臨床免疫學(xué)檢驗課件

第一章概論

免疫學(xué)（immunology)是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，了解其在免疫應(yīng)答反應(yīng)中對機體有益的防衛(wèi)功能和有害的病理損傷機制，研究有效的免疫措施，實現(xiàn)以防病、治病為目的的一門現(xiàn)代醫(yī)學(xué)學(xué)科基礎(chǔ)免疫學(xué)：從生物學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的角度，研究免疫系統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)、生理功能、信號傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)等。臨床免疫學(xué)：應(yīng)用免疫學(xué)的基礎(chǔ)理論和技術(shù)研究疾病的機制、診斷、治療和預(yù)防。第一節(jié)免疫學(xué)簡介免疫功能免疫防御免疫自穩(wěn)免疫監(jiān)視免疫應(yīng)答抗原機體抗體致敏淋巴細胞二、免疫組織與器官三、免疫細胞1、T淋巴細胞TCR-CD3復(fù)合物是T細胞抗原受體與一組CD3分子以非共價鍵結(jié)合而形成的復(fù)合物，是T細胞識別抗原和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的主要單位。TCR可分為TCRαβ和TCRγδ兩種類型CD4和CD8既能加強T細胞與APC或靶細胞的相互作用，又能參與抗原刺激TCR-CD3分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)協(xié)同信號分子參與T細胞活化的協(xié)同刺激信號主要是CD28--CD80/86，CTLA4--CD80/86給予已活化T細胞抑制信號。CD40-CD40L結(jié)合與B細胞的活化、記憶性B細胞形成和陰性、陽性選擇有關(guān)2、B淋巴細胞B細胞主要的三個功能：產(chǎn)生抗體、提呈抗原、分泌細胞因子參與免疫調(diào)節(jié)BCR復(fù)合物的組成BCR-Igα/Igβ形成B細胞的識別單位，Igα/Igβ作用是轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原與BCR結(jié)合產(chǎn)生的信號和參與mIg鏈的表達與轉(zhuǎn)運替代性BCR復(fù)合物表達于Pro-B和Pre-B細胞。參與B細胞活化及免疫應(yīng)答的其他分子

B細胞活化輔助受體CD19-CD21協(xié)同刺激分子CD40-CD40L補體受體CD35、CD21其他膜分子CD22、CD20、CD323、NK細胞

4、吞噬細胞及其作用吞噬殺傷和清除作用分泌細胞因子和其他炎性介質(zhì)加工處理提呈抗原，啟動特異性免疫應(yīng)答抗腫瘤作用

四、免疫分子1、免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)人類Ig根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同，分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其重鏈分別為：γ、α、μ、δ、ε輕鏈可分為兩型：κ、λ型二、免疫球蛋白的功能區(qū)每個功能區(qū)約由110個氨基酸組成，其氨基酸的序列具有相似形或同源性。其二級結(jié)構(gòu)是反向平行的β片層IgG于出生后3個月開始合成IgG多為單體，半衰期約為23天，占血清免疫球蛋白總量的75%～80%IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通過經(jīng)典途徑激活補體一、IgG五類免疫球蛋白的特性與功能IgG是唯一能通過胎盤的抗體通過Fc段與吞噬細胞表面FcR結(jié)合，發(fā)揮調(diào)理作用；與K細胞結(jié)合，發(fā)揮ADCC作用；與葡萄球菌A蛋白結(jié)合。具有抗菌、抗毒和抗病毒作用參與II、III型超敏反應(yīng)為五聚體，是分子量最大的Ig，稱巨球蛋白。IgM激活補體能力比IgG強天然血型抗體是IgMIgM是個體發(fā)育過程最早能產(chǎn)生的抗體，胚胎晚期已能合成，新生兒臍帶血中若IgM水平升高，表示該兒曾有宮內(nèi)感染二、IgMIgM是抗原刺激后出現(xiàn)最早的抗體，故檢測IgM水平可用于傳染病的早期診斷。IgM是B細胞抗原受體的主要成分也可參與II、III型超敏反應(yīng)分為血清型和分泌型兩種，血清型IgA主要由腸系膜淋巴組織中的漿細胞產(chǎn)生。而分泌型IgA（SIgA）是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等處的固有層中漿細胞產(chǎn)生。主要存在于初乳、唾液、淚液，以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜三、IgAIgD是B細胞的重要表面標志B細胞的分化過程中首先出現(xiàn)SmIgM，后來出現(xiàn)SmIgD，他的出現(xiàn)標志著B細胞成熟了。四、IgD又稱親細胞抗體CH2和CH3功能區(qū)可與肥大細胞、嗜堿性粒細胞上的高親和力Fcε受體結(jié)合，引起I型超敏反應(yīng)五、IgE2、補體系統(tǒng)補體：是存在于人和脊椎動物血清與組織液中一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)3、細胞因子細胞因子(Cytokine,CK)是由細胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物質(zhì)的統(tǒng)稱。細胞因子介導(dǎo)多種免疫細胞間的相互作用有多種其他名稱：單核因子、淋巴因子、集落刺激因子等細胞因子的共同特性是低分子量（15~30kD）的蛋白或糖蛋白；天然的細胞因子由抗原、絲裂原或其他刺激物活化的細胞分泌；且多以單體形式存在；以非特異性方式發(fā)揮作用；以較高的親和力與其受體結(jié)合；細胞因子的分泌是一個短時自限過程。細胞因子可以旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌的方式發(fā)揮作用一種細胞可產(chǎn)生多種細胞因子，不同類型的細胞也可產(chǎn)生一種或幾種相同的細胞因子；一種細胞因子可對多種靶細胞發(fā)揮作用，產(chǎn)生多種不同的生物學(xué)效應(yīng)，稱多效性；幾種不同的細胞因子也可同一種靶細胞發(fā)生作用，產(chǎn)生相同或相似的生物學(xué)效應(yīng)，稱重疊性；一種細胞因子可以抑制另一種細胞因子的某些生物學(xué)作用，表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)；可以增強另一細胞因子的某些生物學(xué)作用表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。第二節(jié)細胞因子的分類和生物學(xué)活性細胞因子的種類：白介素在白細胞間發(fā)揮作用的細胞因子；干擾素具有干擾病毒感染和復(fù)制的能力；腫瘤壞死因子一種能使腫瘤發(fā)生出血壞死的物質(zhì)；集落刺激因子指能刺激多能造血干細胞和不同發(fā)育分化階段的造血干細胞進行增殖分化，并在半固體培養(yǎng)基中形成相應(yīng)集落的細胞因子；生長因子具有刺激細胞生長作用的細胞因子；趨化性細胞因子由白細胞與造血微環(huán)境中的基質(zhì)細胞分泌，可結(jié)合在內(nèi)皮細胞的表面，具有對中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的趨化和激活活性。4、白細胞分化抗原和黏附分子白細胞分化抗原概念指血細胞在分化成熟為不同譜系、分化的不同階段及細胞活化過程中，出現(xiàn)或消失的細胞表面標記分子。CD應(yīng)用以單克隆抗體鑒定為主的方法，將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原稱CD黏附分子是眾多介導(dǎo)細胞間或細胞與細胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱。黏附分子以受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用，參與細胞的識別、活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖和分化、伸展與移動。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點分為：整合素家族、選擇素家族、免疫球蛋白超家族、鈣粘蛋白家族和未歸類的黏附分子功能免疫細胞識別中的輔助受體和協(xié)同活化信號炎癥過程中白細胞和血管內(nèi)皮細胞黏附淋巴細胞歸巢第二節(jié)臨床免疫學(xué)臨床免疫學(xué)：應(yīng)用免疫學(xué)的基礎(chǔ)理論和技術(shù)研究疾病的機制、診斷、治療和預(yù)防的分支學(xué)科。免疫病理和免疫性疾病移植免疫學(xué)腫瘤免疫學(xué)生殖免疫學(xué)精神免疫學(xué)第三節(jié)免疫學(xué)檢驗免疫檢驗的一個重要組成部分是研究免疫技術(shù)在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用。第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理

抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。物質(zhì)基礎(chǔ):

抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合抗原抗體之間的結(jié)合力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗體結(jié)合力示意圖一、抗原抗體結(jié)合力抗體分子上一個抗原結(jié)合點與對應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結(jié)合力親和力(affinity)抗原抗體親和力示意圖二、抗原抗體的親和力和親合力抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強度親合力(avidity)抗原抗體親合力示意圖

可見反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物

(疏水膠體)電解質(zhì)

抗原(親水膠體)

抗體(親水膠體)

+三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點特異性可逆性比例性階段性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補性一、特異性兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)交叉反應(yīng)（crossreactions）抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖二、可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性影響因素：抗體對相應(yīng)抗原的親合力－親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對復(fù)合物的影響－pH、離子強度

前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalencezone)：

抗原抗體比例合適

抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系三、比例性第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見第二階段：反應(yīng)可見階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細胞溶解等現(xiàn)象四、階段性第三節(jié)影響抗原抗體反應(yīng)的因素抗原、抗體反應(yīng)物的自身因素環(huán)境因素一、反應(yīng)物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目抗體:來源、特異性、親和性、效價電解質(zhì):生理鹽水或緩沖液酸堿度:pH6～pH9溫度:15℃～40℃，37℃最適二、環(huán)境因素反應(yīng)類型實驗技術(shù)結(jié)果判斷凝集反應(yīng)直接凝集試驗觀察凝集現(xiàn)象間接凝集試驗同上抗球蛋白試驗同上沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗觀察沉淀，檢測濁度免疫電泳技術(shù)觀察掃描沉淀峰、沉淀弧補體參與的反應(yīng)補體溶血試驗觀察測定溶血現(xiàn)象補體結(jié)合試驗同上第四節(jié)免疫學(xué)檢測技術(shù)的類型反應(yīng)類型實驗技術(shù)結(jié)果判斷中和反應(yīng)病毒中和試驗檢測病毒感染性毒素中和試驗檢測外毒素毒性標記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)檢測熒光現(xiàn)象放射免疫技術(shù)檢測放射性強度酶免疫技術(shù)檢測酶底物顯色發(fā)光免疫技術(shù)檢測發(fā)光強度金免疫技術(shù)檢測金顆粒沉淀第一節(jié)免疫原的制備

免疫原(immunogen)是能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體或致敏性淋巴細胞的抗原顆粒性抗原－細胞、細菌、寄生蟲可溶性抗原－蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核酸細胞抗原：綿羊紅細胞細菌抗原：菌體抗原、鞭毛抗原寄生蟲體抗原：蟲卵一、顆粒性抗原的制備組織細胞抗原的制備：高速搗碎法－組織搗碎機搗碎研磨法－用玻璃勻漿器或乳缽研磨

（一）可溶性抗原的制備二、可溶性抗原的制備和純化

組織細胞或培養(yǎng)細胞可溶性抗原的制備：

反復(fù)凍融法－-20℃凍結(jié)，然后室溫融化超聲破碎法－超聲波（1～20kHz）自溶法－自身酶系酶處理法－溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶表面活性劑處理法－SDS、去氧膽酸鈉、二乙基十六烷基溴

1.超速離心法：差速離心法－低速和高速離心交替進行密度梯度離心法－區(qū)帶離心法（二）可溶性抗原的純化2.選擇性沉淀法：核酸去除法－氯化錳、硫酸魚精蛋、鏈霉素鹽析法－硫酸銨、硫酸鈉有機溶劑沉淀法－乙醇、丙酮聚合物沉淀法－聚乙二醇

4.離子交換層析法：利用蛋白質(zhì)帶電荷不同進行分離離子交換劑：

離子交換纖維素、離子交換凝膠、離子交換樹脂

3.凝膠過濾法（層析法）：利用凝膠的分子篩作用，對分子量不同的蛋白質(zhì)進行分離

5.親和層析法：利用生物大分子之間具有的專一性親和力

(1)親和層析支持物的選擇：①非特異性吸附低；②液體流速快；③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；④有合適豐富的化學(xué)基團，與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合；⑤有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。最常用的支持物是Separose4B

(2)配體的選擇條件：①抗原或抗體必須單一特異性；②抗原與抗體必須具有較高的親和力；③配體必須有一個適當?shù)幕瘜W(xué)基團。6.電泳法：

利用分子量和電荷量不同進行分離

（三）純化抗原的鑒定蛋白含量測定：紫外吸收法、雙縮脲法、酚試劑法分子量測定：SDS、凝膠過濾純度鑒定：醋酸纖維膜電泳、SDS、毛細管電泳、等電聚焦、高效液相層析免疫活性鑒定：雙向免疫擴散、免疫電泳、ELISA三、免疫球蛋白片段免疫原的制備免疫球蛋白具有抗原性，也可作為免疫原免疫動物制備抗體應(yīng)用免疫球蛋白片段的制備：非共價鍵解離法－改變pH、利用強變性劑共價鍵解離法－氧化法和還原法溴化氰裂解法酶解法－木瓜酶、胃蛋白酶

四、人工抗原的制備

半抗原(hapten)：僅有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)如多肽、甾體激素、核苷、某些藥物等載體(carrier)：賦予半抗原以免疫原性的物質(zhì)1.人工結(jié)合抗原①蛋白質(zhì)：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白牛甲狀腺球蛋白血藍蛋白②多肽聚合物：多聚賴氨酸（polylysine）③大分子聚合物：羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose,CMC)

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）

載體四、人工抗原的制備2.人工合成抗原MBL結(jié)構(gòu)四、人工抗原的制備3.基因重組抗原破傷風毒素C基因片段的PCR結(jié)果

SDS和Westernblot分析純化的重組表達產(chǎn)物

免疫佐劑免疫佐劑（immunoadjuvant）：預(yù)先或與抗原同時注入體內(nèi)，可增強機體對該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的類型的物質(zhì)稱為免疫佐劑,簡稱佐劑（adjuvant）。

化合物:氫氧化鋁、明礬、礦物油、吐溫-80、弗氏不完全佐劑以及人工合成的多聚肌苷酸∶胞苷酸(polyI∶C)、脂質(zhì)體生物制劑:處理改造的細菌及代謝產(chǎn)物，如卡介苗、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌及CTB、LPS和類脂A、胞壁酰二肽等；細胞因子及熱休克蛋白用于人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、polyI∶C、胞壁酰二肽、細胞因子、熱休克蛋白常用于動物實驗的佐劑：弗氏佐劑(Freund’sadjuvant)

一、佐劑的種類弗氏佐劑(Freund,sadjuvant)：弗氏完全佐劑－羊毛脂與液體石蠟的混合物弗氏不完全佐劑－弗氏完全佐劑加卡介苗乳化方法：研磨法和攪拌混合法

改變抗原物理性狀，延緩其降解和排除，更有效刺激免疫系統(tǒng)。刺激單核-吞噬細胞系統(tǒng)，增強其處理和提呈抗原的能力。刺激淋巴細胞增殖和分化。

二、佐劑的作用機制圖2:Mannan-OVA偶聯(lián)物的SDS(10%)分析1:Proteinmarker2:OVA3:Mannan4:Mannan-OVA1234第三節(jié)抗血清的制備

抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動物，該動物在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個B細胞克隆被激活并產(chǎn)生針對某一抗原多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體多克隆抗體的產(chǎn)生示意圖多克隆抗體(polyclonalantibody,pcAb)：天然抗原刺激多種B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的多種抗體的混合物

抗原來源與動物種屬的關(guān)系

種屬差異越遠，免疫原性越強

動物個體的選擇

適齡、健康、體重符合要求

抗原的性質(zhì)一、免疫動物的選擇免疫原的劑量

中間劑量范圍內(nèi)，免疫原劑量增加可獲得高效價抗體

免疫間隔時間

第一次和第二次間隔10～20天，三次及以后間隔7～10天免疫途徑

皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)

二、免疫程序頸動脈采血法：家兔、綿羊、山羊

心臟采血法：

家兔、豚鼠、大鼠、雞

靜脈采血法：

家兔、山羊、綿羊

三、動物采血法抗血清的純化

抗原免疫動物制備的抗血清是成分復(fù)雜的混合物，除含有特異性抗體外，還存在與目的抗體不相關(guān)的成分。純化目的是除去這些不相關(guān)成分，防止抗血清中其他雜抗體干擾試驗結(jié)果。鹽析法：硫酸銨鹽析法、硫酸鈉鹽析法凝膠過濾法：常結(jié)合鹽析法離子交換層析法：DEAE纖維素、QAE-sephadex、QAE纖維素親和層析法：純化抗原或SPA交聯(lián)Sepharose4B制成親和層析柱

一、IgG類抗體的純化親和層析法：雜抗原交聯(lián)Sepharose4B柱吸附劑方法：借助雙功能試劑用不含特異抗原的抗原混合液制成固相吸附劑二、單價特異性抗血清抗血清的鑒定和保存抗體特異性的鑒定：雙向免疫擴散法抗體效價的鑒定：凝集試驗、雙向免疫擴散試驗、ELISA抗體純度的鑒定：SDS、雙向免疫擴散試驗、免疫電泳抗體親合力的鑒定：平衡透析法、ELISA、RIA競爭結(jié)合試驗

一、抗血清的鑒定2℃～8℃保存：短期保存冰凍保存：保存5年真空干燥保存：保存5～10年二、抗血清的保存

第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與小鼠骨髓瘤細胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體

CésarMilsteinGeorgesJ.F.K?hler1946～19971922～2002抗體種類：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細胞：壽命長雜交瘤細胞：壽命長，單克隆抗體流程一、雜交瘤技術(shù)（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶）胸腺嘧啶核苷激酶不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-

次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶胸腺嘧啶核苷激酶與提供淋巴細胞的動物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細胞

動物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重（二）免疫脾細胞細胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強免疫免疫小鼠。淋巴細胞。漿細胞培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液（三）細胞融合細胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑作用機理：誘導(dǎo)細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同培養(yǎng)骨髓瘤細胞：選擇對數(shù)生長期的細胞進行傳代培養(yǎng)細胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細胞返祖：定期用8-AG處理細胞注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中免疫脾細胞的制備：1×108的淋巴細胞無菌手術(shù)飼養(yǎng)細胞：細胞密度過低不利于細胞生長繁殖常用小鼠腹腔細胞作飼養(yǎng)細胞其中MQ還有清除死亡細胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細胞的純化。飼養(yǎng)細胞骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3)50%PEG1min內(nèi)加完;2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液融合方法SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：2～51ml50%的PEG（無菌，預(yù)溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用根據(jù)細胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時每孔細胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液細胞融合10～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細胞的早期培養(yǎng)HGPRT酶與TK酶：次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)應(yīng)用液：8-雜氮鳥嘌呤聚乙二醇HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNAHAT選擇作用：淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻SP2/O:HGPRT-，TK-;長命脾細胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細胞、脾細胞與雜交瘤細胞雜交瘤細胞：長期生長繁殖利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法(limitingdilution)

顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)

二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存特點：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含0.5～1個細胞有限稀釋法效率最高價格昂貴FACS配制方案：雜交瘤細胞（（1～5）x106/ml)+細胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇防止污染避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡細胞冷凍的意義

第二節(jié)單克隆抗體的制備

經(jīng)過反復(fù)克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應(yīng)立即擴大培養(yǎng)（除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。一、單克隆抗體的產(chǎn)生動物體內(nèi)誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只體外培養(yǎng)法：中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)

單抗含量不高，牛血清Ab難以去除腹腔注射法前5天進行,預(yù)先腹腔注射pristane（1～5）×106細胞1～3w形成腹水高滴度腹水二、單克隆抗體的純化腹水或細胞上清液

濾紙去掉脂質(zhì)和大顆粒

離心去除細胞碎片和蛋白聚合物

鹽析

凝膠過濾

離子交換層析

辛酸提取

親和純化法

最有效

鹽析沉淀親和層析離子交換層析McAb的純化Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應(yīng)效價測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數(shù)法及微機集群分析親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細胞染色體40條，SP2/0細胞68條，雜交瘤細胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)對環(huán)境敏感性（一）單克隆抗體的特性優(yōu)點：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標記抗體為特點的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療（二）單克隆抗體的優(yōu)點與局限性局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜、費時費工、價格較高

McAb

PcAb

抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低

穩(wěn)定低高沉淀反應(yīng)無有成本高低McAb與PcAb的比較McAbandPcAb第四節(jié)單克隆抗體的應(yīng)用檢驗醫(yī)學(xué)診斷試劑蛋白質(zhì)的提純小分子抗體的應(yīng)用抗體融合蛋白的應(yīng)用雙特異抗體的應(yīng)用抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景病原微生物抗原、抗體的檢測腫瘤抗原的檢測免疫細胞及其亞群的的檢測激素測定細胞因子的測定一、檢驗醫(yī)學(xué)診斷試劑病原體測定：肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－弓形蟲,風疹病毒,巨細胞病毒，單純皰疹病毒細胞表面CD測定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型激素的測定：

內(nèi)分泌疾病的診斷藥物測定(TDM)：抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛研究工作中的探針：越來越多未知功能cDNA的克隆對復(fù)雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加第三節(jié)基因工程抗體制備基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。

將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體一、人源化抗體方法：從雜交瘤細胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表達人-鼠嵌合抗體特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力（一）嵌合抗體定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體意義：多種特異的鼠源單抗有可能應(yīng)用于臨床治療（二）改型抗體Fab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段SdAb：單區(qū)抗體

二、小分子抗體小分子抗體許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價的抗原結(jié)合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯(lián)或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應(yīng)細胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細胞更容易與腫瘤細胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細胞的作用。四、雙特異性抗體定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術(shù)可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性

五、噬菌體抗體庫技術(shù)用PCR擴增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面用抗原抗體反應(yīng)篩選出表達所需要抗體的克隆并擴增。使抗體基因以分泌的方式表達，獲得可溶性的抗體片段。抗體庫：組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機組合人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經(jīng)免疫的正常人（一）基本原理和程序噬菌體抗體庫從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B淋巴細胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù)擴增不同的Ig基因片段；構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有λ噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達的噬菌體抗體庫(surfacedisplayantibodylibrary)常用載體；表達載體轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。構(gòu)建噬菌體抗體庫模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以達到或超過1011庫容,能包含B細胞全部克隆建庫的外源基因來自人體多克隆細胞的總mRNA通用引物具有人的種屬普遍性抗體的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性（二）噬菌體抗體庫技術(shù)的特點避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)抗體庫的大容量抗體庫極高的篩選效率可獲得高親和力的人源化抗體VH和VL基因的隨機重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程所用的抗體基因又來自人體六、抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景在腫瘤體外診斷中的應(yīng)用在腫瘤診斷中的應(yīng)用在腫瘤治療中的應(yīng)用

思考題試述B淋巴細胞雜交瘤選擇培養(yǎng)基的原理?；蚬こ炭贵w有哪些類型？B淋巴細胞雜交瘤的骨髓瘤細胞具備哪些特點？小結(jié)

雜交瘤單克隆抗體制備技術(shù)的原理是利用聚乙二醇作為細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與具有在體外不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細胞融為一

體，在HAT選擇性培養(yǎng)基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細胞生長，經(jīng)過反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選和單個細胞培養(yǎng)（克隆化）,最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體,又能不斷繁殖的雜交瘤

細胞系，將這種細胞擴大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其產(chǎn)生的腹水中即可得到高效價的單克隆抗體。一、基本原理

1.雙抗體夾心法(測HBsAg、HBeAg)抗-HBs-HBsAg-抗HBs-HRP復(fù)合物抗-HBe-HBeAg-抗HBe-HRP復(fù)合物顏色深淺與量成正比酶結(jié)合物待檢血清底物2.競爭法(測HBeAb、HBcAb)HBeAb－－中和競爭法顏色深淺與量成反比加底物顯色待檢血清酶結(jié)合物中和試劑HBcAb－－抑制競爭法底物顏色深淺與量成反比酶結(jié)合物待檢血清二、實驗材料1.市售成套檢測試劑盒2.待檢血清試驗準備：從冷藏環(huán)境中取出試劑盒，在室溫下平衡30分鐘，同時洗滌液做1:20稀釋。對待測的樣品進行編號加待測標本：每孔加入50μl，并設(shè)陽性對照1孔，陰性對照1孔，空白對照1孔。HBcAb檢測前需要將血清稀釋30倍（生理鹽水）。加酶結(jié)合物，每孔50μl，空白孔不加，充分混勻，置37℃孵育30分鐘。洗滌，棄去孔中液體，用洗滌液洗3次，每次靜置5秒，于吸水紙上充分拍干。加顯色劑，先加顯色劑A、B各一滴，放置37℃避光孵育15分鐘。終止反應(yīng)：每孔加入終止液50μl，混勻。三.1檢測HBsAg、HBeAg、HBcAb操作方法準備加樣加酶結(jié)合物洗滌加顯色劑AB加入終止液溫育溫育三.2檢測HBeAb操作方法HBeAb檢測時加中和試劑一滴準備加樣加酶結(jié)合物洗滌加顯色劑AB加入終止液溫育溫育四、結(jié)果判斷

HBsAg、HBeAg結(jié)果判斷:

顯色陽性不顯色陰性HBeAb、HBcAb結(jié)果判斷:

顯色陰性不顯色陽性1、肉眼判定2、酶標儀判定測定OD450值五、注意事項1、從冷藏環(huán)境取出的試劑應(yīng)置37度平衡30分鐘后使用2、試劑使用前應(yīng)搖勻，棄去1一2滴后垂直滴加3、洗滌時，將洗滌液注滿每孔，靜置10秒鐘，棄去孔內(nèi)液體拍干，如此反復(fù)5次4、本試劑盒及臨床樣本均應(yīng)視為有潛在傳染性，嚴格無菌操作規(guī)則；有任何試劑接觸皮膚和眼睛，用大量清水清洗5.終止液為硫酸，具有腐蝕性7.空白孔、陰性對照孔、陽性對照孔設(shè)置順序8.空白對照應(yīng)加的試劑有：顯色劑AB各50ul，終止液50ul思考題分析可能影響實驗的因素。復(fù)習(xí)實驗結(jié)果的臨床意義。2.雙抗原夾心法(測HBsAb)HBsAg-抗-HBsAg-HBsAg-HRP復(fù)合物顏色深淺與量成正比1、關(guān)于抗HBc稀釋與否的問題：我國境內(nèi)所開發(fā)和使用的試劑盒，基本都是要求進行一定倍數(shù)稀釋的，最為主要的原因是我國是乙肝大國，按照1992-1995年全國病毒性肝炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果乙型肝炎病毒核心抗體（抗－HBc）陽性率為49.8％，抗-HBc作為HBV感染指標存在時間很長甚至終生攜帶，但抗-HBc低度在不同感染時期確存在很大差異，感染轉(zhuǎn)歸后抗-HBc一直低低度持續(xù)存在，因此流行病學(xué)上把低低度抗-HBc作為HBV既往感染的一個指標，另一方面HBV感染現(xiàn)癥病人抗-HBc低度一般情況下都比較高，衛(wèi)生部臨床檢驗中心根據(jù)人群抗-HBc低度情況對流行病學(xué)意義和診斷意義的低度進行了相關(guān)規(guī)定。

2、關(guān)于操作復(fù)雜的問題：這是一個科學(xué)的問題以及對病人負責的問題，事實上試劑生產(chǎn)廠家在研發(fā)該試劑時候，進行了大量實驗，包括對稀釋比例等條件進行了比較細致的摸索，要想得到相對準確的就結(jié)果，原則上必須遵循說明書的相關(guān)要求。臨床都應(yīng)該稀釋做的,即使你是做體檢,用原倍的一般只適合流行病學(xué),不過衛(wèi)生部的質(zhì)評物質(zhì)是不稀釋的,呵呵,我們上次就是因為平時做習(xí)慣了,沒有注意到稀釋和不稀釋結(jié)果報告是不一樣的,結(jié)果報錯了1．CoV=陰性對照值平均OD值×2.1。

2．陰性對照OD值大于0.05，按測得值計算。

3．陰性對照OD值低于0.05，作0.05計算。

4．OD值≥CoV者為陽性，OD值＜CoV者為陰性。放射免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標記技術(shù)三大經(jīng)典標記技術(shù)

第一節(jié)概述

主要試劑:

酶標記的抗體或抗原酶標物特點：

免疫學(xué)活性酶對底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性原理及特點特點：靈敏度高、特異性強、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。原理：酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析

原理及特點

酶免疫技術(shù)分類

一、按檢測對象的不同一般分為兩類：

1.酶免疫組織化學(xué)技術(shù)（enzymeimmunohistochemistry,EIH）:用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原或抗體。

2.酶免疫測定技術(shù)(enzymeimmunoassay,EIA):用于檢測體液樣本中可溶性抗原或抗體。二、根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的和游離的酶標記物，可分為：

1.均相法（homogenous）：不需要分離結(jié)合和游離的酶標記物，直接進行測定。

2.異相法(heterogenous)：需要分離結(jié)合和游離的酶標記物后才能進行測定。

酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位

液體標本中抗原或抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定

酶標記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理一、均相酶免疫測定最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫測定分類：液相酶免疫測定固相酶免疫測定以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是目前最為常用的固相酶免疫測定與均相不同之處需分離游離與結(jié)合的酶標記物二、非均相酶免疫測定

第二節(jié)酶標記物的制備

標記酶的要求：

活性高性質(zhì)穩(wěn)定專一性強酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉

一、酶和酶作用底物辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標記用酶常用酶酶和酶作用底物堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測定

常用酶酶和酶作用底物HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

酶和酶作用底物AP的底物

β-Gal的底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

酶作用后，生成高強度熒光物，用熒光計測量。常用底物酶和酶作用底物酶免疫技術(shù)的核心組成部分

酶結(jié)合物（conjugate）酶標記物通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

二、酶標記抗體或抗原的制備抗原要求純度高，抗原性完整抗體需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。

制備方法要求制備方法要求技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好標記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性酶標記物穩(wěn)定，不形成聚合物制備方法過碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標記抗體或抗原

戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質(zhì)量較均一。

純化及鑒定標記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度

常用的純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純

第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗

底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234一、基本原理固相的抗原或抗體

酶標記物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)的底物

三個必要試劑

二、方法類型及反應(yīng)原理雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色應(yīng)用：

二價或二價以上的較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測抗原的方法1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結(jié)合3、加酶標抗體無抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY競爭法

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測抗原的方法洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標抗原競爭與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標抗原，酶標抗原與抗體結(jié)合YE間接法方法

用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用

常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定ELISA檢測抗體的方法1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結(jié)合3、加酶標抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體的方法競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法

應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測ELISA檢測抗體的方法捕獲法

應(yīng)用：

病原體急性感染診斷中的IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測抗體的方法捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體底物顯色

洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標記物迅速分離的最常用方法

固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面

三、技術(shù)要點包被技術(shù)1.固相載體要求

結(jié)合抗體或抗原的容量大抗體或抗原牢固地固定在其表面不影響免疫反應(yīng)性利于反應(yīng)充分進行固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟種類聚苯乙烯塑料磁性微球

固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點，消除非特異性吸附包被coating封閉blocking包被與封閉抗體匹配試驗確定最佳工作濃度

第四節(jié)

酶免疫印跡試驗

酶免疫印跡試驗（EIBT）是一種以膜為載體的酶免疫技術(shù)。以膜為固相載體將蛋白質(zhì)抗原直接吸附或通過電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移至膜載體表面，形成固相抗原。加入特異性抗體或酶標記抗抗體，溫育后形成免疫復(fù)合物存在于膜表面，加底物顯色通過膜表面形成有色斑點或條帶判定檢測結(jié)果。

斑點-ELISA（dot-ELISA）實驗原理與常規(guī)的ELISA相同，不同之處在于斑點-ELISA所用載體為蛋白質(zhì)具有極強吸附力（近100%）的硝酸纖維素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色實驗方法為：加少量（1~2μl）抗原于膜上，由于NC膜吸附能力強,故需在干燥后進行封閉；然后滴加樣品血清，其中的待檢抗體即與NC膜上抗原結(jié)合；洗滌后再滴加酶標二抗，最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如HRP標記物，常用二氨基聯(lián)苯胺）；陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色斑點。斑點酶免疫試驗斑點-ELISA的優(yōu)點為：NC膜吸附蛋白力強，微量抗原吸附完全，故檢出靈敏度可較普通ELISA高6~8倍；試劑用量教ELISA節(jié)約約10倍；操作簡單，實驗及結(jié)果判斷不需特殊設(shè)備條件；吸附抗原（抗體）或已有結(jié)果的NC膜可長期保存（-20℃可長達半年），不影響其活性。

免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法（enzymelinkedimmunoelectrotransferblot，EITB），因與Southen早先建立的檢測核酸的印跡方法Southenblot相類似，亦被稱為Westernblot。免疫印跡（westernblotting）是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測的基礎(chǔ)上發(fā)展起來一項檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)。它將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。

免疫印跡試驗典型的印跡實驗包括三個步驟：

①蛋白質(zhì)的電泳分離

②將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上，用非特異性，非反應(yīng)活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域

③免疫學(xué)檢測。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進行免疫學(xué)分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度，使其成為使用最廣泛的免疫化學(xué)方法之一。

第五節(jié)

與生物素-親和素系統(tǒng)相關(guān)的酶免疫技術(shù)

生物素(維生素H)屬于維生素B類，是一種水溶性維生素，以低濃度廣泛分布于所有的動、植物中，在蛋黃、酵母、牛奶及家禽的內(nèi)臟中含量較高。另外，人體腸道的細菌亦能大量合成生物素，分布于全身各組織，其中在肝、腎中含量最多。

生物素(維生素H)屬于維生素B類，是一種水溶性維生素，以低濃度廣泛分布于所有的動、植物中，在蛋黃、酵母、牛奶及家禽的內(nèi)臟中含量較高。另外，人體腸道的細菌亦能大量合成生物素，分布于全身各組織，其中在肝、腎中含量最多。

生物素（Biotin)有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，I環(huán)為與親和素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為結(jié)合抗體和其它生物大分子的部位。親和素(Avidin):親和素是一種堿性糖蛋白，可由蛋清中提取，耐熱并耐多種蛋白水解酶的作用，分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結(jié)合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素（streptavidin）。

親和素（Avidin)耐熱并耐受多種蛋白水解酶的作用，與生物素結(jié)合后穩(wěn)定性更好。每個親和素能結(jié)合四個分子的生物素。BAS在應(yīng)用中的基本類型有二種:一類以游離親和素為中間物,分別連接包含生物素化大分子的待檢反應(yīng)體系和標記生物素,稱為BAB法(biotin-avidinbind,BAB);后來又在此基礎(chǔ)上發(fā)展了親和素-生物素化酶復(fù)合物技術(shù)(avidin-biotin-peroxidasecomplex,ABC).

另一類是直接用標記親和素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進行檢測的BA法,或稱標記親和素·生物素法(labeledavidin-biotin,LAB)。

PAP-ABC復(fù)合法

第六節(jié)

均相酶免疫測定EMIT示意圖CEDIA示意圖免疫細胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細胞，主要包括淋巴細胞、抗原提呈細胞、各種粒細胞、紅細胞和肥大細胞等。

紅母細胞紅細胞血小板髓系干細胞粒細胞和單核細胞樹突細胞

T細胞和B細胞

NK細胞和樹突細胞造血干細胞的分化造血干細胞髓紅系干細胞

淋巴干細胞根據(jù)各類免疫細胞獨特的表面標志及其特殊功能。用體外或體內(nèi)方法將各種參與免疫反應(yīng)的細胞從血液或臟器中分離出來，對其進行數(shù)量和功能測定，是觀察機體免疫狀態(tài)的一種重要手段,也是細胞生物學(xué)、免疫學(xué)中進行細胞分離、培養(yǎng)和建立細胞株等研究的重要基本技術(shù)之一。第一節(jié)免疫細胞的分離與純化白細胞的分離外周血單個核細胞的分離淋巴細胞的純化與亞群分離細胞活力檢測白細胞的分離血中紅細胞和白細胞的比例約為600～1000:1，兩類細胞密度不同，其沉降速度各異，通常用以下兩種方法分離。1．自然沉降法是利用血細胞自然沉降率的分離方法。采集外周靜脈血，肝素抗凝，將含抗凝血的試管直立靜置室溫30～60min后，由于紅細胞沉降速率較快，可使白細胞與之分離。上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，緊貼紅細胞層上面的灰白層為白細胞。吸取富含白細胞的細胞群，離心洗滌后加入少量蒸餾水，經(jīng)短時間的低滲處理，使紅細胞裂解，經(jīng)過反復(fù)洗滌可得純度較高的白細胞懸液。2．聚合物加速沉降法某些高分子聚合物如明膠、右旋糖酐、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等可使紅細胞凝集成串，加速紅細胞沉降，使之更易與白細胞分離。此法白細胞獲得率比自然沉降法高，但其中的明膠法可使白細胞粘性增加，對實驗產(chǎn)生一定影響。二、外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)主要指淋巴細胞和單核細胞，是免疫學(xué)實驗中最常用的細胞群，也是進行T細胞和B細胞分離純化的重要環(huán)節(jié)。PBMC的密度與血液中的其他成分不同。血小板的密度為1.030～1.035，粒細胞為1.092，紅細胞為1.093，淋巴細胞和單核細胞的密度為1.075～1.090。利用一種密度介于1.075～1.092之間、近于等滲的溶液(分層液)進行密度梯度離心，可使不同類別的血細胞按其相應(yīng)密度分布，從而被分離。常用的分層液有聚蔗糖-泛影葡胺分層液法（Ficoll-Hypaque分層液）和Percoll分層液法兩種。(一)聚蔗糖-泛影葡胺分層液法聚蔗糖-泛影葡胺分層液法是分離PBMC一種單次密度梯度離心分離法。(二)Percoll密度梯度離心法Percoll分離液經(jīng)高速離心后可形成一個連續(xù)的密度梯度,不同密度的細胞將懸浮于各自不同的密度區(qū)帶,從而將密度不等的細胞分離純化。二、淋巴細胞的純化與亞群分離PBMC懸液主要含淋巴細胞，但一般還混雜有數(shù)量不等的單核細胞及少量粒細胞、紅細胞和血小板。為獲得高純度的淋巴細胞或其亞群，可采用如下分離去除方法。(一)紅細胞的去除一般采用無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。(二)血小板的去除將PBMC懸液通過離心洗滌2～3次，常可去除PBMC中絕大部分混雜的血小板。在某些疾病狀態(tài)下，若外周血中血小板數(shù)量異常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度離心法去除PBMC中混雜的血小板。(三)單核細胞和粒細胞的去除1．粘附去除法單核細胞和粒細胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝膠的特性，通過PBMC與玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的非粘附細胞即為淋巴細胞。亦可應(yīng)用玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG-10柱，清除粘附的細胞，洗脫液中主要是淋巴細胞。此法簡便易行，對細胞損傷極少，缺點是B細胞也有較弱的粘附能力，因此有部分B細胞丟失。該法去除單核細胞后，大約95%的單個核細胞為淋巴細胞，活性大于95%。2．羰基鐵粉吞噬法單核細胞具有吞噬羰基鐵粉的能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細胞密度增大，再經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心后，則單核細胞沉積于管底而被去除。也可在單核細胞懸液內(nèi)加入羰基鐵粉顆粒，待單核細胞充分吞噬羰基鐵粉后，用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中即含較純的淋巴細胞。(四)淋巴細胞亞群的分離淋巴細胞是復(fù)雜的不均一的細胞群體，它包括了許多形態(tài)相似而表面標志和功能各異的細胞群和亞群。根據(jù)細胞的表面標志和功能等不同，借助多種方法分離淋巴細胞亞群。1．E花環(huán)分離法成熟的T細胞表面表達綿羊紅細胞(SRBC)受體，即E受體。T細胞能與SRBC結(jié)合形成E花環(huán)，而B細胞則不能。該方法簡便易行，所獲細胞的純度可達95%～99%，可同時獲得B細胞。缺點是E花環(huán)形成后可能使T細胞活化。E-花環(huán)T細胞B細胞花環(huán)形成細胞綿羊紅細胞2．尼龍棉柱分離法將淋巴細胞懸液加入尼龍棉柱內(nèi)，B細胞易粘附于尼龍棉纖維(聚酰胺纖維)表面，而T細胞則不易粘附，由此可將T細胞與B細胞分離。該法簡便易行，不需特殊儀器，淋巴細胞活性不受影響，所獲T細胞純度可達90%以上，B細胞純度可達80%。3.補體細胞毒法

針對淋巴細胞CD分子的單克隆抗體與淋巴細胞相應(yīng)的CD分子結(jié)合，借助補體依賴的細胞毒作用，將擬剔除的抗原陽性細胞破壞，收集未被破壞的抗原陰性細胞達到免疫細胞分離的目的。補體依賴的細胞毒試驗（CDC）染料補體4．親和板結(jié)合分離法分為直接法和間接法。直接法是用特異性抗體包被塑料平皿或細胞培養(yǎng)板，表達特定膜抗原的細胞即與相應(yīng)抗體結(jié)合而被吸附于平皿或培養(yǎng)板表面，懸液中為不表達特定膜抗原的細胞。間接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗體(第二抗體)包被平皿，將預(yù)先與特異性單克隆抗體結(jié)合的淋巴細胞與之反應(yīng)后，可發(fā)生吸附固定，從而被分離。5．免疫磁珠分離法包括直接法和間接法。直接法是將特異性抗體與磁性微粒(平均直徑小于1.5μm)交聯(lián)，形成免疫磁珠(IMB)。IMB與表達相應(yīng)膜抗原的細胞結(jié)合，用強磁場分離磁珠結(jié)合細胞與磁珠非結(jié)合細胞，從而對特定細胞進行陽性或陰性分選。間接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗體(第二抗體)包被磁性微珠，可與任何已結(jié)合鼠源性單克隆抗體(第一抗體)的細胞發(fā)生反應(yīng)，從而對細胞進行分離。MACS(陽性選擇法）NSMACS(陰性選擇法）NS6．流式細胞術(shù)分離法用流式細胞儀可自動化地對單個細胞進行多參數(shù)定量測定分析，從而可分選出用特異性熒光抗體標記的陽性細胞。其優(yōu)點是分離細胞準確、快速，純度達90%～100%，回收率高，所分離的細胞可保持無菌，細胞結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性不受影響。缺點是費用昂貴，擬分離的細胞在混合群體中含量過低時，耗時較長才能獲得所需數(shù)量細胞。五、細胞活力檢測臺盼藍(trypanblue)染色法第二節(jié)淋巴細胞的數(shù)量檢測不同的淋巴細胞表面具有特定的表面標志，借此可以對不同的淋巴細胞及其亞群進行鑒定和計數(shù)。T細胞表面標志及其亞群

CD3+CD4+CD8-輔助性T細胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+細胞毒性T細胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（regulatoryTcell,TrorTreg）MHC/抗原肽補體運鐵蛋白TCRCD35CD28B7-2CD4CD8MHC-II/IIL-2CD71CD58（LAF-3）CD2orFcmRFcgR抗體T細胞表面受體組織胺B細胞表面標志

SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細胞的重要表面標志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標。CD19/CD5分子：可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞。抗原

補體(C3bi)CD23CD28B7-2CD40IL-5FcmRB細胞表面受體IL-2IgMIgECD21IL-4CD32IgG

補體(C3b,C4b)CD40-LNK細胞表面標志

人類NK細胞表面標志主要以CD16、CD56來認定，臨床上將CD3-CD56+CD16+淋巴細胞認定為NK細胞。抗原提呈類細胞表面標志一、T細胞數(shù)量檢測間接熒光免疫法酶免疫組織化學(xué)法微量細胞毒試驗花環(huán)試驗MHC分子四聚體法酶免疫組織化學(xué)法目前常用于鑒定T細胞和亞群的酶免疫組織化學(xué)法有ABC法和APAAP法。微量細胞毒試驗

針對淋巴細胞CD分子的單克隆抗體與淋巴細胞相應(yīng)的CD分子結(jié)合，借助補體依賴的細胞毒作用，可造成表達特定表面抗原的細胞損傷，破壞膜的完整性，應(yīng)用伊紅染料滲入細胞內(nèi)，使之著染紅色，而無相應(yīng)CD分子的細胞則不受損傷，因而不著色。在高倍鏡下計數(shù)死亡數(shù)，即可判斷待檢細胞是否具有相應(yīng)的CD分子，從而確定T細胞及其亞群。補體依賴的細胞毒試驗（CDC）染料補體花環(huán)試驗

E花環(huán)試驗葡萄球菌花環(huán)法花環(huán)技術(shù)抗體致敏細胞花環(huán)法E花環(huán)試驗T細胞表面有特異性綿羊紅細胞(SRBC)受體，即E受體。將T細胞與SRBC按一定比例混勻，置4℃至少2h或過夜，T細胞表面的E受體能與SRBC結(jié)合形成以T細胞為中心，四周環(huán)繞SRBC的花環(huán)樣結(jié)構(gòu)（圖24-5），鏡檢計數(shù)可得總花環(huán)(Et)形成率，亦即T細胞的百分率。部分T淋巴細胞對SRBC具有高親和力，于室溫低速短時離心后即形成花環(huán)，稱為活性E(Ea)花環(huán)，它可能代表T細胞的一個亞群，Ea花環(huán)正常值僅為Et花環(huán)的1/3～1/2，約20%～40%。檢測Ea花環(huán)形成細胞比Et花環(huán)形成細胞更能反映受檢者的細胞免疫水平。抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)T二、B細胞數(shù)量檢測B細胞表面有：膜表面免疫球蛋白(SmIg)、CD抗原、Fc受體、補體受體、EB病毒受體和小鼠紅細胞受體等標志，據(jù)此可對B細胞進行數(shù)量檢測。1．SmIg的檢測SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞的可靠指標。大多采用熒光素或酶標記的抗人Ig抗體通過直接熒光免疫法或酶免疫組織化