年產(chǎn)3萬噸紅曲色素生產(chǎn)工藝設(shè)計

年產(chǎn)3萬噸紅曲色素生產(chǎn)工藝設(shè)計摘要：紅曲色素是一種優(yōu)良的色素，是紅曲在菌體生長代謝過程中產(chǎn)生的天然色素，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料和化裝品等領(lǐng)域。本設(shè)計以從土壤中篩選的紅曲霉為出發(fā)菌株，通過紫外線超聲波復(fù)合誘變選育出紅曲色素高產(chǎn)菌株，通過搖瓶篩選和穩(wěn)定性試驗，得到穩(wěn)定性高產(chǎn)紅曲色素的突變菌株。在此根底上，嘗試了三級發(fā)酵的發(fā)酵方式，優(yōu)化了培養(yǎng)基，確定了發(fā)酵工藝條件：接種菌齡20h、接種量5%、初始pH5.0、培養(yǎng)最適溫度32℃及發(fā)酵時間96h，并選擇了適宜下游提取工藝。設(shè)計的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定、簡便，發(fā)酵后所得的紅曲色素產(chǎn)量到達300g/L。關(guān)鍵詞：紅曲霉，紅曲色素，發(fā)酵，誘變Abstract：Monascuspigmentisagoodnaturalpigment,whichMonascuspigmentinthecellgrowthinthemetabolismprocessproduces,hashighnutritionalvalueandmedicinalvalue,isnowwidelyusedinthefieldsofmedicine,food,feedandcosmeticsetcThedesignofthescreeningfromthesoilofMonascusasstartingstrain,throughultravioletultrasoniccompoundmutationbreedingofthemonascuspigmentproducingstrains,throughshakeflaskscreeningandstabilitytest,thestabilityofmutantstrainsobtainedhighyieldofMonascuspigment.Onthisbasis,trythefermentationlevelthreefermentation,optimizationoftheculturemedium,fermentationconditionsweredetermined:inoculatingage20h,5%inoculationquantity,initialpH5.0,cultureoptimumtemperatureis32℃andthefermentationtimewas96h,andselecttheappropriatedownstreamextractionprocess.Designofproductionprocessstability,simple,afterfermentationofMonascuspigmentyieldincomereached300g/L.Keywords:Monascus,Monascuspigment,fermentation,mutation目錄TOC\o"1-3"\h\u307051引言15691.1概述 1279561.2發(fā)酵方式 1115191.3紅曲色素合成機理 1207011.4國內(nèi)外研究現(xiàn)狀2192521.4.1國內(nèi)研究現(xiàn)狀2151831.4.2國外研究現(xiàn)狀3232401.5本課題的意義4177712紅曲霉菌種的選育584582.1紅曲色素生產(chǎn)菌 5174432.2菌種描述5188142.3色價分析方法596372.4誘變選育 525462復(fù)合誘變5118772.4.2搖瓶篩選638132.4.3穩(wěn)定性試驗6323012.5菌種保藏 6163643培養(yǎng)基7179413.1紅曲霉的培養(yǎng)基 789223.2培養(yǎng)基的設(shè)計 726843.2.1碳源7139993.2.2氮源7127973.2.3無機鹽及微量元素812314滅菌 9124994.1儀器滅菌 9100614.2培養(yǎng)基滅菌 9236814.2.1分批滅菌1067634.2.2連續(xù)滅菌1045554.3空氣除菌 10315584.4發(fā)酵罐滅菌 10264165種子擴大培養(yǎng)和裝料發(fā)酵 11144785.1斜面培養(yǎng) 11259685.2一級種子培養(yǎng) 11318975.3二級種子培養(yǎng) 1169415.4裝料發(fā)酵 1269826發(fā)酵控制 13124426.1pH值的控制 13297926.3溶氧的控制 1336436.4補料工藝的控制 13327266.4.1磷酸與氨水14249446.4.2葡萄糖與蛋白胨14321457下游加工 16311887.1下游加工工藝的一般流程 1663457.2發(fā)酵液的預(yù)處理與固液別離 16121917.3提取 16172037.31胞外色素1698887.3.2胞內(nèi)色素16282957.4成品加工與包裝 1667138物料衡算 18161618.1發(fā)酵罐數(shù)量衡算 184868.2發(fā)酵液組成衡算 19268318.3發(fā)酵罐工藝設(shè)計 1970029結(jié)果與討論 2124582致謝251引言1.1概述紅曲色素，是以大米、大豆為主要原料，經(jīng)紅曲霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)、提取、濃縮、精制而成及以紅曲米為原料，經(jīng)萃取、濃縮、精制而成的天然紅色色素。作為天然色素，紅曲色素一直以來被認為是平安性較高的食用色素，試驗已證明不含黃曲霉毒素。動物性試驗說明，使用紅曲色素及其制品的食物均未發(fā)現(xiàn)急、慢性中毒現(xiàn)象，也無致突變作用。此外，還具有降低血脂、血壓，抗突變，防腐、保鮮等生理活性，因此紅曲色素具有“天然、營養(yǎng)、多功能〞的多重優(yōu)點[1]?！侗静菥V目》中記載，紅曲消食活血，健脾燥胃，治赤白痢，下水谷，治打撲傷損，治女人血氣痛及產(chǎn)后惡血不盡。近年來，隨著國內(nèi)外學者對紅曲色素研究的深入，其應(yīng)用范圍也在不斷擴大。1.2發(fā)酵方式目前紅曲生產(chǎn)主要有兩種工藝，一種是我國的傳統(tǒng)工藝，即固體發(fā)酵工藝，固態(tài)發(fā)酵是指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水下溶性固態(tài)基質(zhì)中，用一種或多種微生物的一個生物反響過程。從生物反響過程中的本質(zhì)考慮，固態(tài)發(fā)酵是以氣相為連續(xù)相的生物反響過程。固體發(fā)酵具有操作簡便、能耗低、發(fā)酵過程容易控制、對無菌要求相對較低、不易發(fā)生大面積的污染等優(yōu)點。其生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生條件差，種子純度低，生產(chǎn)周期長，機械化程度低，產(chǎn)品色階低，產(chǎn)品次品率高，出口率低。無法滿足功能性紅曲全程無菌的工藝條件[2]。另一種是液體深層發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素，是指在生化反響器中，模仿自然界將食藥用菌在生育過程中所必需的糖類、有機和無機含有氮素的化合物、無機鹽等一些微量元素以及其它營養(yǎng)物質(zhì)溶解在水中作為培養(yǎng)基，滅菌后接入菌種，通入無菌空氣并加以攪拌，提供食用菌菌體呼吸代謝所需要的氧氣，并控制適宜的外界條件，進行菌絲大量培養(yǎng)繁殖的過程。工業(yè)化大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)即為發(fā)酵生產(chǎn)，亦稱深層培養(yǎng)或漂浮培養(yǎng)[25]。此工藝自動化程度高，污染小，色素粉色價高，但設(shè)備投資大，生產(chǎn)本錢高，且規(guī)模小，另外該工藝只能生產(chǎn)紅曲紅色素。1.3紅曲色素合成機理紅曲色素一直是國內(nèi)外學者研究的焦點，但是其合成機理尚未研究清楚。不同氨基酸和短鏈脂肪酸等對色素合成的影響，結(jié)果說明纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸以及乙酸、丙酸等具有前體的作用，能夠刺激色素的生產(chǎn)，而且它們都具有轉(zhuǎn)化為聚酮合成前體的共同特征。所以聚酮途徑被認為是紅曲色素合成的主要途徑。趙樹欣等[4]考察了紅曲霉的代謝途徑，認為其代謝包括初級代謝和次級代謝。初級代謝主要產(chǎn)生不飽和脂肪酸、醇、酯等芳香化合物，次級代謝的產(chǎn)物主要有紅曲色素、MonacolinK、降血脂藥物-氨基丁酸、桔霉素(Citrinin)、天然抗氧化劑黃酮酚等。次級代謝產(chǎn)物紅曲色素的生物合成為1分子乙酰CoA和3分子丙二酰CoA在聚酮體合成酶(PolyketidesynthesesPKSs)的作用下生成四酮化合物，四酮化合物再與1分子丙二酰CoA生成五酮化合物，如此循環(huán)，使酮級化合物碳鏈加長，最后生成紅曲色素。1.4國內(nèi)外研究現(xiàn)狀國內(nèi)研究現(xiàn)狀紅曲色素是紅曲菌代謝過程中產(chǎn)生的一系列聚酮化合物的混合物,組成較復(fù)雜。使用不同的紅曲菌株、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件所產(chǎn)生的紅曲色素組成有較大差異,因而其生成途徑也有不同。長期以來，我國及東南亞一些國家和地區(qū)多采用傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵法，且較多的停留在手工作坊形式。該方法生產(chǎn)紅曲色素能耗低、設(shè)備要求簡單、本錢較低、廢水廢渣少、不易造成二次污染，但是操作繁瑣，勞動強度大，生產(chǎn)周期長且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性不高，不適宜大規(guī)模機械化生產(chǎn)。20世紀80年代我國朱文錦等[9]研究報道了厚層機械通風制曲工藝以改進傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)，該工藝是在純種制曲工藝根底上，采用以池代窯，改人工翻曲為機械通風、自動控溫的方法,使紅曲的生產(chǎn)到達機械化、純種化，生產(chǎn)周期從原來的7d縮短到5d。近年來，我國還創(chuàng)新性地采用了適合大型紅曲廠的圓盤固體發(fā)酵法，采用圓盤固體發(fā)酵制曲設(shè)備與種子罐、蒸飯機、枯燥機配套，提高了其機械化、自動化水平，實現(xiàn)了固態(tài)法生產(chǎn)紅曲的機械化。黃前美等[10]用紅曲霉3532菌種，以價格低廉的馬鈴薯、造紙工業(yè)廢棄物甘蔗渣和生產(chǎn)特級面粉的副產(chǎn)物普副粉為原料，添加適量的無機氮源以代替大米,進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素,色素產(chǎn)量可提高10%。劉璽等[11]以小米為原料,研究了液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的發(fā)酵培養(yǎng)基組配及相關(guān)工藝參數(shù)的選擇,結(jié)果顯示以小米為原料，經(jīng)制醪后液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)比固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)率高、耗能低,產(chǎn)品使用方便。目前，我國紅曲色素發(fā)酵的生產(chǎn)設(shè)備，色素的后期提取工藝水平及精煉工藝還比擬落后。菌種產(chǎn)色水平較低、色素生產(chǎn)本錢較高是紅曲色素目前還不能在食品中廣泛使用的主要原因之一。通過菌種誘變選育提高生產(chǎn)菌株的發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)本錢，對我國色素產(chǎn)業(yè)的提升有著重要的意義。紅曲霉為出發(fā)菌株，通過紫外線、酸及高溫處理，并采用定向篩選，從大量菌株中篩選出一株高色價、高穩(wěn)定性菌株，其色調(diào)紫紅，色價水平明顯優(yōu)于原生產(chǎn)菌株。印紅等[14]在空間飛行對紅曲霉菌產(chǎn)量的影響上做了嘗試，利用神舟三號返回艙搭載紅曲霉菌，獲得了高產(chǎn)Monacolin的菌株。該實驗選用一種效果好、設(shè)備簡單又對人體無傷害的紫外誘變對紅曲紅色素生產(chǎn)菌株CICC5017進行紫外誘變以獲得紅曲紅色素高產(chǎn)菌株，再以廉價的玉米為原料通過固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵篩選及傳代穩(wěn)定性實驗，來獲得紅曲紅色素產(chǎn)量高、生長速度快、遺傳性狀穩(wěn)定、培養(yǎng)要求低、工藝簡單的優(yōu)良菌株，以供工業(yè)化生產(chǎn)所需[29]。1.4.2國外研究現(xiàn)狀有關(guān)紅曲色素的現(xiàn)代研究日本起步較早，從1890年便開始對其進行別離研究，20世紀30年代紅曲色素傳到了歐美，之后各國相繼開始了對紅曲菌的分類鑒定、紅曲色素發(fā)酵提取工藝及生產(chǎn)應(yīng)用等方面的研究，對其組分別離、結(jié)構(gòu)鑒定及代謝機制等方面也開展了一些工作，但研究進展緩慢。近10多年來,隨著微生物學的開展，中外的專家學者對紅曲色素進行了大量廣泛而深入的研究，在紅曲色素別離、結(jié)構(gòu)鑒定及改性、生成機制、菌種改進、液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化、代謝產(chǎn)物基因調(diào)控、功能性及平安性等理論和應(yīng)用方面的研究都卓有成效，不斷拓展著紅曲色素的應(yīng)用領(lǐng)域[17]。20世紀90年代以來國內(nèi)外在紅曲色素的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方面做了大量工作，研究已取得突破性進展。液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲色素,主要成分是水溶性的“復(fù)合色素〞。采用這種生產(chǎn)方式具有周期短、產(chǎn)量高、雜質(zhì)少、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，有助于實現(xiàn)生產(chǎn)自動化，提高產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性,擴大生產(chǎn)規(guī)模。液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)的紅曲色素色價偏低，這是制約其工業(yè)化生產(chǎn)的重要原因之一，為此，國內(nèi)外廣泛開展了液態(tài)發(fā)酵菌種改進和工藝條件優(yōu)化的研究。目前，提高紅曲色素色價的途徑主要有:提高紅曲菌的生物量、添加促進色素形成的物質(zhì)等，具體措施有：菌種誘變、固定化細胞技術(shù)、葡萄糖流加培養(yǎng)、菌種聯(lián)合培養(yǎng)、添加抗氧化劑和金屬離子、添加植物油、青霉素以及使用超聲波處理等。另外，紅曲色素發(fā)酵生產(chǎn)中使用的原料多以大米或飴糖、葡萄糖、淀粉、大豆蛋白粉等為主，導(dǎo)致糧食消耗量大或生產(chǎn)的綜合本錢較高，目前國內(nèi)外已開發(fā)利用馬鈴薯、玉米、小米等為主要原料進行生產(chǎn)的研究[18]。Silvana等[19]以葡萄皮籽為原料，研究確定了液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的工藝條件。由此可見，以農(nóng)業(yè)工業(yè)廢棄物為原料生產(chǎn)紅曲色素有很大的潛力，這將是紅曲色素生產(chǎn)的開展方向之一。1.5本課題的意義紅曲色素是紅曲在菌體生長代謝過程中產(chǎn)生的天然色素，與其它天然色素相比，具有熱穩(wěn)定性好，蛋白著色力強，色調(diào)柔和，對酸堿穩(wěn)定，還可以提高加工制品對光和氧穩(wěn)定等優(yōu)點。而且紅曲色素無毒性、無致突變作用，平安性很高。另外，研究發(fā)現(xiàn)紅曲色素是多種色素成分的混合物，從紅色紅曲霉產(chǎn)生的色素中還可別離提純出兩種新的紅曲色素。因此紅曲可提供性能穩(wěn)定、平安性高、品種多樣的天然色素。紅曲色素符合食品著色劑“天然、營養(yǎng)、多功能〞的開展方向，具有很好的應(yīng)用前景。2紅曲霉菌種的選育2.1紅曲色素生產(chǎn)菌本設(shè)計以從土壤中篩選得到的紅曲霉菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和超聲波復(fù)合誘變，篩選得到了得到高產(chǎn)紅曲色素的菌株。2.2菌種描述紅曲霉在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落初為白色，老熟后變成淡粉色、紫色或灰黑色。紅曲霉菌絲體的大量分枝的頂端產(chǎn)生單個或成串的分生孢子，孢子呈球形或橢圓形，閉囊殼橙紅色，近球形，含有多數(shù)子囊，子囊內(nèi)含8個孢子，子囊孢子卵形或近球形，光滑，透明，無色或漆紅色。紅曲霉能在15~45℃生長，最適生長溫度為32~35℃，最適生長pH為5.0~6.0，有良好的耐酸和耐乙醇能力。能利用淀粉、糊精、麥芽糖、蜜二糖、纖維二糖、葡萄糖、甘油、乙醇、乳酸、蘋果酸、檸檬酸等多種糖類和酸類作為碳源，能利用硝基氮、氨基氮和有機氮。紅曲霉能自身合成生物素、硫胺素、核黃素、麥角固醇等多種維生素。紅曲霉可代謝生成多種酶類，有葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。2.3色價分析方法液態(tài)發(fā)酵樣品用濾紙過濾得濾液和濾渣，濾液經(jīng)適當稀釋后用721型分光光度計于510nm處測定OD值，濾渣用蒸餾水洗滌3次后于60℃烘干稱重測得生物量，然后稱取1g干菌絲用75%的乙醇浸提2次，每次2h，過濾，合并后的濾液適當稀釋后用721型分光光度計于510nm處測定OD值。色價=稀釋倍數(shù)×OD值。2.4誘變選育選育過程：復(fù)合誘變流程：出發(fā)菌株→超聲波誘變→平板別離→紫外誘變→平板別離→穩(wěn)定性試驗→比照試驗孢子懸浮液的制備：菌株在33℃斜面培養(yǎng)4d后，用無菌生理鹽水洗下紅曲霉孢子，倒入已滅菌的裝有20~30顆玻璃珠的三角瓶中，放入搖床中220r/min振蕩1h，孢子分散均勻即可。用4層無菌鏡頭紙過濾除去菌絲，制成孢子懸浮液，濃度稀釋至l06個/mL，以備用。復(fù)合誘變〔1〕超聲波誘變：將9支裝有菌懸液的試管放入超聲波清洗儀的工作箱內(nèi)，調(diào)整超聲波功率為500w，分別作用5min~45min后，取出試管即刻放到冰水中冷卻，防止超聲波產(chǎn)熱殺死孢子。將所得孢子懸液稀釋l06倍涂布，32℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后觀測、計數(shù)，對誘變后的菌株進行篩選?！?〕紫外誘變：將經(jīng)超聲波誘變篩選好的菌株進行孢子懸浮液的配制，取濃度為1.0×106個/mL紅曲霉孢子懸浮液5mL，參加直徑90mm的無菌培養(yǎng)皿中，先預(yù)熱紫外燈30min，然后開啟平皿蓋于磁力攪拌下分別處理1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min〔15W，30cm〕，然后稀釋至l0-5倍，分別吸取3個稀釋度的孢子懸浮液各0.2mL涂布平板，培養(yǎng)3d~4d后，計算致死率〔紫外誘變致死的孢子數(shù)與未經(jīng)誘變總孢子數(shù)的比值〕和正突變率〔菌落直徑與擴散圈直徑比值比未經(jīng)誘變的菌落直徑與擴散圈直徑比值小的為正突變的菌落，正突變的菌株與總菌株個數(shù)的比值稱正突變〕。以致死率70%~80%、正突變率最高為最適突變劑量，以最正確劑量處理孢子懸浮液，涂布平板，挑去單菌落進行搖瓶篩選[23]。2.4.2搖瓶篩選〔1〕小瓶發(fā)酵初篩：斜面培養(yǎng)5d~7d，待孢子成熟，接種于裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，220r/min、32℃培養(yǎng)96h。重復(fù)接種3瓶。根據(jù)生物量高的5~8株用于復(fù)篩和菌種保藏?！?〕大瓶復(fù)發(fā)酵復(fù)篩：用初篩出的5~8株菌的成熟斜面孢子接種于裝有80mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，220r/min，32℃培養(yǎng)48h，得種子液。取種子液8mL~10mL接種于裝有80mL~100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，220r/min、32℃培養(yǎng)96h。根據(jù)提取紅曲色素產(chǎn)量高篩選出1~2株用于下一輪誘變處理[22]。2.4.3穩(wěn)定性試驗將誘變后的菌株傳代10次，每代都進行搖瓶發(fā)酵試驗，產(chǎn)量穩(wěn)定的那么其性能可能穩(wěn)定。2.5菌種保藏其原理是根據(jù)菌種的生理生化特點，人工創(chuàng)造條件，使孢子和菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。菌種保藏的方法有：斜面冰箱保藏法、砂土管保藏法、菌絲速凍法、石蠟油封存法、真空冷凍枯燥保藏法、液氮超低溫保藏法。對于紅曲霉采用斜面冰箱保藏法。3培養(yǎng)基3.1紅曲霉的培養(yǎng)基A：斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉3%，葡萄糖6%，蛋白胨2%，瓊脂3%，自來水，乳酸調(diào)節(jié)pH值至5.0，121℃高壓滅菌30min。B：種子培養(yǎng)基：早秈稻米粉3%，NaNO30.5%，KH2P040.15%，MgS040.1%，自來水，乳酸調(diào)節(jié)pH值至5.0~6.0，121℃高壓滅菌30min。C：根本發(fā)酵培養(yǎng)基：大米粉9%，葡萄糖7%，蛋白胨2%，NaNO30.2%，KH2P040.1%，MgS040.2%，pH5.0~6.0，121℃高壓滅菌30min。D：補料培養(yǎng)基：補料1：25%~28%氨水，使pH保持在設(shè)定范圍內(nèi)。補料2：80%磷酸，使pH保持在設(shè)定范圍內(nèi)。補料3：葡萄糖20%，蛋白胨2%，NaNO30.2%，KH2P040.1%，MgS040.2%，pH5.0~6.0。3.2培養(yǎng)基的設(shè)計碳源碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基中最重要的組分之一，是微生物代謝的能量來源。葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源時，最終所得的紅曲色素色階高于蔗糖、麥芽糖和大米粉為碳源下的。但是因為大米粉市場價格明顯低于葡萄糖價格，兩者差距不大，因此，宜選用大米粉作為紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。在紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的發(fā)酵過程中，由于碳源的補加促進了菌體的生長，從而促進了紅曲色素色階的提高。值得注意的是，盡管補加蔗糖所得的菌體量顯著高于補加葡萄糖方案條件下的菌體量，但是其紅曲色素色階卻顯著低于補加葡萄糖的方案。雖然補加麥芽糖得到的紅曲色素色階高于補加葡萄糖的方案，但是二者之問無差異顯著性。綜合原料本錢，宜選用葡萄糖作為紅曲霉最正確的補加碳源。氮源氮源是構(gòu)成細胞中所含蛋白質(zhì)、核酸、酶等成分，以及代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)，所有紅曲霉在生長時均可利用無機氮源。工業(yè)生產(chǎn)中通常使用的氮源有氨、銨鹽和尿素。當培養(yǎng)基中碳源缺乏時，可作為補充碳源。常用的氮源有有機氮源和無機氮源兩大類。黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、魚粉、菌絲體和酒糟等都是有機氮源。無機氮源有氨水、硫酸銨、氯化銨、硝酸鹽等。氮是構(gòu)成微生物細胞蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，因此是菌體生長以及代謝產(chǎn)物形成所必需的。為探索出紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中的最正確氮源，選用蛋白胨作為氮源，其對應(yīng)的紅曲色素色階顯著高于其它氮源下所得的紅曲色素色階。但蛋白胨市場價格高于硝酸鈉等氮源物質(zhì)，用硝酸鈉替代后結(jié)果差異不是很大，因此選用硝酸鈉作為紅曲霉發(fā)酵的氮源。無機鹽及微量元素無機鹽類是微生物必不可少的一類物質(zhì)，它們?yōu)槲⑸锏恼４x提供多種重要的生理功能。硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸錳等無機鹽類對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的測定結(jié)果，當發(fā)酵培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀，硫酸鎂時所得的紅曲色素色階顯著高于不添加任何無機鹽類的試驗方案。因此，磷酸二氫鉀，硫酸鎂對紅曲色素的合成具有顯著的促進作用。4滅菌所謂滅菌，是指用物理或化學方法殺滅或去除物料或設(shè)備中一切有生命物質(zhì)的過程。應(yīng)用的范圍有：〔1〕培養(yǎng)基滅菌；〔2〕氣體滅菌；〔3〕設(shè)備及管道滅菌等。常用的滅菌方法有以下幾種：a、化學滅菌；b、射線滅菌；c、干熱滅菌；d、濕熱滅菌；e、過濾滅菌。化學滅菌：由于化學藥劑會與培養(yǎng)基中的一些成分作用，而且參加培養(yǎng)基后不易去除，所以化學滅菌不用于培養(yǎng)基的滅菌。但染菌后的培養(yǎng)基可以用化學藥劑處理。射線滅菌：紫外線的穿透力低，所以僅用于外表消毒和空氣的消毒。濕熱滅菌：滅菌原理是直接用蒸汽滅菌，蒸汽在冷凝時能釋放出大量潛熱，蒸汽具有強大的穿透力，破壞菌體蛋白和核酸的化學鍵，使酶失活，微生物因代謝障礙而死亡。水煮常壓滅菌：100℃。或飽和蒸汽滅菌：一般121℃，30分鐘。適合培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌。干熱滅菌：滅菌原理是利用高溫對微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物。常用灼燒和電熱箱加熱，140~180℃、1~2小時。適于對玻璃及金屬用具及沙土管滅菌。過濾除菌：除菌原理是利用微生物不能透過濾膜除菌。方法是使用0.01~0.45mm孔徑濾膜，用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。4.1儀器滅菌在發(fā)酵操作過程中，種子活化、擴大培養(yǎng)需要接種環(huán)、搖瓶、試管等儀器。接種環(huán)應(yīng)用火焰灼燒法滅菌；搖瓶、試管應(yīng)用蒸煮法滅菌。經(jīng)過滅菌的儀器不要暴露于空氣中或于其它的未知儀器接觸，并及時使用，以免再次帶菌。4.2培養(yǎng)基滅菌對于培養(yǎng)基滅菌大多采用濕熱滅菌，即利用飽和水蒸氣有很強的穿透力，而且在冷凝時放出大量冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺滅各種微生物。同時蒸汽的價格低廉，來源方便，滅菌效果可靠，所以培養(yǎng)基滅菌，發(fā)酵設(shè)備及管道的滅菌，試驗用材料的滅菌，普遍采用這種滅菌方法。通常的蒸汽滅菌條件是在121℃〔表壓約0.1MPa〕維持30min。分批滅菌是將先配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起滅菌的操作過程〔適用于小型發(fā)酵罐〕。連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌也叫連消，就是將將配制好的并經(jīng)預(yù)熱的培養(yǎng)基用泵連續(xù)輸入由直接蒸汽加熱的加熱塔，使其在短時間內(nèi)到達滅菌溫度〔126~132℃〕。然后進入維持罐〔或維持管〕，使在滅菌溫度下維持5~7分鐘后再進入冷卻管，使其冷卻至接種溫度并直接進入已事先滅菌〔空罐滅菌〕過的發(fā)酵罐內(nèi)。其過程均包括加熱、維持和冷卻等滅菌操作過程。連續(xù)滅菌的連續(xù)性強，快速滅菌消毒，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞少，適用于大容積發(fā)酵罐物料的連續(xù)滅菌消毒。加熱時間短，提高了熱的利用率；操作條件恒定，滅菌質(zhì)量穩(wěn)定；易于實現(xiàn)管道化和自控操作；發(fā)酵設(shè)備利用率高。由此可見，無論在理論上或者在實踐上，連續(xù)滅菌的優(yōu)點十清楚顯，因此本設(shè)計采用培養(yǎng)基連續(xù)滅菌。4.3空氣除菌大多數(shù)生物培養(yǎng)基都需要氧氣，通常以空氣作為氧源。根據(jù)國家藥品質(zhì)量管理標準的要求，生物制品、藥品的生產(chǎn)場地業(yè)需要符合空氣潔凈度的要求[8]。過濾是空氣除菌的主要手段，按過濾介質(zhì)孔隙將空氣過濾器分為兩類：絕對過濾，相對過濾。后者主要原理為：〔1〕慣性滯留作用〔2〕攔截滯留作用〔3〕布朗擴散作用〔4〕重力沉降〔5〕靜電作用。本設(shè)計發(fā)酵需要的空氣無菌程度高，因此采用高效前置過濾空氣除菌。高效前置過濾除菌是利用壓縮機的抽吸作用，使空氣先經(jīng)中、高效過濾后，再進入空氣壓縮機，這樣就降低了主過濾器的負荷。特點是采用了高效率的前置過濾設(shè)備，使空氣經(jīng)過屢次過濾，因而所得的空氣無菌程度比擬高。4.4發(fā)酵罐滅菌空罐滅菌方法：通入蒸氣，使罐內(nèi)蒸氣壓力達0.147MPa，維持45min。滅菌過程從閥門，邊閥排除空氣，并使蒸氣通過到達死角滅菌。滅菌完畢，關(guān)閉蒸氣后，待管內(nèi)壓力低于空氣過濾器時，通入無菌空氣保壓0.098MPa。5種子擴大培養(yǎng)和裝料發(fā)酵根據(jù)菌種生長特性，為得到純而壯的培養(yǎng)物，即獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物，故采用三級級發(fā)酵。5.1斜面培養(yǎng)菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種的生長而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機氮而不含或少含糖為原那么。5.2一級種子培養(yǎng)一級種子罐制備，是指將來自三角瓶瓶培養(yǎng)的菌體，翻開接種口在火焰保護下接種到3臺100L的種子罐中培養(yǎng)，接種量為種子罐內(nèi)的培養(yǎng)基量的10%，培養(yǎng)12h。其目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分、多含有機氮為主，有利于長菌。一級種子質(zhì)量要求：種齡：12hpH值：5±0.1光密度：OD凈增值0.5以上殘?zhí)牵?.5%以下無菌檢查：(-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊5.3二級種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級種子培養(yǎng)的根底上進而擴大到種子罐的二級種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。經(jīng)質(zhì)檢合格可移種至發(fā)酵罐(或冷卻至10℃?zhèn)溆?。二級種子的質(zhì)量要求種齡：7~8hpH：5.0左右光密度：OD凈增值0.5左右殘?zhí)牵?.5%左右無菌檢查(-)噬菌體檢查(-)5.4裝料發(fā)酵首先將已通過連續(xù)滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基泵入已空罐滅菌的發(fā)酵罐中，裝料系數(shù)為75%，當發(fā)酵罐中溫度降至37℃左右時，再將二級種子罐中的種子液用空氣壓差法接種以5%的接種量接入到此發(fā)酵罐中，將通氣量調(diào)至1:1vvm，罐壓保持在0.04~0.06MPa進行發(fā)酵。6發(fā)酵控制6.1pH值的控制紅曲霉的最適生長pH為5.0~6.0，初步確定紅曲霉生長階段pH控制在5.0。補料與補料完畢后控制在8.0，在此pH下，紅曲霉的后期代謝產(chǎn)物會開始大量合成，使紅曲色素能夠更好的積累。6.2溫度的控制紅曲霉發(fā)酵是一個產(chǎn)熱過程，在對數(shù)生長階段會產(chǎn)生大量的熱，使溫度上升；而在菌體生長的后期，由于菌體代謝活力的下降，溫度反而會下降。由于紅曲紅曲霉酶活性對溫度的變化極為敏感，太高或太低都會影響其合成紅曲色素的能力，紅曲霉發(fā)酵一般溫度控制在30℃左右，在搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果的根底上，本工藝采用28℃~30℃的發(fā)酵溫度，該發(fā)酵罐可以自動控制溫度在設(shè)定值。6.3溶氧的控制根據(jù)參考資料[25]，發(fā)酵過程中溶氧值不能低于20%，在發(fā)酵初期，通過增加轉(zhuǎn)速和提高通氣量可以讓溶氧維持在這一水平以上，而在后期單靠提高轉(zhuǎn)速和通氣量已經(jīng)不能滿足溶氧的需求時，可以通過聯(lián)合控制補料速度的方法來提高溶氧。但是通過實驗發(fā)現(xiàn)，如果提供太好的溶氧條件，菌體生長過于旺盛，菌體老化嚴重，甚至局部死亡的現(xiàn)象，不利于產(chǎn)物的積累。降低流加碳源的速度，會降低菌體的比生長速度，溶氧會隨之提高，即溶氧值與碳源流加速度呈反相關(guān)。因此該發(fā)酵工藝對溶氧的控制方案為：在開始培養(yǎng)階段，通過提高轉(zhuǎn)速和通氣控制溶氧；在后期培養(yǎng)補料階段，在保持穩(wěn)定的通氣和攪拌的條件下，通過控制補料的速度來控制溶氧。6.4補料工藝的控制補料一般是在發(fā)酵進行至大量生成產(chǎn)物的階段，因合成產(chǎn)物和維持細胞活動的需要,有選擇地補充營養(yǎng)物質(zhì)。適宜的補料工藝能夠有效地控制微生物的中間代謝,使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向開展。補料發(fā)酵補加的營養(yǎng)物質(zhì)大致有五類：(1)補充菌體所需的能源和碳源，如葡萄糖和液化淀粉等；(2)補充菌體所需氮源,如蛋白胨、豆餅粉、玉米漿、酵母粉和尿素等有機氮源，有些發(fā)酵還采取通入氨氣或添加氨水等；(3)參加某些菌體生長代謝所需的微量元素和無機鹽，如磷酸鹽、硫酸鹽等；(4)對于產(chǎn)誘導(dǎo)酶的微生物，常在補料中適當參加該酶的作用底物,以提高酶的產(chǎn)量；(5)對一些抗生素發(fā)酵，往往需要補充抗生素形成的前體。本設(shè)計補充菌體所需能源為葡萄糖，有機氮源為蛋白胨，無機氮源為NaNO3和氨水，無機鹽和微量元素為KH2P04、MgS04等。磷酸與氨水pH調(diào)控是通過補加磷酸和氨水來實現(xiàn)的，在發(fā)酵過程中，不同的階段設(shè)定好不同的pH值，發(fā)酵罐自動控制補加磷酸和氨水的速度，使pH維持在某一恒定值，同時提供補充了發(fā)酵過程中所需的磷源和氮源。6.4.2葡萄糖與蛋白胨葡萄糖補加濃度對菌體生長及紅曲色素合成的影響，葡萄糖不同濃度方案下最終所得的紅曲色素色階分別為(94.2±1.4)U/mL、(162.9±2.5)U/mL、(295.1±2.7)U/mL和(200.6±3.5)U/mL。在搖瓶發(fā)酵過程中，隨著葡萄糖補加濃度逐漸增加至20%發(fā)酵液，所得到的紅曲色素色階也呈上升之勢。但是隨著葡萄糖補加濃度進一步增大，最終紅曲色素色階呈現(xiàn)下降趨勢。這說明，在紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的過程中，過高濃度葡萄糖的補加就可能會對紅曲色素的合成產(chǎn)生阻遏或抑制效應(yīng)。氮源是發(fā)酵培養(yǎng)基中最重要的組分之一，用于菌體的量菌體均顯著高于不補加蛋白胨條件下所得的菌體量，而且隨著蛋白胨補加濃度的增加，菌體生物量也呈現(xiàn)明顯的增加趨勢。這說明補加蛋白胨能顯著地促進紅曲霉的菌體生長。當?shù)鞍纂嗣看窝a加量達2%發(fā)酵液時，最終的紅曲色素色階在所有實驗方案中最高，到達(33.6±8.7)U/mL，顯著高于不補加蛋白胨條件下所得的紅曲色素色階(3l1.0±4.5)U/mL。與菌體量變化趨勢不同的是，蛋白胨補加量為4%~6%發(fā)酵液時，其最終所得的紅曲色素色階反而顯著低于不加蛋白胨的方案。其原因可能是在發(fā)酵過程中蛋白胨能明顯促進紅曲霉的菌體生長，但是會對紅曲色素的合成產(chǎn)生一定的負作用，尤其是補加濃度過高會顯著降低紅曲色素的合成。這說明，為了提高紅曲色素的色階，發(fā)酵過程氮源的補加是一個關(guān)鍵的工藝控制參數(shù)。6.5發(fā)酵時間接種后，菌體生長24h左右，溶氧會出現(xiàn)一個大的上升，說明此時起始培養(yǎng)基中的碳源已根本被消耗完。之后開始添加補料培養(yǎng)基，流速20mL/h。每隔12h取樣測定紅曲色素的含量，當其到達最高時發(fā)酵結(jié)束，下罐。補料階段持續(xù)約50h。補料完畢再繼續(xù)發(fā)酵24h，故整個發(fā)酵周期為96h左右。發(fā)酵罐開始發(fā)酵后，每隔12小時取樣測定生物量(菌體濕重)，發(fā)酵液的OD660以及發(fā)酵液中紅曲色素的含量。當發(fā)酵約90h時，產(chǎn)物紅曲色素含量到達最高的300g/L。再延長發(fā)酵時間，紅曲色素的產(chǎn)量與菌體生物量已經(jīng)根本不在增加，且生物量有一些下降，考慮可能是由于菌體的自溶造成。7下游加工7.1下游加工工藝的一般流程一般產(chǎn)品的別離提取工藝含以下步驟：發(fā)酵液預(yù)處理、固液別離、產(chǎn)品初步提取、產(chǎn)品精制。紅曲色素70%~80%存在于菌體內(nèi)，20~30%分泌到發(fā)酵液中，存在于發(fā)酵液中的色素即胞外色素多為水溶性色素，菌體內(nèi)的色素即胞內(nèi)色素多為醇溶性色素，菌體內(nèi)紅曲色素的提取效果好壞直接關(guān)系到紅曲色素提取效率的上下，目前菌體內(nèi)紅曲色素的提取主要采用傳統(tǒng)乙醇浸提法。7.2發(fā)酵液的預(yù)處理與固液別離發(fā)酵液中的紅曲色素濃度一般在20%左右，為水溶性產(chǎn)物，收集需固液別離，固液別離收率10%~20%；醇溶性紅曲色素為菌體內(nèi)產(chǎn)物，提取要收集菌絲體，然后需要用乙醇進行抽提，乙醇抽提率70%。預(yù)處理收率在89%~93%。7.3提取發(fā)酵罐培養(yǎng)→板框壓濾→浸泡濾渣〔用70%~80%酒精浸泡攪拌約26~38h〕→再次壓濾→真空濃縮〔回收酒精〕→噴霧枯燥〔粉狀紅曲紅〕7.31胞外色素發(fā)酵液中的紅曲色素濃度比擬低，一般為20~30%左右，為紅曲霉菌體外產(chǎn)物，屬于水溶性紅曲色素，發(fā)酵后可將發(fā)酵液進行板框壓濾或離心別離[27]，收集濾液。7.3.2胞內(nèi)色素紅曲霉菌體內(nèi)紅曲色素為醇溶性色素，為保證提取完全，固液別離后的濾渣用70%~80%的乙醇進行屢次提取，乙醇濃度與pH值對提取率有影響，在乙醇濃度較低時，升高pH有利于色素溶出，而乙醇濃度較高時，降低pH有利于色素溶出。為節(jié)約本錢，本設(shè)計采用較低濃度乙醇升高pH來溶出紅曲色素。所得濾液與發(fā)酵液別離后的胞外色素澄清濾液合并，回收酒精后濃縮，再進行噴霧枯燥成粉[28]。7.4成品加工與包裝精制液用(NH2)2SO4調(diào)至pH6.0~6.5，經(jīng)過GLP25離心式噴霧枯燥機〔蒸發(fā)能力25kgH20/h、最高轉(zhuǎn)速25000rpm、高度5m、進風溫度40~100℃〕枯燥得成品。精制液經(jīng)置于塔頂部的高速離心霧化器，霧化成極細微的霧狀液珠，空氣經(jīng)過過濾和加熱，進入枯燥器頂部空氣分配器，熱空氣呈螺旋狀均勻地進入枯燥室。液珠與經(jīng)分布器分布后的熱空氣在枯燥塔內(nèi)混合，迅速進行熱質(zhì)交換，在極短的時間內(nèi)枯燥成為粉狀產(chǎn)品。成品連續(xù)地由枯燥塔底部和旋風別離器中輸出，廢氣由引風機排空，最后得到成品[30]。但需要經(jīng)進一步的包裝才能方便于運輸及保存。其中回收率為74%左右。8物料衡算8.1發(fā)酵罐數(shù)量衡算本設(shè)計是年產(chǎn)3萬噸的紅曲色素的工藝設(shè)計。本設(shè)計中紅曲色素的發(fā)酵周期約為4d(菌體生長24h左右，補料階段持續(xù)約50h，補料完畢再繼續(xù)發(fā)酵24h)。一年的工作日有200d，紅曲色素的發(fā)酵周期為4d，其中空罐滅菌時間為3h，裝料時間為12h，放罐時間為6h。而清理發(fā)酵罐需要1d。除去其他考慮情況，發(fā)酵次數(shù)可以到達33次。每次的生產(chǎn)任務(wù)是909噸紅曲色素。以下采用逆推法計算一個批次發(fā)酵罐的個數(shù)。在噴霧枯燥前，一個批次紅曲色素初精制液的總質(zhì)量為：909÷96%=947t醇溶性紅曲色素所占比例為：947×80%=758t水溶性紅曲色素所占比例：947×20%=189t醇溶性紅曲色素用乙醇抽提前的質(zhì)量：758÷70%=1083t水溶性紅曲色素精致前的質(zhì)量：189÷15%=1260t發(fā)酵液固液別離前的質(zhì)量為:1083+1260=2343t紅曲色素在經(jīng)過板框過濾處理前的總發(fā)酵溶液量為：2343÷90%=2603t預(yù)處理之前的混合液的質(zhì)量為：2603÷90%=2892t放罐前，發(fā)酵液的質(zhì)量為：2892÷85%=3402t也就是一批次發(fā)酵完畢后發(fā)酵液的總量。忽略發(fā)酵液發(fā)酵前后的體積變化，紅曲色素的含量為300g/L[30]，發(fā)酵液的總體積為：3402÷300=11342.05m3又因為發(fā)酵罐的裝料系數(shù)取為0.75故需要的總罐體積為：11342.05÷0.75=15122.73m3本設(shè)計采用的是400m3的發(fā)酵罐，故發(fā)酵罐的個數(shù)為：15122.73÷400=38個8.2發(fā)酵液組成衡算400m3發(fā)酵罐的裝料系數(shù)為0.75，那么該罐的裝料為：400×0.75=300m3因為發(fā)酵培養(yǎng)液的組成(%)為：大米粉9%，豆餅粉2%，NaNO30.2%，KH2P040.1%，MgS040.2%。因此，每個罐的大米粉用量為：3402×1000÷38×9%=8057kg400m3發(fā)酵罐的豆餅粉用量：3042×1000÷38×2%=1791kg400m3發(fā)酵罐的NaNO3用量：3402×1000÷38×0.2%=179kg400m3發(fā)酵罐的KH2P04用量：3402×1000÷38×0.1%=89.53kg400m3發(fā)酵罐的MgS04用量：3402×1000÷38×0.2%=179kg8.3發(fā)酵罐工藝設(shè)計發(fā)酵罐中，高徑比為1.74，取H/D=2.5；攪拌器直徑為1/3直徑；取d/D=1/3；檔板為0.1倍直徑，取d1/D=0.1；下部攪拌器到底部距離為：B/D=1；S/D=2.5；W/D=1/8由公式V=πD2[H+2(hb+D/6)]/4，H=2.5D，hb可忽略，V=400m3，代入得2.225D3=400，得出：D=5.64mH=2.5×5.64=14.1md=5.64/3=1.88md1=0.1×5.64=0.564mW=5.64/8=0.705mB=D=5.64mS=2.5×4.5/3=3.8m其中：H：發(fā)酵罐筒身高D：發(fā)酵罐內(nèi)徑d：攪拌器直徑W：檔板B：下攪拌漿距底部距離S：兩攪拌漿之間的距離本發(fā)酵過程中選用機械攪拌式發(fā)酵罐，發(fā)酵罐的攪拌器一般都采用具有圓盤的渦輪攪拌器，攪拌葉的型式由平葉、彎葉、箭葉三種，通常有六個葉片均勻排列在圓盤上，攪拌葉型的選擇是發(fā)酵罐設(shè)計中的一個關(guān)鍵，我國由于種種原因，普遍采用六彎葉或六箭葉圓盤渦輪式。9結(jié)果與討論〔1〕本設(shè)計利用從土壤中篩選的紅曲霉菌株，經(jīng)過紫外線誘變和超聲波復(fù)合誘變，得到的高產(chǎn)紅曲色素的正向突變菌株?！?〕對培養(yǎng)基進行優(yōu)化。在紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素中，以乳糖最正確，葡萄糖次之，蔗糖最差。由于乳糖的市場價高于葡萄糖，而乳糖發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的能力與葡萄糖相比，差異并不顯著，因此碳源我們最終選擇了7%的葡萄糖；在無機氮源和有機氮源中，NaNO3和蛋白胨累積紅曲色素的產(chǎn)量最高，因此我們分別選擇NaNO3作為無機氮源，蛋白胨為有機氮源進行設(shè)計；由于過高的無機離子濃度抑制了菌體的生長，使菌體不能大量生長繁殖而影響了紅曲色素的合成，因此無機離子濃度不易過高?！?〕對培養(yǎng)條件的優(yōu)化。利用紅曲霉發(fā)酵紅曲色素，pH值對紅曲色素尤其重要，因為它直接影響紅曲色素合成酶的酶促反響。由于初始pH在4.0時其OD660為最高和pH在6.0時紅曲色素累積量到達最高，說明紅曲霉在酸性條件下能更好的生長；發(fā)酵過程中pH的控制是通過發(fā)酵罐自動補加磷酸和氨水來實現(xiàn)的。參考搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果初步確定生長階段pH控制在5.0。補料與補料完畢后控制在8.0，使紅曲色素能夠更好的積累。由于紅曲色素合成酶的活性對溫度的變化較為敏感，太高或太低都會影響其合成紅曲色素的能力，同時過高或過低的溫度對菌體的生長也有明顯的影響，因此在發(fā)酵過程中溫度的控制是非常重要的。由于紅曲霉在溫度為32℃時產(chǎn)紅曲色素的量最高，發(fā)酵溫度低于或高于32℃都對菌體累積紅曲色素有不利影響，故32℃為最正確溫度[16]。本工藝采用32℃左右的發(fā)酵溫度，該發(fā)酵罐可以自動控制溫度在設(shè)定值。紅曲霉發(fā)酵屬于液態(tài)深層好氣性發(fā)酵，培養(yǎng)過程中需要用大量無菌壓縮空氣。而氧在水中的溶存量是微量的，在0.1MPa壓力20℃下，僅能溶解1.38mol/L左右，據(jù)Finn[26]的報道，該值僅能滿足一般濃度的菌體生存15min，因此發(fā)酵過程中，隨著氧被菌體不斷利用，要連續(xù)通入無菌空氣，氧由氣相溶解到液相，然后經(jīng)過液流傳給細胞壁進入細胞體內(nèi)，以維持菌的生長和目的產(chǎn)物的合成。因此利用紅曲霉生產(chǎn)紅曲色素的過程中，必須在好氧的條件下進行。因此該發(fā)酵工藝對溶氧的控制方案為：在開始培養(yǎng)階段，通過提高轉(zhuǎn)速和通氣控制溶氧；在后期培養(yǎng)補料階段，在保持穩(wěn)定的通氣和攪拌的條件下，通過控制補料的速度來控制溶氧?！?〕下游加工工藝的優(yōu)化紅曲色素分為水溶性和醇溶性兩種，發(fā)酵完畢后水溶性紅曲色素為胞外色素，占總發(fā)酵色素的20%左右，菌絲體內(nèi)的為醇溶性色素，水溶性色素需要經(jīng)過板框壓濾和離心收集濾液，醇溶性需要用70%~80%的乙醇進行屢次抽提，提取完畢后將兩種濾液混合，對酒精進行回收，然后進行噴霧枯燥，最后得到枯燥粉末狀的紅曲色素?！?〕物料衡算結(jié)果紅曲色素液體發(fā)酵的發(fā)酵周期為4d，一年的發(fā)酵次數(shù)為33次，年產(chǎn)3萬噸紅曲色素共需要400m3的發(fā)酵罐38個，每個罐的大米粉用量：8057kg；豆餅粉用量：1791kg；NaNO3用量：179kg；MgS04用量：179kg；KH2P04用量：89.53kg。發(fā)酵罐內(nèi)的高徑比為1.74，發(fā)酵罐筒身高為14.1m；攪拌器直徑為1.88m;發(fā)酵罐內(nèi)徑為5.64。本設(shè)計通過一系列誘變選育出高產(chǎn)菌株、優(yōu)化培養(yǎng)基、把握關(guān)鍵控制點、優(yōu)化下游加工過程，使在紅曲色素的效價提高的同時，降低生產(chǎn)本錢。勢必加快紅曲色素在更多領(lǐng)域的應(yīng)用。參考文獻[1]高紅.試論紅曲在我國傳統(tǒng)食品和食療保健中的作用．四川食品與發(fā)酵.1997,(3):6~10[2]雷萍,金宗濂.紅曲中生物活性物質(zhì)的研究進展.食品工業(yè)科技,2004,24(9):86~87[3]葛繼志,張穎.紅曲霉變異株產(chǎn)色素發(fā)酵條件研究.生物學雜志,1999,(5):35~37[4]趙欣樹,沈昌.紅曲色素形成機制及提高其色價的途徑.食品科學,2005,26(7):256~257[5]陳國珍,石鶴,占玉珍等.紅曲霉液體發(fā)酵和紅色素提取的研究.調(diào)味副食品科技.1982,(3):17~19[6]鄭丹.紅曲霉產(chǎn)色素及MonacolinK的固體發(fā)酵工藝研究.西安:陜西科技大學,2006[7]陳義光,彭得嬌,田宏觀.紅曲及紅曲霉的研究應(yīng)用.湖北農(nóng)學院學報,2000,20(2):188~190[8]姚繼承,趙秀舉.紅曲色素產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀.中國食品報,2007,11:6~7[9]朱文錦.紅曲霉產(chǎn)色素及MonacolinK的固體發(fā)酵工藝研究.西安: