(完整版)VC標(biāo)準(zhǔn)曲線

藥用的維生素c是人工合成的。合成的方法有多種。一般是由葡萄糖制成D-山梨醇，再用黑乙酸菌（AcetobacterSuboxydans)氧化發(fā)酵，生成L-山梨糖，經(jīng)縮合生成二丙酮-L-山梨糖，再氧化生成二丙酮-2-酮-L-葡萄糖酸，然后酯化成2-酮-L-葡萄糖酸甲酯，與甲醇鈉作用生成抗壞血酸鈉，與鹽酸加熱制成抗壞血酸。所以它指的就是你的Vc含量，嚴(yán)格意義上來講是L-抗壞血酸。通?？箟难峥偭勘徽J(rèn)為是維生素C(VitaminC,VC)和其氧化形式二十二碳六烯酸(docosahexaenoic_acid,DHA)的總和2,4-二硝基苯肼比色法

8原理

總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸,樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭

氧化為脫氫抗壞血酸,再與2,4-二硝基苯肼作用生成紅色脎,根據(jù)脎在硫酸溶液中的含量

與總抗壞血酸含量成正比,進(jìn)行比色定量。

9試劑

本實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。試劑純度均為分析純。

9.14.5mol/L硫酸:謹(jǐn)慎地加硫酸(比重1.84)250mL于700mL水中,冷卻后用水稀釋至

1000mL。

9.285%硫酸：謹(jǐn)慎地加900mL硫酸(比重1.84)于100mL水中。

9.32%2,4-二硝基苯肼溶液:溶解2g2,4-二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸內(nèi),過濾。

不用時(shí)存于冰箱內(nèi),每次用前必須過濾。

9.42%草酸溶液:溶解20g草酸(H2C2O2)于700mL水中,稀釋至1000mL。

9.51%草酸溶液:稀釋500mL2%草酸溶液到1000mL。

9.61%硫脲溶液:溶解5g硫脲于500mL1%草酸溶液中。

9.72%硫脲溶液:溶解10g硫脲于500mL1%草酸溶液中。

9.81mol/L鹽酸:取100ml鹽酸,加入水中,并稀釋至1200mL。

9.9抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:溶解100mg純抗壞血酸于100mL1%草酸中,配成每毫升相當(dāng)于1mg

抗壞血酸。

9.10活性炭:將100g活性炭加到750mL1mol/L鹽酸中,回流1～2h,過濾,用水洗數(shù)次,

至濾液中無鐵離子(Fe3+)為止,然后置于110℃烘箱中烘干。

檢驗(yàn)鐵離子方法:利用普魯士藍(lán)反應(yīng)。將2%亞鐵氰化鉀與1%鹽酸等量混合,將上述

洗出濾液滴入,如有鐵離子則產(chǎn)生藍(lán)色沉淀。

10儀器和設(shè)備

10.1恒溫箱：37±0.5℃。

10.2可見-紫外分光光度計(jì)。

10.3搗碎機(jī)。

11操作步驟

11.1樣品的制備

全部實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)避光。

11.1.1鮮樣的制備:稱100g鮮樣和100g2%草酸溶液,倒入搗碎機(jī)中打成勻漿,取10～40g

勻漿(含1～2mg抗壞血酸)倒入100mL容量瓶中,用1%草酸溶液稀釋至刻度,混勻。

11.1.2干樣制備:稱1～4g干樣(含1～2mg抗壞血酸)放入乳缽內(nèi),加入1%草酸溶液磨成勻

漿,倒入100mL容量瓶內(nèi),用1%草酸溶液稀釋至刻度,混勻。

11.1.3將(11.1.1)和(11.1.2)液過濾,濾液備用。不易過濾的樣品可用離心機(jī)沉淀后,

傾出上清液,過濾,備用。

11.2氧化處理：取25mL上述濾液,加入2g活性炭,振搖1min,過濾,棄去最初數(shù)毫升

濾液。取10mL此氧化提取液,加入10mL2%硫脲溶液,混勻。

11.3呈色反應(yīng)

11.3.1于三個(gè)試管中各加入4mL稀釋液(11.2)。一個(gè)試管作為空白,在其余試管中加入

1.0mL2%2,4-二硝基苯肼溶液,將所有試管放入37±0.5℃恒溫箱或水浴中,保溫3h。

11.3.23h后取出,除空白管外,將所有試管放入冰水中?？瞻坠苋〕龊笫蛊淅涞绞覝?

然后加入1.0mL2%2,4-二硝基苯肼溶液,在室溫中放置10～15min后放入冰水內(nèi)。其余步驟

同樣品。

11.485%硫酸處理：當(dāng)試管放入冰水后,向每一試管中加入5mL85%硫酸,滴加時(shí)間至

少需要1min,需邊加邊搖動(dòng)試管。將試管自冰水中取出,在室溫放置30min后比色。

11.5比色：用1cm比色杯,以空白液調(diào)零點(diǎn),于490nm波長測吸光值。

11.6標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

11.6.1加2g活性炭于50mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中,搖動(dòng)1min，過濾。

11.6.2取10mL濾液放入500mL容量瓶中,加5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀釋至刻度,抗壞血

酸濃度20μg/mL。

11.6.3取10、20、30、40、50mL稀釋液,分別放入5個(gè)50mL容量瓶中,用1%硫脲溶液

稀釋至刻度,使最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為4、8、12、16、20μg/mL。

11.6.4按樣品測定步驟形成脎并比色。

11.8.5以吸光值為縱坐標(biāo),以抗壞血酸濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

12計(jì)算

c?V100

X=━━━━━×F×━━━━............................(2)

m1000

式中：X─—樣品中總抗壞血酸含量,mg/100g;

c─一由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得“樣品氧化液”中總抗壞血酸的濃度,μg/mL；

V─—試樣用1%草酸溶液定容的體積,mL；

F──樣品氧化處理過程中的稀釋倍數(shù)；

m──試樣質(zhì)量,g。

13空白：0.062±0.00554μg/mL0.1628μg/mL0.24312μg/mL0.36016μg/mL0.44620μg/mL0.532線性方程：Y=0.0233X+0.0039R2=0.9978一、原理還原型抗壞血酸（AsA）可以把鐵離子還原成亞鐵離子，亞鐵離子與紅菲咯啉（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP）反應(yīng)形成紅色螯合物。在534nm波長的吸收值與AsA含量正相關(guān)，故可用比色法測定。二、儀器與用具離心機(jī)；分光光度計(jì)；研缽；試管。三、試劑5%三氯乙酸（TCA）；無水乙醇溶液；0.4%磷酸－乙醇溶液；0.5%BP－乙醇溶液；0.03%FeCl3－乙醇溶液（請注意結(jié)晶水合物需要扣除結(jié)晶水含量，試劑濃度不在99%以上的需要換算成實(shí)際質(zhì)量）四、步驟1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線配制濃度為，1mg/L，2mg/L，4mg/L，8mg/L，10mg/L，15mg/L，25mg/L的AsA系列標(biāo)準(zhǔn)液。25mg/L抗壞血酸：準(zhǔn)確稱取2.5mg抗壞血酸溶于水定容至100mL容量瓶。15mg/L抗壞血酸：從25mg/L抗壞血酸溶劑中吸取15mL定容至25mL10mg/L抗壞血酸：從25mg/L抗壞血酸溶劑中吸取10mL定容至25mL8mg/L抗壞血酸：從25mg/L抗壞血酸溶劑中吸取8mL定容至25mL4mg/L抗壞血酸：從25mg/L抗壞血酸溶劑中吸取4mL定容至25mL2mg/L抗壞血酸：從25mg/L抗壞血酸溶劑中吸取2mL定容至25mL1mg/L抗壞血酸：從25mg/L抗壞血酸溶劑中吸取1mL定容至25mL取各濃度標(biāo)準(zhǔn)液1.0ml于試管中，加入1.0ml5%TCA、1.0ml乙醇搖勻，再依次加入0.5ml0.4%H3PO4－乙醇、1.0ml0.5%BP－乙醇、0.5ml0.03%FeCl3－乙醇，總體積5.0ml。將溶液置于30℃下反應(yīng)90min，然后測定A534。以AsA濃度為橫坐標(biāo)，以A534為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性方程。2.提取取植物葉片1.0g，按1∶5（W/V）加入5%TCA研磨，4000r/min離心10min，上清液供測定。在氮?dú)獗Ｗo(hù)中研磨且避光做不到，也可直接超聲10min后取上清液測定，最好能過濾或離心。3.測定（1）AsA測定取1.0ml樣品提取液于試管中，按上述相同的方法進(jìn)行測定，