無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)

無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)無(wú)菌動(dòng)物(germ-free,GF)是指身體任何部位及生活環(huán)境中均檢測(cè)不出任何活的細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲(chóng)的動(dòng)物［1］。無(wú)菌動(dòng)物來(lái)源于剖腹產(chǎn)和胚胎移植，通過(guò)人工飼養(yǎng)，維護(hù)在正壓無(wú)菌隔離器中的動(dòng)物［2］。所有的飼料、墊料及水均經(jīng)滅菌處理，檢測(cè)無(wú)菌后方可傳入無(wú)菌隔離器內(nèi)。維持無(wú)菌動(dòng)物需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作技術(shù)和定期的無(wú)菌檢測(cè)。由于不攜帶任何可檢測(cè)的微生物，可排除背景微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,獲得高重復(fù)性，高敏感度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這種動(dòng)物可以有選擇性的接種多菌和單菌，來(lái)研究菌種對(duì)宿主的作用［3］。無(wú)菌動(dòng)物不是絕對(duì)無(wú)菌,而是相對(duì)無(wú)菌。在現(xiàn)有的無(wú)菌檢測(cè)技術(shù)下檢測(cè)不到任何微生物［4］。1928年至IJ1980年,Reyniers等［5-6］與Knight等［7］證實(shí)了哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)、魚(yú)、昆蟲(chóng)等可在無(wú)菌條件下飼養(yǎng)和維持。也是他們建立了第一代無(wú)菌大鼠和無(wú)菌小鼠。 1945年美國(guó)圣母大學(xué)Lobund實(shí)驗(yàn)室的Reyniers等［5］首次培育出能連續(xù)傳代的無(wú)菌大鼠，接著Gustafsson［8］也成功培育無(wú)菌大鼠。Gilbert等［9］通過(guò)去除動(dòng)物中不同微生物的方法來(lái)研究其與宿主的關(guān)系。Kirk［10］對(duì)微生物與宿主的關(guān)系做了詳細(xì)的闡述。微生物的質(zhì)量控制成為無(wú)菌動(dòng)物培育中至關(guān)重要的技術(shù)。從過(guò)去到現(xiàn)在，細(xì)菌、真菌的培養(yǎng)和革蘭染色鏡檢仍然是最常用的方法［11-13］。但在人工培養(yǎng)基上,由于條件限制，有些微生物不能生長(zhǎng)，這就導(dǎo)致了無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。為此有些實(shí)驗(yàn)室增加了分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)PCR,利用16SrRNA進(jìn)行細(xì)菌的鑒定，用以彌補(bǔ)上述兩種檢測(cè)方法中的不足［13］。本文將結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)方法及影響因素進(jìn)行簡(jiǎn)要探討。1微生物培養(yǎng)1.1采樣1.1.1糞便標(biāo)本的采集選取無(wú)菌隔離器內(nèi)健康成年無(wú)菌大鼠抓取尾巴讓糞便自然排出，棄去第一粒糞便。收取第二粒新鮮糞便裝于無(wú)菌小試管中。按照無(wú)菌操作程序從隔離器中傳出，并盡快接種完畢，防止在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中細(xì)菌死亡。1.1.2隔離器內(nèi)環(huán)境標(biāo)本的采集將無(wú)菌隔離器內(nèi)滅菌棉簽用無(wú)菌水浸濕，擦拭水瓶口、進(jìn)出通風(fēng)口、隔離器內(nèi)壁、籠具表面、動(dòng)物毛發(fā)、手套等。裝于無(wú)菌小試管中，按照無(wú)菌操作程序從隔離器中傳出。棉簽必須使用高壓蒸汽滅菌，干熱滅菌會(huì)使脫脂棉產(chǎn)生殺菌物質(zhì)，影響細(xì)菌的檢出。1.1.3飼料、墊料及水標(biāo)本的采集將無(wú)菌隔離器內(nèi)飼料、墊料、水均取適量裝于無(wú)菌小試管中才安照無(wú)菌操作程序從隔離器中傳出。1.2細(xì)菌、真菌培養(yǎng)1.2.1國(guó)內(nèi)無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)污染無(wú)菌動(dòng)物的微生物主要是厭氧菌、需氧菌及真菌，可以通過(guò)不同的培養(yǎng)基、不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)環(huán)境對(duì)污染菌進(jìn)行檢測(cè)。目前我國(guó)無(wú)菌動(dòng)物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)GB/T14926.41-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)菌動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法》，該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定無(wú)菌檢測(cè)中所使用的培養(yǎng)基及試劑、檢測(cè)程序、操作步驟及結(jié)果報(bào)告等。3種液體培養(yǎng)基為腦心浸液肉湯(brainheartinfusionbroth,BHI)、硫乙醇酸鈉肉湯(thioglycollatebroth,TB)、大豆蛋白陳肉湯(trypticsoybrothJSB),l種固體培養(yǎng)基血瓊脂平板，試劑為無(wú)菌生理鹽水。標(biāo)本采集后才妾種腦心浸液肉湯和硫乙醇酸鈉肉湯、大豆蛋白陳肉湯增菌培養(yǎng)，放37。(2培養(yǎng),分別以7、14d轉(zhuǎn)接血平板并革蘭染色鏡檢。轉(zhuǎn)接血平板后37(培養(yǎng)48h,觀察有無(wú)細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)，最終判斷是否存在細(xì)菌、真菌污染。止匕標(biāo)準(zhǔn)刪除了GB/T14926.41-1994《無(wú)特定病原體動(dòng)物無(wú)菌動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法》中的無(wú)特定病原體動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法，保留了無(wú)動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法。增加了硫乙醇酸鈉培養(yǎng)基在使用前需煮沸驅(qū)氧程序。再?gòu)囊后w培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種血瓊脂平皿時(shí)增加了涂片染色鏡檢。以防止在轉(zhuǎn)種時(shí)細(xì)菌死亡而不能在平板培養(yǎng)基生長(zhǎng)而造成漏檢。GB/T14926.43-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、染色法、培養(yǎng)基和試劑》，該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)培養(yǎng)基的配制、分裝、高壓滅菌條件、儲(chǔ)藏條件及使用期限作了規(guī)定。1.2.2國(guó)內(nèi)無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)標(biāo)本采集數(shù)量、標(biāo)本稀釋程度、標(biāo)本存放及接種時(shí)間都未做詳細(xì)規(guī)定。檢測(cè)時(shí)未對(duì)需氧、厭氧培養(yǎng)進(jìn)行區(qū)分。對(duì)培養(yǎng)基的接種管數(shù)及陽(yáng)性對(duì)照菌未詳細(xì)規(guī)定。冷藏后培養(yǎng)基需怎樣處理后使用未做詳細(xì)規(guī)定。微生物培養(yǎng)方法被認(rèn)為是有一定局限性的，三種培養(yǎng)基不能培養(yǎng)所有微生物。好多哺乳動(dòng)物的腸道微生物在實(shí)驗(yàn)室里不容易培養(yǎng)，主要缺乏合適的培養(yǎng)基和方法。培養(yǎng)鑒定微生物污染技術(shù)較繁瑣和困難。嚴(yán)格的厭氧菌培養(yǎng)需要特殊的設(shè)備和專業(yè)的操作。腦心浸液肉湯適合細(xì)菌的增菌培養(yǎng)，大部分需氧菌、兼性厭氧菌都能生長(zhǎng)，如糞性鏈球菌、大腸埃希菌及苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)。硫乙醇酸鈉肉湯適合需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌的培養(yǎng)，主要用于厭氧菌的培養(yǎng)。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基在2000年、2005年及2015年版中國(guó)藥典中被用作無(wú)菌檢查培養(yǎng)基，歐洲藥典(EP)、日本藥典(JP)、英國(guó)藥典(BP)、美國(guó)藥典(USP)無(wú)菌檢查也均采用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酒己方一致，用于需氣菌、兼性厭氧菌、厭氣菌的培養(yǎng)。檢查也均采用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酒己方一致，用于需氣菌、兼性厭氧菌、厭氣菌的培養(yǎng)。雖然硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基被各國(guó)用作無(wú)菌檢查，但它自身也存在一定的局限性 :14］:⑴一些苛養(yǎng)菌或強(qiáng)致病菌較難檢出；(2)刃天青對(duì)微生物有抑制作用、與專門(mén)的厭氧菌培養(yǎng)方法如厭氧缸法、厭氧袋(bio-bag)、厭氧手套箱(anaerobieglovebox)、厭氧盒等相比較，其厭氧環(huán)境有限。革蘭染色鏡檢也存在各種干擾因素，如飲食中的蔬菜纖維、糞便中的各種物質(zhì)、食物中留下的死菌。無(wú)法鑒別是死菌或活菌，需要培養(yǎng)方法來(lái)確認(rèn):15］。革蘭染色陽(yáng)性細(xì)菌相對(duì)容易檢出和觀察，而體積較小的革蘭陰性球菌則較難觀察到。革蘭染色鏡檢的檢出限量約109CFU/g糞便［16］。對(duì)于無(wú)菌動(dòng)物來(lái)說(shuō)，污染初期腸道中微生物是比較少的，易受到糞便中的殘?jiān)?、碎屑等因素的干擾。對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的觀察者來(lái)說(shuō)也是非常極具挑戰(zhàn)性的，極易造成漏檢?？傊?，革蘭染色鏡檢的確定是對(duì)檢測(cè)靈敏度較低、易造成漏檢，優(yōu)點(diǎn)時(shí)即時(shí)出結(jié)果、速度較快、操作簡(jiǎn)便、成本較低。1.2.3中國(guó)藥典(2015版)無(wú)菌檢查相較于國(guó)內(nèi)動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)，中國(guó)藥典無(wú)菌檢測(cè)方法相對(duì)比較全面，但僅適用醫(yī)藥用品。目前,美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)家或組織無(wú)菌檢查法已協(xié)調(diào)一致口刀。相比于2010版中國(guó)藥典,2015版中國(guó)藥典對(duì)無(wú)菌檢測(cè)法的的檢測(cè)范圍及環(huán)境要求、培養(yǎng)體系、方法適用性、檢查方法等做了進(jìn)一步完善才妾近國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)。2015版中國(guó)藥典中規(guī)定了無(wú)菌檢查必須在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無(wú)菌的要求。培養(yǎng)基主要使用硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基。硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng);胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基主要用于PH=（7.3±0.2）接近中性,適用于需氧菌和真菌的培養(yǎng):18-20］。藥典規(guī)定了培養(yǎng)基PH測(cè)定的溫度應(yīng)在25。配細(xì)培養(yǎng)的溫度在20?25（和30?35。。符合了大部分微生物的需求。規(guī)定了微生物的培養(yǎng)時(shí)間化。［21］。規(guī)定了培養(yǎng)基的接種管數(shù)，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照菌的選擇做了細(xì)1.2.4國(guó)外無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)國(guó)外無(wú)菌檢測(cè)所使用的培養(yǎng)基各不相同，培養(yǎng)時(shí)間和方法也不統(tǒng)一。國(guó)外無(wú)菌小鼠無(wú)菌檢測(cè)使用培養(yǎng)基有LB培養(yǎng)基（LB）、沙保培養(yǎng)基、腦心浸液（brainheartinfusionbroth,BHI）、MRS瓊脂培養(yǎng)基、ML瓊脂培養(yǎng)基［22］。取1mL標(biāo)本懸液接種在BHI、MRS、ML、LB培養(yǎng)基37V培養(yǎng)72h,沙保培養(yǎng)基22P培養(yǎng)3周。標(biāo)本懸液直接涂片鏡檢。也有報(bào)道使用腦心浸液肉湯（需氧菌培養(yǎng)）、硫乙醇酸鈉肉湯（厭氧菌培養(yǎng)）、沙保肉湯（真菌培養(yǎng)）,37（培養(yǎng)1周甚至更長(zhǎng)，以防生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌漏檢。血平板和其它非選擇性培養(yǎng)基 37°C至少培養(yǎng)5do推薦接種一份標(biāo)本于稍低溫度培養(yǎng)，比如3CTC或室溫，更適合環(huán)境微生物的生長(zhǎng)［15］;也有研究推薦增加56P培養(yǎng)［23］。液體培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁再接種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)和顯微鏡鏡檢。渾濁可能接種后幾天出現(xiàn)，但不一定是細(xì) 生長(zhǎng),有可能是糞便和其它有機(jī)物沉淀。此法與國(guó)內(nèi)無(wú)菌動(dòng)物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)所使用培養(yǎng)基基本一致。有研究使用腦心浸液肉湯'沙保肉湯以及營(yíng)養(yǎng)肉湯作為無(wú)菌檢測(cè)培養(yǎng)基［11］，需氧和厭氧兩種環(huán)境37P培養(yǎng)48h。兩種環(huán)境下培養(yǎng)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。最好使用厭氧菌來(lái)確定無(wú)氧環(huán)境。國(guó)外無(wú)菌檢測(cè)的內(nèi)容和方法包括:⑴直接涂片鏡檢法:當(dāng)無(wú)菌動(dòng)物腸道中有大量細(xì)菌繁殖時(shí)，可以利用相差顯微鏡快速的檢測(cè)腸道中的細(xì)菌,但因?yàn)榇朔?xì) 未經(jīng)染色，會(huì)對(duì)有些比較小和鏡檢:包括革蘭染色鏡檢、DNA染色法。（3）細(xì)菌、真菌培養(yǎng)。（4）分子生物學(xué)檢測(cè)。（5）病毒學(xué)檢測(cè)。（6）寄生蟲(chóng)學(xué)檢測(cè)［15］。1.2.5無(wú)菌檢測(cè)培養(yǎng)方法的局限性傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法，容易培養(yǎng)的是需氧和兼性厭氧菌，只占腸道細(xì)菌總量的小部分。比如乳酸桿菌、鏈球菌、腸球菌和葡萄球菌等。但是嚴(yán)格厭氧菌在腸道細(xì)菌中所占的比例極高，每克糞便中含1011個(gè)嚴(yán)格厭氧菌。通過(guò)培養(yǎng)容易檢測(cè)的嚴(yán)格厭氧菌的比例約每克糞便106個(gè)，甚至更低［15］。雖然微生物培養(yǎng)是比較敏感的方法，但它有一定的檢出限量，當(dāng)腸道細(xì)菌數(shù)量少于100?1000CFU/g糞便［24］，不容易檢出。它的污染因素也有很多，比如實(shí)驗(yàn)室里常用的細(xì)菌的污染；實(shí)驗(yàn)室工作人員的皮膚和普通動(dòng)物糞便的污染 ；飼料、墊料、器械等高壓滅菌不徹底而傳進(jìn)隔離器造成的污染。實(shí)驗(yàn)室里細(xì)菌的污染通常都是人工培養(yǎng)基上能 較好生長(zhǎng)的細(xì)菌。皮膚上的葡萄球菌和糞便中的大腸桿菌都能在人工培養(yǎng)基上較好生長(zhǎng)。微生物培養(yǎng)必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格無(wú)菌操作培訓(xùn)的專業(yè)人員進(jìn)行操作，必須在超凈臺(tái)或者生物安全柜中進(jìn)行，否則出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率還是挺高的。培養(yǎng)的標(biāo)本量的多少也會(huì)影響結(jié)果。因此，培養(yǎng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果必須借助其他方法證實(shí)其結(jié)果的可靠性。2分子生物學(xué)技術(shù)2.1采樣在無(wú)菌正壓隔離器中，取新鮮無(wú)菌動(dòng)物糞便和飼料,稱量約200mg于1.5mL無(wú)菌離心管中。按照無(wú)菌操作傳出隔離器，立即液氮冷凍并轉(zhuǎn)移至?80廠冰箱保存，直到DNA提取。2.216SrRNA基因測(cè)序應(yīng)用于無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)目前16SrRNA基因測(cè)序是鑒定腸道細(xì)菌常用的分子生物學(xué)技術(shù)。利用16srRNA分析腸道微生物群至少包括1800個(gè)種屬和40000種細(xì)菌［25］。提取哺乳動(dòng)物新鮮糞便中的DNA,通過(guò)細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再經(jīng)16srRNA基因測(cè)序，得到細(xì)菌的種類。一般細(xì)菌鑒定選擇細(xì)菌通用引物，最常用的引物是27F/1492R。27E5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,1492R:5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3,o有的文章中會(huì)使用不同的通用引物［26］。有文獻(xiàn)提到利用16SrRNAPCR技術(shù)證明無(wú)菌動(dòng)物的無(wú)菌狀態(tài)［11］。RAPDPCR用于鑒定已知定植菌動(dòng)物的污染［15］。國(guó)外對(duì)PCR、qPCR等分子生物學(xué)技術(shù)在無(wú)菌動(dòng)物和已知菌動(dòng)物做了詳細(xì)的比較，結(jié)果16SrRNAPCR最適用于無(wú)菌動(dòng)物的檢測(cè)［13］。16SrRNA在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中的優(yōu)點(diǎn)過(guò)去十幾年，分子生物學(xué)技術(shù)在腸道微生物中的應(yīng)用超過(guò)了細(xì)菌培養(yǎng)方法。16SrRNA技術(shù)因具有快速、高效的特點(diǎn)。相對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù) ，PCR技術(shù)特異性較高，被用于細(xì)菌的種屬鑒定。16SrRNA能夠鑒定難以分類的微生物種類，特別是需要嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌,鑒定培養(yǎng)陰性的細(xì) 現(xiàn)在人們開(kāi)始使用16SrRNA技術(shù)檢測(cè)無(wú)菌動(dòng)物是否污染，可以增加檢測(cè)的敏感性rRNA價(jià)格較便宜。分析時(shí)不需要太多的計(jì)算量。樣本數(shù)量越大，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)越準(zhǔn)確［30］。和最大限度的檢出生長(zhǎng)不良或較難檢出的細(xì) 污染［27-29］。相比較其它細(xì)菌測(cè)序方法,16S16SrRNA在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中的缺點(diǎn)16SrRNA技術(shù)相對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)，敏感性較低,16SrRNA對(duì)細(xì)菌的檢出限量約105CFU/g糞便口6］。這與16SrRNA技術(shù)是個(gè)非常敏感的檢測(cè)手段相矛盾。低于這個(gè)數(shù)量，就很難檢無(wú)菌動(dòng)物還是非常有效的。糞便樣本DNA的提取結(jié)果和PCR弓I物的選擇，對(duì)16SrRNA鑒定的結(jié)果影響較大。16SrRNA只能對(duì)細(xì)菌種屬鑒定，不能進(jìn)行細(xì)菌定量。無(wú)法辨別糞便中是死菌或活菌［30］。相對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)和革蘭染色鏡檢,16SrRNA測(cè)序花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),而且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。測(cè)出來(lái)。當(dāng)無(wú)菌動(dòng)物糞便中的含菌量低于這個(gè)數(shù)量，就很容易造成漏檢。但檢測(cè)污染嚴(yán)重的雖然存在于腸道中的大部分微生物是細(xì)菌，但仍有部分真菌和古菌的存在［31］。利用16SrRNA基因測(cè)序只能檢測(cè)腸道中的細(xì)菌種類。大量不同形態(tài)的真菌存在哺乳動(dòng)物的腸道中［32］O124個(gè)健康歐洲人的糞便標(biāo)本，利用宏基因組測(cè)序536112個(gè)獨(dú)立基因，其中0.8%是古菌［33］。16srRNA只是鑒定細(xì)菌的污染。有方法提到利用專門(mén)的DNA提取技術(shù)和qPCR來(lái)鑒定真菌［34］，古菌的擴(kuò)增引物也有被描述［35］。2.516SrRNA在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中的影響因素16SrRNA在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中，需防止樣本采樣中、分析中的污染。在無(wú)菌隔離器中采樣并稱重，保持樣本無(wú)菌包裝并密封。新鮮無(wú)菌動(dòng)物糞便從無(wú)菌隔離器中傳出后，應(yīng)盡快進(jìn)行PCR分析，以盡量減少樣本和分析中的污染風(fēng)險(xiǎn)［11］。所有操作必須在超凈臺(tái)中進(jìn)行,每一步都必須無(wú)菌操作，且操作人員必須通過(guò)專業(yè)培訓(xùn)。檢測(cè)糞便樣本中含有較多的植物，聚合酶抑制劑可能會(huì)影響PCR分析。這些因素可以通過(guò)設(shè)計(jì)用于糞便樣本中提取 DNA的試劑盒來(lái)減少［15］。食物中存在細(xì)菌的DNA應(yīng)該被考慮在內(nèi)低含量的DNA通常在腸道中被檢測(cè)到，除非使用化學(xué)定義飲食［15］。輻照飼料中的葉綠素也會(huì)干擾DNA的提取，不能確定是細(xì)菌DNA還是植物DNA，從而影響PCR分析。需通過(guò)16SrRNA測(cè)序進(jìn)一步來(lái)鑒定是否是細(xì)菌DNA。如是細(xì)菌DNA,需進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和革蘭染色確定是否為活菌 ［30］。DNA的提取質(zhì)量至關(guān)重要，直接影響16SrRNA測(cè)序的結(jié)果［30］。檢測(cè)樣本中含菌量的多少將會(huì)直接影響無(wú)菌動(dòng)物還是非常有效的。糞便樣本DNA的提取結(jié)果和PCR弓I物的選擇，對(duì)16SrRNA鑒定的結(jié)果影響較大。16SrRNA只能對(duì)細(xì)菌種屬鑒定，不能進(jìn)行細(xì)菌定量。無(wú)法辨別糞便中是死菌或活菌［30］。相對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)和革蘭染色鏡檢,16SrRNA測(cè)序花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),而且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。雖然存在于腸道中的大部分微生物是細(xì)菌，但仍有部分真菌和古菌的存在［31］。利用16SrRNA基因測(cè)序只能檢測(cè)腸道中的細(xì)菌種類。大量不同形態(tài)的真菌存在哺乳動(dòng)物的腸道中［32］O124個(gè)健康歐洲人的糞便標(biāo)本，利用宏基因組測(cè)序536112個(gè)獨(dú)立基因，其中0.8%是古菌［33］。16srRNA只是鑒定細(xì)菌的污染。有方法提到利用專門(mén)的DNA提取技術(shù)和qPCR來(lái)鑒定真菌［34］，古菌的擴(kuò)增引物也有被描述［35］。2.616SrRNA在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中的影響因素16SrRNA在無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌檢測(cè)中，需防止樣本采樣中、分析中的污染。在無(wú)菌隔離器中采樣并稱重，保持樣本無(wú)菌包裝并密封。新鮮無(wú)菌動(dòng)物糞便從無(wú)菌隔離器中傳出后，應(yīng)盡快進(jìn)行PCR分析，以盡量減少樣本和分析中的污染風(fēng)險(xiǎn)［11］。所有操作必須在超凈臺(tái)中進(jìn)行,每一步都必須無(wú)菌操作，且操作人員必須通過(guò)專業(yè)培訓(xùn)。檢測(cè)糞便樣本中含有較多的植物，聚合酶抑制劑可能會(huì)影響PCR分析。這些因素可以通過(guò)設(shè)計(jì)用于糞便樣本中提取 DNA的試劑盒來(lái)減少［15］。食物中存在細(xì)菌的DNA應(yīng)該被考慮在內(nèi)低含量的DNA通常在腸道中被檢測(cè)到除非使用化學(xué)定義飲食［15］。輻照飼料中的葉綠素也會(huì)干擾DNA的提取，不能確定是細(xì)菌DNA還是植物DNA,從而影響PCR分析。需通過(guò)16SrRNA測(cè)序進(jìn)一步來(lái)鑒定是否是細(xì)菌DNA。如是細(xì)菌DNA,需進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和革蘭染色確定是否為活菌 ［30］。DNA的提取質(zhì)量至關(guān)重要，直接影響16SrRNA測(cè)序的結(jié)果［30］。檢測(cè)樣本中含菌量的多少將會(huì)直接影響無(wú)菌動(dòng)物還是非常有效的。糞便樣本DNA的提取結(jié)果和PCR弓I物的選擇，對(duì)16SrRNA鑒定的結(jié)果影響較大