DB22T 3601-2023 人參銹腐病菌分子檢測 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

ICS65.020.20CCSICS65.020.20CCSB16吉 林 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB22/T3601—2023法DetectionofIlyonectriarobustacausingginsengrustyrootrotbyquantitativereal-timePCR2023-12-28發(fā)布 2024-02-01實(shí)施吉林省場監(jiān)理廳 發(fā)布DB22/T3601—2023DB22/T3601—2023II前 言本文按照GB/T1.1—2020《準(zhǔn)工導(dǎo)則 第1分標(biāo)化件構(gòu)和草則的規(guī)定草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林參王植保科技有限公司。本文件主要起草人：陳長卿、姜云、高潔、徐懷友、盧寶慧、楊麗娜、姜伊琳。DB22/T3601—2023DB22/T3601—2023PAGEPAGE1人參銹腐病菌分子檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR法范圍PCRPCR檢測原本文件適用于人參根和土壤中銹腐病菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測。（GB/T6682 GB/T28067 RT-PCRGB/T28067界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。人參腐病 ginsengrustyrootrot一種主要由強(qiáng)壯土赤殼菌（Ilyonectriarobusta）侵染人參根部導(dǎo)致的土傳病害。實(shí)時(shí)光量PCR法 quantitativereal-timePCR一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。Ct值 cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。[來源：GB/T28067—2011，2.3]原理I.robustaHistone進(jìn)行PCRPCRPCR光信號值。隨著PCR擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，CtCt值判斷除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。試劑水，GB/T6682DNADNAPCR引物′-CGCCACCGACCTACCTCCCC-5′ATGTGTTGAGCGAGCGTA引物用水稀釋成10μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?.001g。PCR/350nm～750（SYBRGreen3.0℃/s0.50.34℃～100℃。：125kPa。12000rpm冰箱：4℃，-20℃，-800.1μL～2.5μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。樣品人參銹腐病強(qiáng)壯土赤殼菌菌絲體DNA。3DNA。3DNA。無菌一級水。人參采集新鮮人參根，裝入密封袋，置于冰盒中，在實(shí)驗(yàn)室用研磨機(jī)將參根打碎，充分混合，4℃保存不超過12h，也可-80℃長期保存。土壤每25m2人參田塊采用梅花形采樣法，不少于5點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)取人參根際土壤樣品50g，裝入密封袋，充分混合，置于冰盒中，4℃保存不超過12h，也可-80℃長期保存。DNADNADNADNADNA濃度為100ng/μL～200比值為1.8～2.0之間時(shí)，DNA模板適宜熒光定量PCR擴(kuò)增。用無菌一級水將模板DNA濃度稀釋成50ng/μL用于熒光定量PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系見表1。表1 實(shí)時(shí)光量PCR反系試劑體積（μL）2×SYBRGreenMix10.0正向引物（10μmol/L）0.2反向引物（10μmol/L）0.2DNA模板1.0二甲基亞砜DMSO1.0一級水7.6總體積20.0按照商品化試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。15PCR在PCR反應(yīng)體系正常工