6第六章種子的擴大培養(yǎng)

第六章種子的擴大培養(yǎng)聯(lián)系郵箱種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子制備實例種子制備的技術(shù)概要種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍枯燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第一節(jié)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子擴大培養(yǎng)的概念:種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：總量及濃度能滿足要求生理狀況穩(wěn)定，個體與群體活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長無雜菌污染第一節(jié)種子制備過程舉例一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過程斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵1、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5瓊脂2%，培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次2.一級種子〔搖瓶〕培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基3.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)〔容積為發(fā)酵罐的1%(10%)〕,32℃培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基種子的質(zhì)量要求：108-109個/ml大小均勻，呈單個或八字排列時結(jié)束，活力旺盛二、青霉素生產(chǎn)的種子制備制備過程安培管→斜面孢子→大米孢子→一級種子→二級種子→發(fā)酵一、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細培養(yǎng)條件：25℃、7天,注意濕度50%左右二、大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源〔玉米漿〕培養(yǎng)基的特點：本錢低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比外表積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當〔要求大米的白點小〕有利于孢子的生長。培養(yǎng)條件：25℃、7天，控制濕度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個孢子3、一級種子培養(yǎng)基：〔葡萄糖、乳糖、蔗糖〕、玉米漿目的：長菌體培養(yǎng)條件：27℃，40小時接種量：200億孢子/噸4、二級種子培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)條件：27℃、10-14小時接種量：10%種子的質(zhì)量要求菌絲長稠呈絲狀、菌絲團很少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的能力最強第二節(jié)種子制備的技術(shù)概要一、種子制備的過程實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。二、實驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原那么目的：種子擴培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點最終的培養(yǎng)物可分為兩類：

對于不產(chǎn)孢子和芽孢的微生物

——獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體對于不產(chǎn)芽孢和孢子的微生物，實驗室階段的種子擴培最終是獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。對于產(chǎn)孢子的微生物獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體便于操作，但需要更仔細的控制。2、培養(yǎng)基選擇的原那么培養(yǎng)基的選擇應該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應該是有利于孢子的生長。在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細。3、起始接種物的傳代問題

細菌保藏斜面→活化斜面產(chǎn)孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌種的傳代次數(shù)盡可能的少。三、生產(chǎn)車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原那么在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體?？s短發(fā)酵時間有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果菌絲體比孢子要有利：2、培養(yǎng)基選擇的原那么目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實驗室階段那么精細，而是根本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因:

一是本錢二是馴化例：檸檬酸發(fā)酵以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%

薯干粉成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%瓊脂2%3、發(fā)酵級數(shù)確實定谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子〔搖瓶〕→二級種子〔小罐〕→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子〔小罐〕→二級種子〔中罐〕→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響

級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反響級數(shù)確實定是非常重要的一個方面采用三級種子的谷氨酸發(fā)酵工藝

李文東，發(fā)酵科技通訊，2003,7斜面→一級種子〔1200ml/5000mL三角瓶〕→二級種子〔2m3〕→三級種子〔20m3)→發(fā)酵〔240m3)背景：二級種子小種量〔種子罐是發(fā)酵罐的1%左右〕二級種子大種量〔種子罐是發(fā)酵罐的5%以上〕文章：三級種子工藝用途成分（%）規(guī)模保藏牛肉膏（英國）1，蛋白胨（日本），瓊脂粉（日本）1.8，無機鹽斜面添加0.1的口服葡萄糖，其余同上一級口服葡萄糖3，玉米漿2.4，尿素0.65，無機鹽等1200ml/5000ml二級玉米淀粉雙酶糖2.0，玉米漿2.0，甘蔗糖蜜1.0,尿素0.35，無機鹽等1.2/2m3三級玉米淀粉雙酶糖4.0，玉米漿1.5，甘蔗糖蜜1.0,液氨，復合維生素01mg/L，無機鹽等12/20m3發(fā)酵玉米淀粉雙酶糖13-14，玉米漿0.06-0.08，甘蔗糖蜜1.0,液氨，維生素50g，無機鹽等154/240m3培養(yǎng)基成分表三級種子的特點：①種量更大，生長速度快：工藝8小時產(chǎn)酸（%）12小時產(chǎn)酸（%）發(fā)酵周期（h)三級種子2.2～2.74.6～5.232二級種子1.0～1.52.6～3.435②糖酸轉(zhuǎn)化率高且穩(wěn)定工藝產(chǎn)酸（%）糖酸轉(zhuǎn)化率（%）單罐產(chǎn)量(噸）三級種子10.9359.821二級種子9.858184、接種量確實定移入種子的體積接種量＝—————————接種后培養(yǎng)液的體積過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一局部種子來源于種子罐，一局部來源于發(fā)酵罐。

接種量對菌體形態(tài)和產(chǎn)Υ亞麻酸的影響

楊博，中國油脂，2002Υ亞麻酸是一種人體必需多價不飽和脂肪酸，它是人體前列腺素的前體物質(zhì)，在預防與治療心腦血管疾病、糖尿病治療、增強免疫力、抗癌和保護皮膚等方面具有重要的生理功能。因發(fā)酵法生產(chǎn)Υ亞麻酸與從天然植物提取相比具有一系列優(yōu)點，發(fā)酵法生產(chǎn)Υ亞麻酸成了當今研究的一個熱點。

Υ亞麻酸發(fā)酵一般是采用絲狀真菌來進行，絲狀真菌的形態(tài)往往對發(fā)酵有較明顯的影響，而絲狀真菌發(fā)酵Υ亞麻酸時菌絲體形態(tài)的不同對發(fā)酵的影響很少有報道。采用被孢霉進行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體本研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和Υ亞麻酸產(chǎn)量。不同接種量影響菌體的生長和發(fā)酵發(fā)酵前期發(fā)酵液作為種子，發(fā)酵指數(shù)明顯提高發(fā)酵后期菌體自溶明顯，影響提煉收率20%種子罐＋10%發(fā)酵罐前期發(fā)酵液效果最好5、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原那么：對數(shù)生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結(jié)果定。舒琴，林產(chǎn)化學與工業(yè)，2004鏡檢：24小時多個桿菌首位相連成線形，處于繁殖旺盛期30小時開始出現(xiàn)芽孢6、種子的質(zhì)量要求：量：要求到達一定的濃度質(zhì):形態(tài)〔生長處于某個階段、均勻等等〕理化指標：C、N、P的含量，pH酶活等無污染本章小節(jié)：了解種子擴培的工藝過程及其中的根本概念理解種子擴培的目的和要求掌握控制種子質(zhì)量的根本方法和手段習題1、保證種子質(zhì)量的控制措施，首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是保證〔〕①無雜菌侵入 ②溫度恒定 ③通氣充分 ④接種量2、影響種子質(zhì)量的主要因素是〔〕①原材料質(zhì)量