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珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)及其在梅毒檢測中的應(yīng)用珠海麗珠試劑有限公司珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory梅毒概況梅毒是由梅毒螺旋體引起的一種慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病。人體受感染后,螺旋體很快播散到全身,幾乎可侵犯全身各組織與器官,臨床表現(xiàn)多種多樣,且時顯時隱,病程較長?中華人民共和國傳染病防治法?規(guī)定要管理的性病是愛滋病、淋病和梅毒,應(yīng)加以重點(diǎn)防治。衛(wèi)生部?性病防治管理辦法?則規(guī)定除上述3種病以外,還有生殖器皰疹、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎(NGU)、性病淋巴肉芽腫均為監(jiān)測性疾病梅毒早期主要侵犯皮膚及粘膜,晚期除侵犯皮膚、粘膜外,還可侵犯心臟血管系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng);另一方面,梅毒又可多年無癥狀呈潛伏狀態(tài)梅毒主要通過性接觸傳染,也可因其它方式密切接觸或輸入患者的血液而傳染。梅毒孕婦可通過胎盤使胎兒在宮內(nèi)受感染或出生時接觸母親有病損的產(chǎn)道受染
珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory梅毒和一些其他性病均與艾滋病密切相關(guān),從社會學(xué)角度來看,凡人群中梅毒發(fā)病率高,意味著人群中性亂現(xiàn)象嚴(yán)重,提供了艾滋病流行的條件;從醫(yī)學(xué)角度來說,患有梅毒的人,因有局部潰瘍,可明顯增加帶有CD4受體信息的目標(biāo)細(xì)胞,故對HIV感染的易感性增加2-10倍。同樣,HIV感染者伴有梅毒,其生殖道排出的HIV的量要比僅有HIV感染者排出的量大得多在HIV感染者中,梅毒血清學(xué)反應(yīng)有時會出現(xiàn)難于解釋的現(xiàn)象,因此對于臨床懷疑梅毒感染而血清學(xué)試驗又表現(xiàn)為陰性者,建議考慮HIV檢查梅毒與HIV感染珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory暗視野顯微鏡檢查法:是目前國內(nèi)主要的梅毒病原學(xué)診斷方法。適用于對一期梅毒及二期梅毒早期的檢測。取材部位以硬下疳為主,亦可從宮頸、陰道、淋巴結(jié)等處取材。陽性可確診,陰性不能排除梅毒診斷鍍銀染色法:與暗視野檢查法的臨床意義基本相同。利用梅毒螺旋體具有親銀性,可被銀溶液染成棕黑色,再通過普通高倍顯微鏡進(jìn)行觀察直接免疫熒光法(DFA):是目前國外采用較多的方法,其特異性及敏感性均優(yōu)于暗視野檢查法。將特異性的抗梅毒螺旋體單克隆抗體用熒光素標(biāo)記,如標(biāo)本中存在梅毒螺旋體,則通過抗原抗體特異性結(jié)合,在熒光顯微鏡下可見到發(fā)蘋果綠色的梅毒螺旋體梅毒的病原學(xué)檢測珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory人類對梅毒無先天免疫性,尚無疫苗接種進(jìn)行人工免疫,僅能在受感染后產(chǎn)生感染性免疫。已完全治愈的早期梅毒患者仍可以再感染感染梅毒后,首先產(chǎn)生IgM型抗梅毒螺旋體抗體,感染2周后即可測出,早期梅毒抗梅治療3~9個月后或晚期梅毒治療2年后,大部分病人IgM可轉(zhuǎn)陰性,再感染時又出現(xiàn)陽性,故IgM型抗體的存在是活動性梅毒的表現(xiàn)感染梅毒四周左右產(chǎn)生IgG型抗梅毒螺旋體抗體,即使經(jīng)足量抗梅治療,梅毒螺旋體抗原消失后很長時間,IgG抗體仍可通過記憶細(xì)胞的作用繼續(xù)產(chǎn)生,甚至終生在血清中可測出梅毒的免疫性(一)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory梅毒的免疫性(二)另一種具有抗體性質(zhì)的物質(zhì)叫反應(yīng)素(reagin),是梅毒螺旋體破壞人體組織過程中釋放出的一種抗原性心磷脂刺激機(jī)體所產(chǎn)生的抗體。反應(yīng)素一般在感染后5~7周(或下疳出現(xiàn)后2~3周)產(chǎn)生。經(jīng)正規(guī)治療后可逐漸消失胎兒在宮內(nèi)感染梅毒螺旋體后,胚胎晚期(6~9個月)已能合成IgM型抗體,出生后第3個月開始形成IgG型抗體;IgM抗體不能通過胎盤,而IgG抗體能通過胎盤,如患兒血清中檢側(cè)出19S-IgM抗梅毒螺旋體抗體是診斷先天梅毒的有力證據(jù)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory非梅毒螺旋體抗原血清試驗:是以心磷脂、卵磷脂及膽固醇作為抗原檢查血清中的反應(yīng)素,用于初篩試驗及療效觀察??梢苑譃橐韵滤姆N試驗,原理基本相同:
1、性病研究實(shí)驗室玻片試驗(VDRL)
:由于試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用,故而國內(nèi)實(shí)驗室很少采用。但VDRL是唯一可用于神經(jīng)性梅毒診斷的血清學(xué)方法
2、快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(RPR):在特制的紙片上進(jìn)行,加入一定量特制的炭粉,可使抗原抗體出現(xiàn)凝集,用肉眼可觀察結(jié)果。
3、甲苯胺紅試驗(TRUST):在試劑中加入甲苯胺紅代替炭粉顆粒,使結(jié)果更易于觀察。
4、不加熱血清反應(yīng)素試驗(USR)梅毒的血清學(xué)試驗(一)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory非梅毒螺旋體抗原血清試驗的缺陷:
1、特異性:由于在多種疾病,如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、結(jié)締組織病、靜脈吸毒者以及懷孕婦女中均可出現(xiàn)反應(yīng)素,所以此類試驗有時會出現(xiàn)假陽性反應(yīng)
2、敏感性:非梅毒螺旋體抗原血清試驗有時出現(xiàn)弱陽性或陰性結(jié)果,而臨床上又像二期梅毒,此時應(yīng)將此血清稀釋后做定量試驗,如出現(xiàn)陽性結(jié)果,則為抗體過量引起的前帶現(xiàn)象。1-2%二期梅毒病人可出現(xiàn)此現(xiàn)象而發(fā)生梅毒血清假陰性反應(yīng)。此外,由于感染梅毒后反應(yīng)素的出現(xiàn)晚于特異性梅毒螺旋體抗體,晚期梅毒反應(yīng)素又可能轉(zhuǎn)陰,因此這類試驗不適于一、三期梅毒,對隱性梅毒和神經(jīng)梅毒也不敏感。因此此類試驗做梅毒初篩時,存在一定數(shù)量的漏檢非梅毒螺旋體抗原血清試驗的優(yōu)點(diǎn):
1、非梅毒螺旋體抗原血清試驗表現(xiàn)為滴度隨療程逐漸下降,故可以作為療效觀察的指標(biāo)
2、此類方法價格低廉梅毒的血清學(xué)試驗(二)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory梅毒螺旋體抗原血清試驗:用梅毒螺旋體作為抗原檢測血清中的抗螺旋體IgM和/或IgG抗體,其敏感性和特異性均較高。常用的有以下五種方法:
1、熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)2、梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)
3、梅毒螺旋體明膠凝集試驗(TPPA)4、梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(TP-ELISA)
5、梅毒螺旋體快速診斷試驗(TP-RT)梅毒的血清學(xué)試驗(三)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)
FTA-ABS是所有螺旋體試驗中最敏感的方法,特異性也很高,被認(rèn)為是檢測梅毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”但是,該方法在技術(shù)操作上也是最困難的,試驗的操作以及結(jié)果的判讀都必須加以核實(shí)。試驗可靠性的關(guān)鍵是標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果判斷、高質(zhì)量的熒光標(biāo)記抗體以及適當(dāng)?shù)南♂尪?。由于?shí)驗室操作繁瑣以及主觀判讀經(jīng)常產(chǎn)生錯誤結(jié)果,因此增加標(biāo)記熒光標(biāo)記染料的復(fù)染可以減低標(biāo)準(zhǔn)化過程中的錯誤并增加其可讀性及重復(fù)性實(shí)驗需有優(yōu)質(zhì)的熒光顯微鏡和技術(shù)熟練的操作人員才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果,故常不被臨床實(shí)驗室作為首選方法
梅毒的血清學(xué)試驗(四)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory
梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)原理:用超聲裂解的梅毒螺旋體為抗原,致敏經(jīng)醛化、鞣化的羊或禽類紅細(xì)胞,此致敏紅細(xì)胞與人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合,產(chǎn)生肉眼可觀察的凝集反應(yīng)優(yōu)點(diǎn):該方法比FTA-ABS易操作且穩(wěn)定性好,它的敏感性除早期梅毒外與FTA-ABS相似,對大樣本進(jìn)行批量檢測時,TPHA也比FTA-ABS易操作,是國內(nèi)實(shí)驗室常用的梅毒螺旋體確證試驗方法不足:由于紅細(xì)胞具有生物活性,可能產(chǎn)生非特異性凝集,且保存時間較短,批間差較大,故實(shí)際使用中也存在一些問題。目前國內(nèi)使用的商品化TPHA
試劑盒均未通過國家的批批檢梅毒的血清學(xué)試驗(五)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory
梅毒螺旋體明膠凝集試驗(TPPA)原理:TPPA的原理與TPHA基本相同,它以人工合成的惰性明膠顆粒代替TPHA試驗的紅細(xì)胞作為載體,是TPHA的升級產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn):1、試劑穩(wěn)定,批間差小
2、結(jié)果判讀更為清晰明確
3、敏感性和特異性較TPHA進(jìn)一步提高
4、通過了國家的批批檢梅毒的血清學(xué)試驗(六)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫試驗(TP-ELISA)原理:以梅毒螺旋體抗原包被聚丙乙烯板,再加入待檢血清以及酶標(biāo)抗原,形成雙抗原夾心,同時檢測
IgG、IgM抗體。少數(shù)試劑采用間接法,檢測IgG
優(yōu)點(diǎn):1、敏感性和特異性較高
2、價格較低,適合于對大量樣品的篩查
3、可實(shí)現(xiàn)操作的自動化、客觀化不足:各家ELISA試劑盒采用的抗原和工藝不同,使測定的敏感性和特異性產(chǎn)生較大的差異,臨床實(shí)驗室在選用ELISA試劑前應(yīng)認(rèn)真進(jìn)行評估
梅毒的血清學(xué)試驗(七)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory梅毒螺旋體快速診斷試驗(TP-RT)原理:雙抗原夾心免疫層析試驗或間接法免疫滲濾試驗,多采用膠體金進(jìn)行標(biāo)記,同時檢測IgG、IgM抗體(雙抗原夾心法)或單測IgG抗體(間接法)優(yōu)點(diǎn):1、簡便、快速,不需要特殊的儀器
2、適合于單人份操作,可用于較緊急的場合
不足:1、臨床評估資料不多,敏感性、特異性尚有待進(jìn)一步考查
2、無法實(shí)現(xiàn)自動化,結(jié)果判斷主觀
3、測定結(jié)果受溫度和時間的影響較大
4、未通過國家的批批檢
5、價格較高梅毒的血清學(xué)試驗(八)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory關(guān)于梅毒血清學(xué)試驗程序的探討(一)先以非梅毒螺旋體抗原血清試驗(RPR、TRUST等)進(jìn)行初篩,再以梅毒螺旋體抗原血清試驗(TPPA、TPHA、ELISA等)進(jìn)行確認(rèn)優(yōu)點(diǎn):非梅毒螺旋體抗原血清試驗價格低廉,使梅毒檢測的成本可以保持在低水平缺點(diǎn):非梅毒螺旋體抗原血清試驗的敏感性較差,導(dǎo)致臨床上易出現(xiàn)漏檢的情況同時進(jìn)行梅毒螺旋體抗原血清試驗和非梅毒螺旋體抗原血清試驗優(yōu)點(diǎn):這是從技術(shù)上而言的最佳方案缺點(diǎn):人力和試劑成本較高先進(jìn)行梅毒螺旋體抗原血清試驗,陽性時再進(jìn)行非梅毒螺旋體抗原血清試驗珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory關(guān)于梅毒血清學(xué)試驗程序的探討(二)
梅毒螺旋體抗原血清試驗(TPPA等)(-)陰性報告(+)非梅毒螺旋體抗原血清試驗(RPR等)(+)現(xiàn)癥梅毒抗梅治療,療效觀察(-)詢問梅毒既往感染和治療史(有)既往感染(無)隨訪或抗梅治療珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory關(guān)于梅毒血清學(xué)試驗程序的探討(三)一些適合使用梅毒螺旋體抗原血清試驗(TPPA等)進(jìn)行篩查的情況:皮膚、性病門診輸血前檢查手術(shù)前檢查入院檢查產(chǎn)前檢查
檢驗檢疫珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory賽樂迪亞(Serodia)TPPA梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory明膠顆粒的制備明膠阿拉伯膠醋酸染料/色素偏磷酸乙醇水Φ3.0μm表面電荷-0.760~-0.830明膠顆粒(電鏡照片)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory明膠顆粒的致敏5%明膠顆粒/0.15MPBS(pH7.2)5ppm丹寧酸/0.15MPBS(pH7.2)孵育(37℃,15min)生理鹽水洗滌(2000rpm,5min)活化的明膠顆粒/0.15MPBS(pH5~9)抗原孵育(37℃,60min)生理鹽水洗滌(2000rpm,5min)5%致敏明膠顆粒/懸浮液*冷凍干燥*0.15MPBS(加入正常兔血清、明膠、阿拉伯膠等)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactorySerodiaTPPA的操作步驟6、結(jié)果判讀1、加入樣品稀釋液100μl25μl25μl25μl孔號143212、加入測試樣品25μl孔號14321致敏顆粒4、加入明膠顆粒最終稀釋倍數(shù)孔號143211:401:8025μl25μl未致敏顆粒5、混勻,加蓋,孵育2個小時3、樣品的倍比稀釋孔號14321最終稀釋倍數(shù)1:201:4025μl25μl25μl25μl棄去珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory明膠凝集試驗(PA)與ELISA操作步驟的比較ELISAPA加入樣品和稀釋液第一步反應(yīng)洗滌洗滌第二步:酶反應(yīng)顯色第三步:加入底物結(jié)果判讀孵育凝集圖像珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactorySerodiaTPPA的結(jié)果判讀(定性試驗)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactorySerodiaTPPA的結(jié)果判讀(定量試驗)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory反應(yīng)溫度的影響
抗體效價512152530371:25601:12801:6401:160<1:801:80樣品3樣品2樣品1樣品111:320【℃】珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory反應(yīng)時間的影響可判定的凝集圖像0124724【小時】
抗體效價1:25601:12801:6401:160<1:801:80樣品1樣品2樣品3樣品111:320珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory
抗凝劑的影響樣品血清血漿檸檬酸EDTA肝素11:1601:1601:1601:16021:51201:25601:51201:512031:12801:12801:12801:128041:6401:3201:6401:64051:51201:102401:102401:1024061:3201:3201:3201:32071:409601:204801:204801:2048081:25601:12801:12801:256091:6401:6401:6401:640101:25601:12801:25601:2560111:6401:6401:6401:640珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory血清滅活的影響樣品滅活前滅活后11:3201:32021:51201:512031:12801:128041:6401:64051:51201:512061:3201:32071:409601:4096081:25601:256091:6401:640101:25601:2560111:6401:640珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory生物活性物質(zhì)的影響添加物質(zhì)和添加濃度樣品1樣品2樣品3樣品12樣品13樣品14結(jié)合膽紅素(mg/dl)未加1:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:806.451:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:8012.91:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:8021.51:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:80未結(jié)合膽紅素(mg/dl)未加1:1601:6401:5120<1:80<1:80<1:805.251:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:8010.51:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:8017.51:1601:6401:5120<1:80<1:80<1:80血紅蛋白(mg/dl)未加1:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:801681:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:803361:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:805601:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:80乳糜微粒(濁度)未加1:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:807001:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:8014001:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:8023001:1601:6401:2560<1:80<1:80<1:80珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory試劑復(fù)溶后的穩(wěn)定性
抗體效價03810151:51201:12801:6401:160<1:801:80樣品3樣品2樣品1E1:320復(fù)溶后天數(shù)1:2560珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory批間重復(fù)性試驗
樣品第1批第2批第3批最大頻數(shù)變動范圍11:1601:1601:1601:160±0孔21:6401:6401:6401:640±0孔31:25601:25601:25601:2560±0孔41:12801:12801:12801:1280±0孔51:51201:51201:51201:5120±0孔61:801:801:801:80±0孔71:1601:1601:1601:160±0孔81:3201:3201:3201:320±0孔91:3201:3201:3201:320±0孔101:12801:12801:25601:1280+1孔(E)1:3201:3201:3201:320±0孔珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryTPPA與TPHA的比較(一)用TPPA和TPHA分別檢測梅毒螺旋體感染家兔后產(chǎn)生的抗體TPPATPHA感染珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryTPHATPPA感染用TPPA和TPHA分別檢測梅毒螺旋體感染家兔后產(chǎn)生的IgG抗體TPPA與TPHA的比較(二)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory用TPPA和TPHA分別檢測梅毒螺旋體感染家兔后產(chǎn)生的IgM抗體TPPA與TPHA的比較(三)
感染TPPATPHA珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryVeguchi.M.、.J.Jpn..A.I.D.68,1994TPPA、TPHA和RPR檢測新感染的梅毒患者經(jīng)抗梅治療后的抗體轉(zhuǎn)化情況PA,HA1:1601:801:40CUTOFF天RPR1:161:81:41:2(-)(+)(-)FTA-IgM(-)(-)(-)(+)FTA-IgG(+)1.2MU/天,青霉素G
TPPA與TPHA的比較(四)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryTPPA與TPHA的比較(五)陰性陰性陰性陰性陰性陰性FTA-ABS陰性陰性陰性陰性未測未測樣品號<1:808016032064012802560用TPPA檢測12份TPHA的非特異性血清(抗兔睪丸抗體),并與FTA-ABS的結(jié)果進(jìn)行比較珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryTPPA與TPHA對89例可疑梅毒患者血清檢測結(jié)果的比較TPHA-±+TPPA-±+11120020073兩種方法的總符合率為94.4%TPPA與TPHA的比較(六)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryTPPA與TPHA的比較(七)No.TPHATPPAFTA-ABS臨床診斷IgGIgM310111516<1:80<1:80<1:80±(1:80)±(1:80)1:801:80±(1:80)1:801:80+++++-±--±晚期隱性梅毒早期梅毒(治療后)晚期隱性梅毒晚期隱性梅毒早期梅毒(治療后)上述TPPA與TPHA結(jié)果不符合的5例樣品與FTA-ABS測定結(jié)果的比較珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryTPHA-±+TPPA-±+2010102020030兩種方法的總符合率為99.8%TPPA與TPHA對2045例健康獻(xiàn)血員、孕婦及類風(fēng)濕患者血清檢測檢測結(jié)果比較TPPA與TPHA的比較(八)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryNo.TPHATPPAFTA-ABS148726169109236±±-±±++±--
++
±
--上述TPPA與TPHA結(jié)果不符合的5例樣品與FTA-ABS測定結(jié)果的比較TPPA與TPHA的比較(九)珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory
分組n
TRUST(+)
TPPA(+)
陽性率陽性率
正常對照組5000一期梅毒3836(95%)38(100%)二期梅毒109(90%)10(100%)三期梅毒22(100%)2(100%)隱性梅毒1312(92%)13(100%)合計陽性率59(93.7%)63(100%)TPPA與TRUST的比較(一)
TPPA與TRUST對63例梅毒患者及50例健康人血清檢測結(jié)果的比較珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryTPPA與TRUST的比較(二)
TPPA與TRUST對80例梅毒患者檢測結(jié)果的比較
合計
13336180TRUST(+)8325669TRUST(-)51511TPPA滴度
1:801:1601:3201:640≥1:1280合計珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactoryTPPA與TRUST的比較(三)
TPPA與TRUST對249例不潔性接觸史患者檢測結(jié)果的比較臨床診斷例數(shù)TRUSTTPPA陽性數(shù)陽性率陽性數(shù)陽性率早期梅毒584374.1%58100%其它不潔性接觸史患者19100%00%珠海麗珠試劑有限公司Livzon(Group)ReagentFactory
分組n
ELISA(+)
TPPA(+)
陽性率陽性率
正常對照組5000一期梅
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