子生物學技術在昆蟲分類學中的運用

唐覺教授對日本臭蟻的鑒定螞蟻分類專家—浙江大學唐覺教授來源：新技術在分類學上的運用幾乎每一次生物技術方法的進步都會被引入到昆蟲的分類中來.1電子顯微鏡和掃描電鏡帶來了超微形態(tài)學形態(tài)上可解決一些近似種的分類2血清學反響方法,同功酶分析3層析法電泳法4蛋白質(zhì)和氨基酸分析方法,5核酸的研究RAPD,RFLP,分子系統(tǒng)發(fā)育分析6數(shù)值分類法新的統(tǒng)計分析軟件使分類進入數(shù)理統(tǒng)計水平傳統(tǒng)形態(tài)分類技術和新技術的開展使分類工作進入一個高速開展的時代.傳統(tǒng)形態(tài)分類與現(xiàn)代分類技術的關系。DNA技術在昆蟲分類中的運用(見另章節(jié))紅火蟻標本實體,粘在三角紙上的干標本一種螞蟻的電子掃描圖象新技術在分類學上的運用(二)紅火蟻的頭部，示唇基中央齒熱帶火蟻的頭部，無唇基中央齒入侵紅火蟻的尾部蜇針高清晰顯微鏡的運用圖1圖2圖3電泳圖辣椒實蠅28號樣品30號樣品Hex：核酸固定陽性對照；CK+：實驗陽性對照，為酵母Y5基因；CK-：實驗陰性對照，探針為水溶液。辣椒實蠅28號，30號樣品理論雜交模式圖ProbeCK+CK-CK+HexHex辣椒實蠅28號，30號樣品實際雜交圖DNA模型目前，已經(jīng)定名的昆蟲有100多萬種，占動物的2／3，但是全世界仍約有9o％的昆蟲是未知種。隨著科學技術的進步以及各個學科的交叉滲透，已有200多年歷史的昆蟲分類學也獲得了極大的開展。常用的昆蟲分類技術一、形態(tài)學分類法〔分支--數(shù)值分類法〕二、行為學方法〔系統(tǒng)生物學〕三、遺傳學方法四、生化分類方法〔酯酶、同工酶等〕五、分子生物學方法一、形態(tài)學分類法形態(tài)學分類法是傳統(tǒng)的昆蟲分類方法中最根底的方法。該方法主要是根據(jù)形態(tài)結構與功能相一致的原理。以昆蟲的外部形態(tài)．內(nèi)部結構及各局部大小比例等特征為依據(jù)，對昆蟲進行分類鑒別。目前，昆蟲分類系統(tǒng)主要采用的形態(tài)學依據(jù)有：昆蟲的顏色和斑紋；翅的有無、性質(zhì)以及翅脈脈相：口器的類型及其在個體發(fā)育中的變化；觸角類型及節(jié)數(shù)：身體附屬物類型及其大??；馬氏管的數(shù)目；生殖器官及其他結構部位的形態(tài)特征。同時，昆蟲的變態(tài)類型、生活史、宿主范圍及地理分布都是重要的參考依據(jù)。但是傳統(tǒng)的形態(tài)學方法有不少的局限，例如一些昆蟲的形態(tài)特征不穩(wěn)定、同種異型和異種同型現(xiàn)象、近緣種，形態(tài)結構十分相似等問題。掃描電子顯微鏡熱帶火蟻Solenopsisgeminata電子顯微鏡電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡的問世，使昆蟲的形態(tài)學分類到達了超微結構水平。五、分子生物學方法目前，應用于昆蟲系統(tǒng)演化及分類鑒定方面的分子生物學技術主要有：RAPD技術、RFLP方法、DNA序列分析、分子雜交技術，SSCP方法及DSCP技術等。PCR技術聚合酶鏈式反響技術PCRPolymerasechainreaction1985年，KerryMullis創(chuàng)造了DNA聚合酶鏈式反響PCR(Polymerasechainreaction)技術，目前這一技術在分子生物學領域獲得了廣泛的應用，已經(jīng)在很大程度上代替了傳統(tǒng)的DNA克隆方法。利用PCR技術能夠從復雜的DNA分子群體中選擇性地復制一段特異的DNA序列，從而使某一DNA片段得到特異性的擴增；同時這一技術在昆蟲學領域也得到了廣泛的應用。PCR技術常與RAPD技術結合應用，如Kambhampati等(1992),應用RAPD-PCR技術對蚊蟲和蚜蟲進行了分子系統(tǒng)學的研究。Paskewitz(1993)用PCR技術識別按蚊種類。此外，RFLP、RARDPCR、DNAfp等方法也應用在同翅目蚜科、蟬科和葉蟬科等昆蟲的研究方面。直翅目蝗科、鞘翅目葉甲科、鱗翅目鳳蝶科等方面也有類似研究。1.RAPD標記技術RandomAmpifledPolymphicDNA隨機擴增多態(tài)性DNA。RAPD是由williams等1990年創(chuàng)造的一種遺傳標記方法，其原理是用隨機序列的9～10個核苷酸的引物，對基因組的DNA進行PCR擴增，再進行電泳別離和溴化乙錠染色。多態(tài)性的產(chǎn)生由互補核苷酸引物的堿基差異形成。RAPD要求對每個別離群體中的標記所進行的PCR擴增和電泳別離有高度的重復性，所以操作一般采用自動化。目前，RAPD已成為昆蟲遺傳圖譜構建中的一種普遍方法。我國近年來已在果蠅、蚊蟲、玉米螟、棉鈴蟲等昆蟲研究中應用RAPD技術在DNA分子水平上進行了研究，取得了一些成績。RAPD技術一出現(xiàn)，就被用于蚊蟲的分子系統(tǒng)學研究。孫珊、徐茂磊等應用RAPD方法對我國黑龍江、北京、陜西、浙江云南和新疆等6個地區(qū)的玉米螟種群進行了分析，并通過聚類分析為我國不同地區(qū)玉米螟的現(xiàn)代系統(tǒng)學研究提供了新的分類依據(jù)。吳厚永、趙彤言利用RAPD技術從DNA分子水平探討了尖音庫蚊復合組4個亞種的分化，結果說明，尖音庫蚊是原始的類群，而致倦庫蚊和淡色庫蚊是最為進化的類群。

RAPD標記技術論文1論文22.SCAR技術Sequence-characterizedAmplifiedRegion，SCAR特征序列擴增區(qū)域〔SCAR〕標記法標記通常是由RAPD標記轉(zhuǎn)化而來的。為了提高所找到的某一RAPD標記在應用上的穩(wěn)定性，可將該RAPD標記片段從凝膠上回收并進行克隆和測序，根據(jù)其堿基序列設計一對特異引物〔18-24堿基左右〕。也可只對該RAPD標記片段的末端進行測序，根據(jù)其末端序列，在原來RAPD所用的10堿基引物上增加相鄰的14個左右堿基，成為與原RAPD片段末端互補的特異引物。以此特異引物對基因組DNA再進行PCR擴增，便可擴增出與克隆片段同樣大小的特異帶。這種經(jīng)過轉(zhuǎn)化的特異DNA分子標記稱為SCAR標記。SCAR標記一般表現(xiàn)為擴增片段的有無，為一種顯性標記；但有時也表現(xiàn)為長度的多態(tài)性，為共顯性的標記。假設待檢DNA間的差異表現(xiàn)為擴增片段的有無，可直接在PCR反響管中參加溴化乙錠，通過在紫外燈下觀察有無熒光來判斷有無擴增產(chǎn)物，從而檢測DNA間的差異，這樣可省去電泳的步驟，使檢測變得方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個體。相對于RAPD標記，SCAR標記由于所用引物較長及引物序列與模板DNA完全互補，因此，可在嚴謹條件下進行擴增，結果穩(wěn)定性好、可重復性強。隨著研究工作的開展，會有越來越多重要作物農(nóng)藝性狀的SCAR標記被開發(fā)出來，它們將在分子標記輔助育種方面發(fā)揮巨大作用。3.RFLP技術RestrictionFragrnemLengthPolymorphism限制性片段長度多態(tài)RFLP是由于不同個體的等位基因之問堿基代換、重排、插人、缺失等引起的。限制性內(nèi)切酶能把很大的DNA分子降解成許多較小片段，所產(chǎn)生的DNA片段的數(shù)目和長度又反映了限制性內(nèi)切酶的切割位點在DNA分子上的分布。對于每一個DNA限制性內(nèi)切酶組合來說，它產(chǎn)生的片段是特異性的，因而它能夠作為含有這種DNA的生物所特有的“指紋fingerprint〞——DNA指紋(DNAfp)。當一個基因組比較小時，就可以將提純的DNA用限制內(nèi)切酶消化成各種不同長度的DNA片段，進行瓊脂糖凝膠電泳別離并用溴化乙錠染色后，可以在紫外燈下直接觀察多態(tài)性，但對于大分子DNA來說各種片段在電泳膠上連成一片，相互重疊，根本無法進行分辨，因此不能直接觀察限制性片段長度的多態(tài)性。要檢測大分子DNA的RFLP，就要借助分子雜交技術，用某一標記的DNA片段作為探針，與電泳后的DNA片段進行雜交，這樣，與探針片段有高度同源性的DNA片段就可以被檢測出來。目前典型的RFLP研究都選擇mtDNA進行。龍漫遠(1993)報道了選擇mtDNA進行RFLP研究獲得DNA限制性內(nèi)切酶圖譜以及片段長度多態(tài)性等的分析方法。趙惠燕等在同翅目昆蟲的分類方面也應用了同樣的分析方法。對于昆蟲來說，目前大多數(shù)mtDNA的限制性片段長度多態(tài)性研究都是在種內(nèi)或近緣種間進行，而科、屬等高級階元問的分析較少。Chapco(1994)用同樣的方法研究了l1種蝗蟲之間的演化關系。喬傳令等(1996)對庫蚊(Culexpipiens)的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)進行了研究，結果說明不同地理種群都有相同的單基因擴增，但在擴增水平上有較大差異。應用RFLP分析方法，使傳統(tǒng)的昆蟲分類區(qū)系及系統(tǒng)進化研究獲得了新的開展和飛躍，解決了一些用傳統(tǒng)分類方法無法解決的難題4.AFLP技術AmplifiedFragmentLengthPolymorphism擴增片段長度多態(tài)性一項新的分子標記技術，是基于PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。限制性片段用二種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。由于AFLP擴增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標記。AFLP可在一次單個反響中檢測到大量的片段。以說AFLP技術是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術5.SSCP技術Single-StrandConformationPolymor-phism，SSCP單鏈構象多態(tài)性檢測是一種基于DNA構象差異來檢測點突變的方法。相同長度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構象就不同，這樣就形成了單鏈構象多態(tài)性。單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構象，使構象發(fā)生改變，空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子別離開.作者稱該方法為單鏈構象多態(tài)性(Single-StrandConformationPolymor-phism，SSCP)分析.根本原理，都是依據(jù)DNA分子在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，其遷移率除與DNA的長短有關外，更主要的是取決于DNA鏈所形成的構象6.DSCP技術Double-StrandConformationalPolymorphism雙鏈構象多態(tài)性分析DSCP技術在昆蟲分類上的應用不多．在國內(nèi)未見有相關報道。SequenceandSequencing包括DNA的序列分析和RNA的序列分析。7.核酸序列分析技術在種內(nèi)或近緣種的系統(tǒng)發(fā)育關系確定方面，通常用進化較快的mtDNA核苷酸片段，對于科、屬等高級階元的系統(tǒng)發(fā)育研究中，通常用進化較慢的rDNA和rRNA核苷酸片段。現(xiàn)在許多昆蟲特別是雙翅目的果蠅、膜翅目的蜜蜂、直翅目的飛蝗等的mtDNA的序列已經(jīng)很清楚了，由于rRNA在昆蟲中分布廣泛，易于別離，且rRNA屬于慢速進化的基因，因此對不同昆蟲rRNA的序列分析可以廣泛地應用到科、屬等高級階元的系統(tǒng)發(fā)育研究。近年來，核酸序列分析方法與PCR及RFLP技術相結合，在昆蟲系統(tǒng)發(fā)育研究方面取得了一定成就。Chapco(1994)應用按酸序列分析方法對直翅目l1種蝗蟲的進化關系進行了研究。曹功杰(1988)對7種昆蟲的5SrRNA結構特點進行了比較研究。通過測定DNA，RNA的核苷酸順序，對昆蟲進行分類并構建其系統(tǒng)發(fā)育關系，有望在重要的農(nóng)、林、醫(yī)學昆蟲鑒定上發(fā)揮作用。當前核酸測序技術與RAP,PCR及RFLP相結合的綜合分析方法，既快速又準確，是今后昆蟲分子系統(tǒng)學研究的重要方向。8.DNA條碼技術DNAbarcoding

9.探針雜交技術Probe

探針核酸分子雜交即具有一定同源性的DNA單鏈分子或DNA單鏈分子與RNA分子，其互補的區(qū)段在去掉變性條件后能夠復性形成雙鏈DNA分子或DNA／RNA異質(zhì)雙鏈分子。核酸的分子雜交技術有不同的形式和方法，包括Southern分子雜交技術、Northern分子