生物急毒性檢測(cè)方法-米蝦靜水式法

生物急毒性檢測(cè)方法－米蝦靜水式法NIEAB905.12B一、方法概要

本方法主要係以多齒新米蝦（Neocaridinadenticulata）為試驗(yàn)生物，以靜水式生物毒性試驗(yàn)方法，檢測(cè)生物急毒性，並計(jì)算48小時(shí)之半數(shù)致死濃度（lethalconcentration50%,LC50）或急毒性單位（acutetoxicunit,TUa）。二、適用範(fàn)圍

本方法適用於地面水體、地下水體、放流水、廢水、污水、水源水質(zhì)及環(huán)境用藥之生物急毒性檢測(cè)。三、干擾(一) 生物馴養(yǎng)及毒性試驗(yàn)室內(nèi)若有化學(xué)氣體侵入、馴養(yǎng)水或稀釋水含有有毒物質(zhì)、器皿或試驗(yàn)容器未洗淨(jìng)致殘留有毒物質(zhì)，會(huì)影響米蝦健康且可能造成耐受性改變。(二) 試驗(yàn)生物有病或健康狀況不佳，影響耐受性。四、設(shè)備及材料(一) 多齒新米蝦：使用全長(zhǎng)（額角尖端至尾柄末端的長(zhǎng)度）0.5至0.8公分之多齒新米蝦幼苗（圖一及圖二），應(yīng)有適當(dāng)之物種證明或鑑定文件?？少?gòu)自養(yǎng)殖場(chǎng)、水族館等或自行繁殖。（註1）(二) 生物馴養(yǎng)及毒性試驗(yàn)室：須為獨(dú)立之空間，通風(fēng)良好，無(wú)化學(xué)氣體影響，且可屏蔽外界干擾（如噪音、震動(dòng)、強(qiáng)光、人為驚擾等）。馴養(yǎng)及試驗(yàn)區(qū)宜加以區(qū)分，以避免污染。光照強(qiáng)度同一般工作亮度。(三) 溫度控制設(shè)備：可使用循環(huán)式水浴槽、空調(diào)等方式，將馴養(yǎng)水溫及試驗(yàn)水溫控制在25±2℃。(四) 採(cǎi)樣容器：玻璃或塑膠材質(zhì)（如摺疊式水箱）。如使用塑膠材質(zhì)容器，不可重複使用。(五) 馴養(yǎng)容器：玻璃或塑膠材質(zhì)。(六) 試驗(yàn)容器：2L硼矽玻璃燒杯。(七) 量瓶及量筒：硼矽玻璃材質(zhì)。(八) 溫度監(jiān)測(cè)裝置：須可顯示毒性試驗(yàn)期間試驗(yàn)水樣之最高及最低溫度。(九) 溶氧測(cè)定儀。(十) pH計(jì)。(十一) 導(dǎo)電度計(jì)。(十二) 餘氯計(jì)。(十三) 水質(zhì)硬度計(jì)：亦可使用水質(zhì)硬度檢測(cè)試劑組。(十四) 分析天平：可精秤至0.1mg。(十五) 曝氣設(shè)備。(十六) 水循環(huán)過(guò)濾裝置：視需要。(十七) 手操網(wǎng)：大小合適之具握柄軟質(zhì)尼龍網(wǎng)。(十八) 米蝦飼料：建議使用市售沉底型蝦飼料。(十九) 解剖顯微鏡：米蝦鑑定用。五、試劑(一) 試劑水：比電阻值須大於10Megohms-cm。(二) 馴養(yǎng)水：可使用稀釋水、去氯自來(lái)水（註2）、無(wú)污染之地下水等作為馴養(yǎng)水。馴養(yǎng)水之硬度應(yīng)為80至100mgCaCO3/L，可混合適量之逆滲透水或試劑水進(jìn)行調(diào)整。(三) 稀釋水： 每1L之試劑水含下列成分（試藥級(jí)以上）： 碳酸氫鈉（NaHCO3）

96.0mg 七水硫酸鎂（MgSO4?7H2O）

123.0mg 氯化鉀（KCl）

4.0mg 二水硫酸鈣（CaSO4?2H2O）

60.0mg

可根據(jù)檢測(cè)需求量，依配方比例配製。20L稀釋水建議配製程序如下：１、 將碳酸氫鈉、七水硫酸鎂及氯化鉀加入18L試劑水中，曝氣隔夜使試藥充分溶解。２、 將二水硫酸鈣加入2L試劑水中，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙忉?，再加入前?8L液體中。

試藥完全溶解後，劇烈曝氣至少8小時(shí)，再測(cè)定硬度是否為80至100mgCaCO3/L。室溫下避光保存不宜超過(guò)14天。(四) 參考毒物：氯化鈉，試藥級(jí)以上。(五) 10%（v/v）鹽酸或硝酸：試藥級(jí)以上。(六) 丙酮：殘量級(jí)。六、採(cǎi)樣及保存(一) 放流水採(cǎi)樣方法參照「事業(yè)放流水採(cǎi)樣方法（NIEAW109）」之規(guī)定。水樣量至少7L。(二) 採(cǎi)樣時(shí)樣品容器應(yīng)裝至全滿，以減少揮發(fā)性物質(zhì)散失。採(cǎi)樣後立即避光保存於4±2℃。(三) 水樣必須在採(cǎi)樣後36小時(shí)內(nèi)開(kāi)始進(jìn)行確定試驗(yàn)。七、步驟(一) 試驗(yàn)準(zhǔn)備１、米蝦馴養(yǎng)：(１) 將多齒新米蝦自繁殖場(chǎng)等取回後，放入內(nèi)盛馴養(yǎng)水之馴養(yǎng)容器。(２) 馴養(yǎng)容器以曝氣設(shè)備曝氣，使溶氧維持在5mg/L以上。宜以水循環(huán)過(guò)濾裝置維護(hù)水質(zhì)，如有死蝦須立即移出。馴養(yǎng)容器內(nèi)需置放水草或網(wǎng)狀物等供米蝦棲息。(３) 馴養(yǎng)之水溫必須與毒性試驗(yàn)溫度一致，即25±2℃，光照時(shí)間應(yīng)維持在每天16±1小時(shí)。(４) 馴養(yǎng)時(shí)間至少7天，毒性試驗(yàn)開(kāi)始前7天內(nèi)，期間蝦苗死亡率不得超過(guò)10%。(５) 蝦苗成長(zhǎng)速度與馴養(yǎng)之密度及餵食狀況有關(guān)，須依實(shí)際情況調(diào)整馴養(yǎng)容器中蝦苗數(shù)量及餵食次數(shù)。(６) 馴養(yǎng)時(shí)若飼料充足，則大小米蝦不會(huì)互相殘食，可大小混養(yǎng)在一起。亦可將已抱卵之米蝦移至另一馴養(yǎng)容器飼養(yǎng)，待其自然孵化後馴養(yǎng)至試驗(yàn)用之大小。(７) 試驗(yàn)用米蝦全長(zhǎng)應(yīng)為0.5至0.8公分。２、試驗(yàn)容器及相關(guān)器材之清洗：(１) 新的塑膠器皿，使用前須用稀釋水潤(rùn)洗1次。(２) 新的玻璃器皿，須用新鮮配製之10%（v/v）鹽酸或硝酸浸泡一夜後，再用試劑水沖洗乾淨(jìng)。使用前以稀釋水潤(rùn)洗1次。(３) 接觸過(guò)樣品的玻璃器皿（如試驗(yàn)容器、量筒等），如需重複使用，則必須依下列步驟清洗：(a) 自來(lái)水浸泡15分鐘後，用清潔劑清洗內(nèi)壁，再以自來(lái)水沖洗2次。亦可使用洗瓶機(jī)清洗。(b) 以新鮮配製之10%（v/v）鹽酸或硝酸潤(rùn)洗1次。(c) 以試劑水潤(rùn)洗2次。(d) 以丙酮潤(rùn)洗1次。(e) 以試劑水沖洗3次。(f) 進(jìn)行毒性試驗(yàn)前，再以稀釋水潤(rùn)洗1次。``３、試驗(yàn)前之水樣準(zhǔn)備：(１) 先將水樣靜置半小時(shí)，待粗顆粒沈降後，再取上層液進(jìn)行試驗(yàn)。(２) 水樣溫度須調(diào)整至25±2℃。若回溫後溶氧低於3.0mg/L，應(yīng)對(duì)水樣溫和曝氣，使溶氧升至3.0mg/L以上。(二) 範(fàn)圍尋找試驗(yàn)（range-findingtest）１、 若不確定樣品之半數(shù)致死濃度落於哪一濃度範(fàn)圍，可先進(jìn)行範(fàn)圍尋找試驗(yàn)。放流水生物急毒性檢測(cè)則不須進(jìn)行範(fàn)圍尋找試驗(yàn)。２、 建議可將水樣或環(huán)境用藥以稀釋水適度進(jìn)行10倍序列稀釋。每一濃度之試驗(yàn)水樣體積須1L以上，以1個(gè)試驗(yàn)容器盛裝。３、 每一濃度之試驗(yàn)生物總數(shù)均為5隻。以手操網(wǎng)將經(jīng)馴養(yǎng)且全長(zhǎng)0.5至0.8公分之米蝦移入試驗(yàn)容器，每個(gè)容器各放5隻。４、試驗(yàn)期間米蝦不得餵食，水溫應(yīng)控制在25±2℃，光照應(yīng)維持每天16±1小時(shí)。５、 觀察8至24小時(shí)，記錄米蝦存活數(shù)量並移出死亡之米蝦。試驗(yàn)結(jié)果作為確定試驗(yàn)稀釋方式之參考。(三) 確定試驗(yàn)（definitivetest）１、 將水樣或環(huán)境用藥以稀釋水適度稀釋為5個(gè)濃度，相鄰濃度之稀釋倍數(shù)不得超過(guò)2倍。放流水則以5個(gè)固定濃度進(jìn)行試驗(yàn)（100%、80%、60%、40%及20%）。每一濃度之試驗(yàn)水樣，總體積須2L以上，以2個(gè)試驗(yàn)容器平均盛裝。２、 稀釋完成後，檢測(cè)最高濃度試驗(yàn)水樣之pH、溶氧、導(dǎo)電度及餘氯。另須檢測(cè)稀釋水之pH及導(dǎo)電度。３、 每一濃度之試驗(yàn)生物總數(shù)均為20隻。以手操網(wǎng)將經(jīng)馴養(yǎng)且全長(zhǎng)0.5至0.8公分之米蝦移入試驗(yàn)容器，每個(gè)容器各放10隻。４、 空白試驗(yàn)則取2個(gè)試驗(yàn)容器，分別盛裝至少1L之100%稀釋水，以手操網(wǎng)各放入10隻經(jīng)馴養(yǎng)且全長(zhǎng)0.5至0.8公分之米蝦。５、 試驗(yàn)期間為48小時(shí)，水溫應(yīng)控制在25±2℃，光照應(yīng)維持每天16±1小時(shí)。試驗(yàn)期間米蝦不得餵食。６、 開(kāi)始試驗(yàn)後，至少於第2、24及48小時(shí)，觀察及移出死亡之米蝦並記錄米蝦存活數(shù)量。７、 結(jié)束試驗(yàn)後，須測(cè)量並記錄最高濃度試驗(yàn)水樣之溶氧及pH，並記錄試驗(yàn)期間之最高及最低水溫。八、結(jié)果處理(一) 死亡判定：死亡之判定須符合下列二條件：１、 觸鬚及鰓的活動(dòng)停止。２、 蝦體經(jīng)輕觸沒(méi)反應(yīng)。(二) 48小時(shí)LC50之計(jì)算：１、 計(jì)算各試驗(yàn)濃度之48小時(shí)米蝦死亡總數(shù)及米蝦死亡百分率：

米蝦死亡總數(shù)＝20－（2個(gè)試驗(yàn)容器之米蝦存活數(shù)量加總）

米蝦死亡百分率＝米蝦死亡總數(shù)÷20×100%２、(三) 放流水之48小時(shí)TUa計(jì)算１、TUa為L(zhǎng)C50之倒數(shù)，即

TUa=100%÷（48小時(shí)LC50）２、若放流水水樣5個(gè)濃度之米蝦死亡百分率均小於50%，則48小時(shí)之LC50>100%，換算之TUa<1.00。３、若放流水水樣5個(gè)濃度之米蝦死亡百分率均大於50%，則48小時(shí)之LC50<20%，換算之TUa>5.00。４、若結(jié)果數(shù)據(jù)不符合前述2種狀況，則依八、(一)之方法計(jì)算48小時(shí)LC50，再換算TUa。九、品質(zhì)管制(一) 試驗(yàn)蝦種必須確認(rèn)為多齒新米蝦，不可混合其他品種。(二) 執(zhí)行毒性試驗(yàn)後之試驗(yàn)生物須廢棄，不得重複使用。(三) 初始毒性試驗(yàn)：依本方法執(zhí)行生物急毒性試驗(yàn)之實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)先以氯化鈉進(jìn)行初始毒性試驗(yàn)，以證明該實(shí)驗(yàn)室之試驗(yàn)結(jié)果具備良好之穩(wěn)定性。初始毒性試驗(yàn)之執(zhí)行方式如下：１、以氯化鈉進(jìn)行至少5次毒性試驗(yàn)。２、 前述毒性試驗(yàn)每次皆應(yīng)使用相同之試驗(yàn)濃度：氯化鈉以稀釋水溶解並適度稀釋為5個(gè)不同濃度，相鄰濃度之稀釋倍數(shù)不得超過(guò)2倍。5個(gè)濃度中，至少須有2個(gè)會(huì)造成試驗(yàn)生物部分死亡。３、 求取其LC50平均值及變異係數(shù)（coefficientofvariation,CV）。生物試驗(yàn)之CV值不得超過(guò)50%。(四) 空白試驗(yàn)：每次毒性試驗(yàn)應(yīng)至少伴隨一空白試驗(yàn)。若空白試驗(yàn)之死亡率超過(guò)10%，則該次毒性試驗(yàn)之試驗(yàn)結(jié)果不可採(cǎi)用，必須重做。(五) 參考毒物試驗(yàn)：１、執(zhí)行毒性試驗(yàn)期間，每個(gè)月至少執(zhí)行一次參考毒物試驗(yàn)。２、 參考毒物試驗(yàn)濃度須與初始毒性試驗(yàn)一致。試驗(yàn)結(jié)果（LC50）須建立品質(zhì)管制圖，建立方法參考「環(huán)境檢驗(yàn)品質(zhì)管制圖建立指引（NIEA-PA105）」之第4節(jié)，但管制上下限為±2SD。若最近20次參考毒物試驗(yàn)結(jié)果，有2次以上超出管制上下限，則須檢討誤差來(lái)源、執(zhí)行矯正措施並重新進(jìn)行參考毒物試驗(yàn)。十、精密度及準(zhǔn)確度 單一實(shí)驗(yàn)室以氯化鈉進(jìn)行生物急毒性試驗(yàn)結(jié)果，48小時(shí)LC50之平均值為4.01g/L，變異係數(shù)為14.7%（n＝5）。十一、參考資料(一) USEPA.2002.MethodsforMeasuringtheAcuteToxicityofEffluentsandReceivingWaterstoFreshwaterandMarineOrganisms.5thed.OfficeofWater,U.S.EnvironmentalProtectionAgency,Washington,DC.EPA-821-R-02-012.(二) APHA.2005.StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater,21stEdition,Section8711.AmericanPublicHealthAssociation,Washington,D.C.(三) OECD.1992.GuidelineforTestingofChemicals,TestNo.203:Fish,AcuteToxicityTest(四) 陳弘成，魚(yú)類毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法之研究，EPA-83-E3S5-09-03-02，1994。(五) 李俊宏、柳家瑞，魚(yú)類急毒性試驗(yàn)研究，環(huán)保署環(huán)境檢驗(yàn)所環(huán)境調(diào)查研究年報(bào)第2號(hào)，1994。(六) 施志昀、游祥平，臺(tái)灣的淡水蝦，國(guó)立海洋生物博物館籌備處，1998。註1：生物屍體之清除及處理，依一般事業(yè)廢棄物相關(guān)規(guī)定辦理。註2：自來(lái)水可使用活性碳過(guò)濾或曝氣等方式去氯，但不可使用化學(xué)藥劑去氯。

圖一多齒新米蝦(a) 額角上緣前端約1/5範(fàn)圍內(nèi)不具額齒(b) １、雄性第一腹足澎大呈梨形２、第二對(duì)腹足澎大而厚，並密生剛毛

圖二多齒新米蝦鑑定特徵

圖三48小時(shí)LC50之計(jì)算流程圖

附錄LC50計(jì)算方法一、機(jī)率單位法(一) 使用條件１、 5個(gè)試驗(yàn)濃度之死亡百分率，須有至少一個(gè)≧50%，及至少一個(gè)≦50%。２、 5個(gè)試驗(yàn)濃度須有2個(gè)或2個(gè)以上的濃度有部分死亡的情形，也就是死亡百分率數(shù)據(jù)須有至少2個(gè)大於0且小於100%。(二) 計(jì)算步驟１、 可使用程式probit.exe進(jìn)行計(jì)算（可參考美國(guó)環(huán)保署網(wǎng)站/eerd/stat2.htm#tsk）。２、 probit.exe之輸入範(fàn)例如圖1，輸出結(jié)果如圖2。本程式之結(jié)果輸出檔為文字檔，內(nèi)容包含異質(zhì)性之卡方檢定結(jié)果（Chi-squaretestforheterogeneity）及LC50計(jì)算結(jié)果。計(jì)算所得之卡方值（Chi-squareforheterogeneity(calculated)）須小於查表值（tabularvalueat0.05level），LC50之計(jì)算結(jié)果才可採(cǎi)用。３、 若數(shù)據(jù)輸入後出現(xiàn)Overflow或錯(cuò)誤訊息、結(jié)果輸出檔呈現(xiàn)錯(cuò)誤訊息、或計(jì)算所得之卡方值未小於查表值，則改用史丕曼－卡伯法進(jìn)行計(jì)算。(三) 範(fàn)例１、 若結(jié)果數(shù)據(jù)如表1之結(jié)果1，因試驗(yàn)濃度40%及60%出現(xiàn)部分死亡情形，故使用機(jī)率單位法進(jìn)行計(jì)算。２、 執(zhí)行probit.exe檔，數(shù)據(jù)輸入如圖1，結(jié)果如圖2。(１) 計(jì)算所得之卡方值（5.151）小於查表值（7.815），故機(jī)率單位模式適用於此組數(shù)據(jù)。(２) LC50為56%，TUa為1.79。二、史丕曼－卡伯法及史丕曼－卡伯修正法(一) 使用條件１、 5個(gè)試驗(yàn)濃度之死亡百分率數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)平滑化及調(diào)整後，須有至少一組≧50%，及至少一組≦50%。２、 5個(gè)試驗(yàn)濃度之死亡百分率數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)平滑化及調(diào)整後，必須有1個(gè)或1個(gè)以上的濃度有部分死亡的情形。３、 若最低濃度之平滑調(diào)整死亡百分率為0%，且最高濃度之平滑調(diào)整死亡百分率為100%，則使用史丕曼－卡伯法。若不符合前述條件，則使用史丕曼－卡伯修正法。(二) 計(jì)算步驟１、 可使用程式tsk.exe進(jìn)行計(jì)算（可參考美國(guó)環(huán)保署網(wǎng)站/eerd/stat2.htm#tsk）。２、 tsk.exe之輸入範(fàn)例如圖3，輸出結(jié)果如圖4。本程式會(huì)自動(dòng)進(jìn)行死亡百分率數(shù)據(jù)之平滑化及調(diào)整，而結(jié)果輸出內(nèi)容包含SPEARMAN-KARBERTRIM之?dāng)?shù)值及LC50計(jì)算結(jié)果。(１) 若SPEARMAN-KARBERTRIM之?dāng)?shù)值為0%，代表計(jì)算時(shí)使用史丕曼－卡伯法。(２) 若SPEARMAN-KARBERTRIM之?dāng)?shù)值非0%，代表計(jì)算時(shí)使用史丕曼－卡伯修正法。(三) 範(fàn)例１、 若結(jié)果數(shù)據(jù)如表1之結(jié)果2，雖然試驗(yàn)濃度40%及100%出現(xiàn)部分死亡情形，但機(jī)率單位法無(wú)法計(jì)算，故使用史丕曼－卡伯法或史丕曼－卡伯修正法進(jìn)行計(jì)算。２、 執(zhí)行tsk.exe檔，數(shù)據(jù)輸入如圖3，結(jié)果如圖4。(１) 計(jì)算所得之SPEARMAN-KARBERTRIM為20.51%，代表計(jì)算時(shí)使用史丕曼－卡伯修正法。(２) LC50為92%，TUa為1.09。三、圖解法：適用於各濃度均無(wú)部分死亡的情形。(一) 5個(gè)試驗(yàn)濃度之死亡百分率數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)平滑化及調(diào)整後，須有至少一組≧50%，及至少一組≦50%。(二) 計(jì)算步驟１、 將死亡百分率數(shù)據(jù)平滑化：(１) 假設(shè)空白試驗(yàn)之死亡百分率為p0，而樣品5個(gè)濃度之死亡百分率依序?yàn)閜1、p2、……、p5（由低濃度至高濃度）。若死亡百分率未依循p0≦……≦p5之順序，則必須進(jìn)行平滑化。(２) 進(jìn)行平滑化時(shí)，將不符合上述順序之相鄰死亡百分率加總後平均，再以平均值取代原有之死亡百分率。

舉例來(lái)說(shuō)，若p1＝p2＝p3＜p0＜p4＝p5，則不符順序之?dāng)?shù)據(jù)為p0、p1、p2、p3。此時(shí)需進(jìn)行數(shù)據(jù)平滑化，將p0至p3加總平均，並以平滑後之死亡百分率取代原有之p0至p3：p0s＝p1s＝p2s＝p3s＝(p0＋p1＋p2＋p3)/4。２、 死亡百分率調(diào)整：完成死亡百分率平滑化後，若p0s≠0，則將樣品各濃度之死亡百分率依據(jù)p0s加以調(diào)整。 pia＝(pis－p0s)/(1－p0s) pia：稀釋樣品i之調(diào)整死亡百分率 pis：稀釋樣品i之平滑化死亡百分率 p0s：空白試驗(yàn)之平滑化死亡百分率３、 將樣品濃度（對(duì)數(shù)座標(biāo)軸）對(duì)調(diào)整死亡百分率（線性座標(biāo)軸）作圖。找出括住50%之兩點(diǎn)，畫(huà)一直線。找出此一直線上死亡百分率為50%時(shí)之濃度值，即為L(zhǎng)C50。(三) 範(fàn)例１、 若結(jié)果數(shù)據(jù)如表1之結(jié)果3，死亡百分率計(jì)算結(jié)果