耐高溫、耐酸鹼乙醛脫氫酶的護(hù)肝解酒原理

利用耐高溫乙醇氧化酶清除人體內(nèi)的酒精葛莘隨著生活水平的提高,人們消費(fèi)酒精類飲料的數(shù)量也越來越大?？茖W(xué)研究及統(tǒng)計(jì)分析表明，酒精產(chǎn)品對(duì)人們的身體健康、家庭生活和社會(huì)活動(dòng)都有諸多負(fù)面影響。在美國(guó),平均每年有九千萬人次急診病患與飲酒有關(guān)，每年有一千人死于飲酒過量。據(jù)2000年10月14日《大連日?qǐng)?bào)》報(bào)道，中國(guó)的酒精依賴患病率在過去十年中增長(zhǎng)了近五倍由0.12%增加到0.68%,其中因酒精中毒死亡者增長(zhǎng)了10倍。流行病學(xué)研究也證實(shí)，在精神病院中,近年來因酒精中毒或酒精中毒障礙住院的病人明顯上升。如吉林省延邊地區(qū)，該比例從1964-1979年平均0%—4%上升至1979-1985年的8.0%—23.5%(沈漁邨，1987,1996)。酒精對(duì)人體的危害酒精對(duì)人體有害,對(duì)肝臟最為嚴(yán)重,胃腸道、胰腺、心臟、腎臟等也會(huì)造成不同程度的損害。因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)在一份報(bào)告中提出：“酒精中毒是當(dāng)今世界世界內(nèi)第一公害，其毒性可累及全身主要臟器，對(duì)肝臟的影響最大。在西方國(guó)家，80%肝硬變(livercirrhosis)的原因是酒精中毒。酒精中毒對(duì)病毒性肝炎、肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后都有著重要影響?！本凭愿尾“ň凭灾靖?、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化，最終可演變?yōu)楦伟?。在歐洲，飲酒量越高的國(guó)家，因肝硬化而導(dǎo)致的死亡率越高。比如，瑞典、丹麥、和英國(guó)等國(guó)家的人均年飲酒量在10升以下，他們的肝硬化死亡率在萬分之十以下;而法國(guó)的人均年飲酒量高達(dá)27升，他們的肝硬化死亡率是上述國(guó)家的三倍。近年來隨著生活水平的提高，酒精性肝病在我國(guó)也達(dá)到了不容忽視的程度。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)11億中的酒民三億多人，共中酒精性肝病的發(fā)病率在20%左右。由于肝臟的代償能力極強(qiáng)，疾病早期一般沒有癥狀或某些單一的癥狀不足以引起注意，因此，就診時(shí)往往到了比較嚴(yán)重的程度，甚至到了肝臟的失代償期。在肝硬化階段，如果不積極治療，繼續(xù)酗酒的話，患者在2-4年內(nèi)的存活率極低。酒精的毒害主要來自乙醛科學(xué)家早就證明，乙醛的毒性是乙醇的十倍，所以乙醛是導(dǎo)致酒后癥狀的主要化學(xué)物質(zhì)(BrienandLoomis,1983)。乙醛對(duì)大腦內(nèi)胺代謝、ATP酶，細(xì)胞線粒體的呼吸功能、脂肪酸氧化功能，以及心肌蛋白質(zhì)的合成都有很強(qiáng)的抑制作用。乙醛化學(xué)性質(zhì)活潑，與兒茶酚胺結(jié)合能夠形成嗎啡類似物，是造成酒癮的主要化學(xué)物質(zhì)；乙醛使羥色胺代謝發(fā)生故障，產(chǎn)生有幻覺作用的四氫-—咔啉，造成酒后的種種精神障礙(CunninghamandBailey, 2001；Eriksson， 2001)。醫(yī)學(xué)界也早就知道過分喝酒可能導(dǎo)致與上消化道有關(guān)的癌癥。但是，科學(xué)試驗(yàn)證明，酒精本身并不致癌。那么，飲酒與上消化道癌的關(guān)系是怎么建立起來的呢？越來越多的研究表明，酒精的第一個(gè)代謝產(chǎn)物，乙醛，可能是致癌的兇手(Homannetal．,2000)。一項(xiàng)國(guó)際研究工作發(fā)現(xiàn)，族群中基因的一個(gè)主要區(qū)別可能導(dǎo)致唾液具有更高的致癌可能性(Vakevainenetal.,2000)。這篇研究報(bào)告說，酒精一旦進(jìn)入了身體，肝臟便開始通過代謝反應(yīng)來清除毒物。研究顯示，大約50%的日本人和華人的酒精代謝酶系統(tǒng)出現(xiàn)故障，使其中間產(chǎn)物乙醛快速、大量積累。因此，他們喝了酒會(huì)更容易出現(xiàn)臉紅、暈眩、作嘔等征兆。對(duì)這些人來說，他們的唾液中的乙醛含量要比含有健全酶系統(tǒng)的人高出兩倍至三倍?？茖W(xué)家相信，乙醛隨著唾液經(jīng)過喉嚨組織時(shí)可能導(dǎo)致癌癥。此外,科學(xué)家也說,口腔內(nèi)的細(xì)菌也可能具有把酒精分解成乙醛的功能。因此，不注意口腔衛(wèi)生的飲酒人士患上癌癥的機(jī)率更高。乙醛除了使飲酒者對(duì)酒精更加敏感，并造成皮膚溫度上升,面赤，心律和呼吸加快，血壓降低，口干，喉緊，頭痛，惡心等癥狀之外還能夠造成腦損傷，心肌病(cardiomyopathy),胰腺炎(pancreatitis)和胎兒酒精綜合癥(fetalalcoholsyndrome)(Eriksson,2001)。乙醛還能夠?qū)е录t血球異常(Latvalaeta/., 2001)。乙醛通過血液進(jìn)入大腦,能夠組織神經(jīng)信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致記憶喪失，行為運(yùn)動(dòng)失控(Larson,1992)。對(duì)酒精的耐受性受基因控制酒精在體內(nèi)的代謝過程主要由肝中的乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase,ADH)和醛類脫氫酶(aldehydedehydrogenase,ALDH)所制約，它們分別催化的化學(xué)反應(yīng)如下：C2H5OH(酒精)+NAD+TCH3CHO(乙醛)+NADH+H+CHCH0(乙醛)+NAD++H2OTCH3COOH(乙酸)+NADH+H+第一個(gè)反應(yīng)生成的乙醛可刺激腎上腺素、去甲腎上腺素等物質(zhì)的分泌，引起面紅耳赤、心率快、皮溫高等癥狀。除了ADH/ALDH系統(tǒng)之外，微粒體乙醇氧化系統(tǒng)(microsomalethanoloxidizingsystem)也能夠?qū)⒁掖佳趸梢胰谶@個(gè)酒精代謝中的作用僅占五分之一左右。人類的乙醇脫氫酶(ADH)系統(tǒng)非常復(fù)雜，至少可以分成六類同工酶。I-V類ADH基因編碼￡卩，丫，冗,X型肽鏈，通過不同組合，它們可以形成至少八個(gè)同型或異型雙體。I類ADH包括同工酶a,卩，y亞基,分別由ADH】，ADH2,ADH3基因位點(diǎn)編碼，11類ADH包括冗亞基，由ADH4基因位點(diǎn)編碼。這兩類ADH都是肝臟酶。III類ADH包括x型肽鏈，由ADH5基因位點(diǎn)編碼，是一個(gè)甲醛脫氫酶。IV類ADH包括q型肽鏈(PID：g6137442)，由ADH?基因位點(diǎn)編碼,主要在胃和食道器官表達(dá)。V類ADH由ADH基因位點(diǎn)編碼，但在人體內(nèi)尚未檢查到它的6活性。對(duì)VI類ADH的研究不多。在人類中，1類ADH在乙醇代謝中起主要作用。成人主要是B鏈二聚體，來自ADH2基因。ADH2具有多態(tài)性，大多數(shù)白種人為ADH2-1，由B1B1組成;而90%黃種人為ADH2-2由B1的變異肽鏈B2(47位精氨酸一組氨酸)組成(B2B2)(jomvalletal.,1984;Matsuoetal.,1989)。B2B2的酶活性約為BIB1的100倍,故大多數(shù)白種人在飲灑后產(chǎn)生乙醛較慢,而黃種人積蓄乙醛速度較快(Thomassoneta/.,1995；Yineta/.,1992)。人體內(nèi)有十多種醛類脫氫酶(ALDH)(Vasilioueta/．,2000;Yoshidaeta/．,1998)。根據(jù)對(duì)乙醛的Km值高低，可以把人類ALDH同工酶分成兩大類：對(duì)乙醛的￡值高的(超過毫摩爾濃度，也就是只有在乙醛濃度高時(shí)才有催化作用)和對(duì)乙醛的Km值低的(微摩爾濃度，在乙醛濃度低時(shí)即有催化作用)。前者包括ALDH3(K=83mM)和ALDH4(Kmm=5mM)；后者包括ALDH1(K=30yM)和ALDH2(K=3?M)(Yineta/.,mm1993)。所以，人體內(nèi)的乙醛氧化主要由ALDH1和ALDH2來完成，而ALDH2對(duì)乙醛的活性較ALDH1活性高出約10-50倍(Vasiliouetal.,2000;Yoshida,1998)OALDH1存在于細(xì)胞漿內(nèi),ALDH2存在于線粒體內(nèi)。ALDH2由54kDa的亞基形成四聚體。多數(shù)東方人種的ALDH2基因?yàn)橥蛔冃?ALDH2*2，即ALDH2的第487個(gè)氨基酸由谷氨酸(E)變成了賴氨酸(K)。這導(dǎo)致ALDH2*2喪失了脫氫酶的活性(Yoshidaetal.,1984;YoshidaandDave,1985;Farresetal1994)。黃種人中有3種乙醛脫氫酶表現(xiàn)型：普通型，ALDH1+ALDH2*1，約占人口總數(shù)的50%;“非經(jīng)典型atypical”，有ALDH1+ALDH2*2，約占人口總數(shù)的50%；3，罕見的“非經(jīng)典型”，僅有ALDH2無ALDH1，只在個(gè)別日本人中發(fā)現(xiàn)。幾乎所有的白種人都為普通型(ShibuyaandYoshida,1988；Thomassonetal.,1994;Yineta. 1992)。因此，可以說黃種人較白種人易產(chǎn)生酒精中毒的原因是遺傳因素決定的。由于黃種人的ADH活性高，飲酒后乙醇很快被氧化成乙醛,而由于ALDH的活性低，使乙醛遲遲不能夠被氧化成乙酸，所以產(chǎn)生酒后的諸多中毒癥狀(Yineta.1992)。酒精中毒的基因補(bǔ)救人體排除酒精的通道有肺臟(呼吸)、腎臟(排尿)和肝臟(代謝)，其中90-98%是通過肝臟內(nèi)的代謝來完成的。酒精在被飲用之后,要經(jīng)過口腔、食道、胃和小腸,然后進(jìn)入血液,其中70-80%以上在腸腔內(nèi)進(jìn)入血液，20-30%左右從胃臟進(jìn)入血液，通過口腔和食道進(jìn)入血液的僅占極少部分。血液中的乙醇被運(yùn)輸?shù)礁闻K,轉(zhuǎn)化成乙酸,后者最終被分解成二氧化碳和水。酒精在血液中消失的速度為每小時(shí)100-200毫克／公斤體重,一個(gè)75公斤體重的健康成人每小時(shí)能夠代謝7.5-15克乙醇。除了在肝臟代謝之外,乙醇在從進(jìn)入口腔到被血液吸收這個(gè)過程中被氧化叫做“第一通道代謝("first—pass"metabolism”)，主要通過口腔、食道、胃腸內(nèi)的乙醇氧化酶系統(tǒng)將乙醇氧化。人類的第四類乙醇脫氫酶a-ADH就主要存在于上食道的黏膜，而不存在于肝內(nèi)(Farresetal.,1994)og-adh是所有ADH中活性最高的(MorenoandPares, 1991;Morenoetal.， 1994;Farresetal.,1994)，但由于總量少(大約10微克／克組織)，加上乙醇迅速進(jìn)入血液,所以胃內(nèi)乙醇氧化在酒精代謝中所起的作用不是很大(Pares,1993)o很顯然，消除酒精毒害的最好辦法就是在其進(jìn)入血液之前，將它氧化成沒有毒性的乙酸。不過，消化系統(tǒng)的環(huán)境十分不利于乙醇代謝酶。首先，胃液的酸殮度(pH值)在1-3左右，平均值大約是2,腸腔(intestinallumen)的pH值可能高達(dá)8-9左右。因此，細(xì)胞內(nèi)的Adh和ALDH在胃中幾乎不起作用。腸胃液體中，除有少量的ADH夕卜，很少有ALDH的存在。其次，胃液中的離子(特別是膽汁鹽)對(duì)乙醇氧化酶(ADH和ALDH)也有抑制作用。再其次，胃腸液中NAD+的含量很少，乙醇的氧化缺乏電子受體，無法進(jìn)行。最后，胃液中的蛋白酶更是其他酶的天敵,在它們能夠發(fā)揮作用之前就已經(jīng)被分解成氨基酸了。所以,要通過口服夕源乙醇氧化酶來治療乙醇代謝基因的缺陷,首先要克服上面的問題。另外還要考慮的問題就是外源蛋白在生產(chǎn)加工過程中的穩(wěn)定性。比如人類ALDH2*1在細(xì)胞夕的穩(wěn)定很差，經(jīng)過加工之后,絕大部份生物活性已經(jīng)喪失殆盡。

乙醇氧化酶系統(tǒng)存在于幾乎所有的生物中。從耐酸、耐鹼、耐高溫的生物中把相應(yīng)的基因克隆出來,讓它們?cè)谏锓磻?yīng)器中超量表達(dá)，經(jīng)過簡(jiǎn)單純化，就能夠得到大量、純凈的酶制品由于它們來自的生物在高溫和酸鹼環(huán)境中生長(zhǎng),所以這些酶一般也能夠在相同的環(huán)境中起作用。根據(jù)它們的特性，可以把它們制成酸性和鹼性飲料或湯料，在飲酒時(shí)同時(shí)飲用,就能夠?qū)⒕凭x產(chǎn)生的乙醛氧化成乙酸,防止其對(duì)人體的毒害。硫葉菌（Sulfolobussolfataricus）是一種從硫礦中分離出來的古細(xì)菌，最適生長(zhǎng)溫度是80°C，最適pH值在2—4之間（Charleboisetal.,1998;Sheeta/.,2001）。硫葉菌的基因組已經(jīng)全部解碼（Sheeta/.,2001）,其中有13個(gè)基因編碼乙醇脫氫酶，1個(gè)基因編碼醛類脫氫酶。對(duì)這些基因進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)其中的Adh3編碼的蛋白質(zhì)具有典型的乙醇脫氫酶結(jié)構(gòu)域，并與人類的第四類乙醇脫氫酶-ADH有45%的相似性；A[dhT基因編碼的醛類脫氫酶與人類的ALDH2有54%的相似性（見下）。同樣，在嗜殮耐高溫枯草桿菌Bacillushalodurans的基因組中，有四個(gè)乙醇脫氫酶基因，11個(gè)醛類脫氫酶基因，后者中的兩個(gè)，dhaS和aldA與人類的ALDH2有很高的相似性。項(xiàng)目?jī)?nèi)容利用基因工程手段克隆人類及嗜酸嗜鹼耐高溫細(xì)菌的乙醇、乙醛脫氫酶基因，使其在大腸桿菌和酵母細(xì)胞中超量表達(dá)，經(jīng)過純化之后,與輔劑、添加劑制成片、丸、散、膠囊、湯料等制劑，供消費(fèi)者在飲酒的同時(shí)服用，加速消除體內(nèi)乙醇、乙醛,達(dá)到保肝健體的作用。細(xì)菌乙醇、乙醛脫氫酶在大腸桿菌中的超量表達(dá)將嗜酸硫葉菌和嗜殮枯草桿菌的乙醇、乙醛脫氫酶基因克隆到表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌株。在沒有誘導(dǎo)目的基因表達(dá)的生長(zhǎng)環(huán)境下（泳道1-3），目的基因沒有表達(dá)。當(dāng)加入誘導(dǎo)劑之后（泳道4-6），目的基因超量表達(dá)，目的蛋白質(zhì)（箭頭所指）可達(dá)細(xì)菌蛋白質(zhì)總量的50%以上。泳道1，4：硫葉菌乙醛脫氫酶基因克隆泳道2,5：枯草桿菌乙醛脫氫酶基因克隆泳道3，6：硫葉菌乙醇脫氫酶基因克隆泳道M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記

技術(shù)路線安全性考慮：從理論上分析，蛋白質(zhì)在腸胃消化系統(tǒng)中很快就會(huì)被蛋白酶分解成氨基酸,所以，除了少數(shù)毒素蛋白質(zhì)外,絕大多數(shù)蛋白質(zhì)作為食品服用是安全的。而微生物蛋白供人使用的例子更是多得舉不勝舉。比如，金黃葡萄球菌產(chǎn)生的葡激酶可以用來治療心肌梗塞，病毒蛋白質(zhì)制成的疫苗可以直接注射到人的體內(nèi)。人類食用蘇蕓金桿菌的B.t.毒素轉(zhuǎn)基因植物，也沒有發(fā)現(xiàn)有不良后果。目前已有大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明Bt蛋白只對(duì)少數(shù)目標(biāo)昆蟲有毒，對(duì)人畜絕對(duì)安全。我們選用的蛋白質(zhì)分別來自人類和兩個(gè)細(xì)菌。人類蛋白質(zhì)對(duì)人類的安全性自不待言,而這兩個(gè)細(xì)菌都不是動(dòng)物或人類的病原菌,并且他們都需要在高溫和極端酸鹼度的環(huán)境下才能夠生長(zhǎng),所以他們本身并不能夠?qū)θ梭w造成危害。況且,我們只是從細(xì)菌基因組編碼的上千個(gè)蛋白質(zhì)中選出一個(gè),因此更沒有病原菌的問題。我們克隆的這幾個(gè)細(xì)菌蛋白質(zhì)，與人的同類蛋白的相似性都接近或超過了50%，并且與毒素蛋白質(zhì)沒有任何相關(guān)性。我們選擇的反應(yīng)器是國(guó)際通用的生物反應(yīng)器，其中啤酒酵母對(duì)人類不僅沒有任何毒害，而且是營(yíng)養(yǎng)豐富的食品和食品添加劑。啤酒酵母是非常好的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含有大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),人體消化吸收率可達(dá)90%以上;維生素B十個(gè)組分達(dá)8.5mg/g；維生素D達(dá)0.008g/g；無機(jī)鹽磷、鈣、鉀、鐵、鋅、鉻、鎂等適量。發(fā)達(dá)國(guó)家早已全部回收作為營(yíng)養(yǎng)品食用。例如,日本就利用干燥的啤酒酵母制造減肥食品。我們使用的大腸桿菌生物反應(yīng)器是生物工程菌,都不含有大腸桿菌毒素基因。它的表達(dá)效率可高達(dá)50%，目標(biāo)蛋白質(zhì)經(jīng)一次純化即可達(dá)到95%以上的純度。并且，在純化目的蛋白的過程中,我們都使用60—80<C高溫處理，大腸桿菌蛋白質(zhì)在該條件下，100%被鈍化。經(jīng)濟(jì)效益分析酒精中毒嚴(yán)重威脅人民的身心健康。中國(guó)有3億人飲酒,其中一半攜帶有缺陷型乙醛脫氫酶基因。即使以十分之一酒民每人每年購(gòu)買5元的產(chǎn)品計(jì),市場(chǎng)規(guī)模即可達(dá)到1.5億元/年以上，再加上作為保健預(yù)防用購(gòu)買的消費(fèi)者,市場(chǎng)前景極為可觀。而在達(dá)到批量生產(chǎn)后,生產(chǎn)成本約為銷售價(jià)格的5-10%。參考文獻(xiàn)沈漁邨。近年來國(guó)內(nèi)有關(guān)酒依賴和慢性酒中毒的流行病學(xué)調(diào)查資料?！吨袊?guó)心理衛(wèi)生雜志》,1987;(6)：251沈漁邨。21世紀(jì)中國(guó)面臨的精神衛(wèi)生挑戰(zhàn)。《中華精神科雜志》1996年第1期。蘇素花。7例急性乙醛中毒及其搶救治療報(bào)告《中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志》2001年10月第14卷第5期。284頁(yè)。BrienJF,LoomisCW.1983.Pharmacologyofacetaldehyde.CanJPhysiolPharmacol.61,1-22．CharleboisRL,SheQ,SprottDP,SensenCW,GarrettRA.1998.Sulfolobusgenome:fromgenomicstobiology.CurrOpinMicrobiol.1,584-8.ChrysanthyIkonomidou,PetraBittigau,MasahikoJ.Ishimaru,DavidF.Wozniak,ChristianKoch,1KerstinGenz.2000.Ethanol-InducedApoptoticNeurodegenerationandFetalAlcoholSyndrome.Science287,1056-1060.CunninghamCC,BaileySM.2001.Ethanolconsumptionandlivermitochondriafunction.BiolSignalsRecept.10, 271-82.ErikssonCJ.2001.Theroleofacetaldehydeintheactionsofalcohol(update2000).AlcoholClinExpRes25(5SupplISBRA)：15S-32S.FarresJ,WangX,TakahashiK,CunninghamSJ,WangTT,WeinerH.1994.Effectsofchangingglutamate487tolysineinratandhumanlivermitochondrialaldehydedehydrogenase.Amodeltostudyhuman(Orientaltype)class2aldehydedehydrogenase.JBiolChem. 269,13854-60.FarresJ,MorenoA,CrosasB,PeralbaJM,Allali-HassaniA,HjelmqvistL,JornvallH,ParesX.1994.AlcoholdehydrogenaseofclassIV(sigmasigma-ADH)fromhumanstomach.cDNAsequenceandstructure／functionrelationships.EurJBiochem.224,549-57.HomannN,TillonenJ,MeurmanJH,RintamakiH,LindqvistC,RautioM,Jousimies-SomerH,SalaspuroM.2000.Increasedsalivaryacetaldehydelevelsinheavydrinkersandsmokers:amicrobiologicalapproachtooralcavitycancer.Carcinogenesis21(4):663-8.HomannN,TillonenJ,RintamakiH,SalaspuroM,LindqvistC,MeurmanJH.2001.Poordentalstatusincreasesacetaidehydeproductionfromethanolinsaliva:apossiblelinktoincreasedoralcancerriskamongheavydrinkers.OralOncol37, 153—8.JaumeFarresetal.,EnzymologyandMolecularBiologyofCarbonylMetabolism5,EditedbyH.Weineretal.,PlenumPress,NewYork, 1995,pp331—339.Jornvall,H.,Hempel,J.,Vallee,B.L.,Bosron,W.F.andLi,T.K.1984.Humanliveralcoholdehydrogenase:aminoacidsubstitutioninthebeta2beta2Orientalisozymeexplainsfunctionalproperties,establishesanactivesitestructure,andparallelsmutationalexchangesintheyeastenzyme.PNAS81,3024-3028.LatvalaJ,ParkkilaS,MelkkoJ,Niemela0.2001.Acetaldehydeadductsinbloodandbonemarrowofpatientswithethanol-inducederythrocyteabnormalities.MolMed7(6):401—5.Lieber,C.S.2000.ALCOHOL：ItsMetabolismandInteractionWithNutrients.Annu.Rev.Nutr.20:395—430.MartinR.Walesetal.,EnzymologyandMolecularBiologyofCarbonylMetabolism3,EditedbyH.Weineretal.,PlenumPress,NewYork,pp.337-345(1990).MatsuoY,YokoyamaR,YokoyamaS.1989．Thegenesforhumanalcoholdehydrogenasesbeta1andbeta2differbyonlyonenucleotide.EurJBiochem.183,317-20．MorenoA,ParesX．1991.Purificationandcharacterization ofa ne walcohol dehydrogenasefromhumanstomach.JBiolChem．266,1128-33.MorenoA,ParesA,OrtizJ,En riquezJ,ParesX.19 94. 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