第四講微生物與生物轉(zhuǎn)化

4.微生物與生物轉(zhuǎn)化概述生物催化劑：微生物〔細(xì)胞直接進(jìn)行催化〕酶的來源，催化非天然有機(jī)物發(fā)生轉(zhuǎn)化反響優(yōu)點(diǎn)：1、同時(shí)參與反響的酶的種類多——底物范圍廣2、不需要進(jìn)行酶的別離純化——方便，廉價(jià)，高效3、解決輔酶再生問題缺點(diǎn)：1、副產(chǎn)物多——得率低2、產(chǎn)物別離純化困難用途：有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、維生素、甾體激素等手性化合物的工業(yè)化生產(chǎn)4.1微生物學(xué)根底微生物的特點(diǎn)微生物〔microorganism〕：所有形態(tài)微小，單細(xì)胞的或個(gè)體結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的多細(xì)胞的、甚或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物的通稱。微生物類群十分龐雜，包括：病毒(不具細(xì)胞結(jié)構(gòu))、立克次氏體、細(xì)菌、放線菌(單細(xì)胞)酵母、霉菌、單細(xì)胞藻類、原生動(dòng)物等

原核生物：不具核膜，核物質(zhì)裸露，沒有有絲分裂過程真核生物：細(xì)胞核有核膜，進(jìn)行有絲分裂特點(diǎn)1、體積小，面積大——比外表積大，代謝強(qiáng)度大2、種類多——10萬種以上，各具特性(三廢處理、合成產(chǎn)品)3、分布廣——營(yíng)養(yǎng)要求不高，生長(zhǎng)繁殖速度快，土壤4、繁殖快，轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)5、適應(yīng)性強(qiáng)，容易培養(yǎng)——誘導(dǎo)酶、抗逆性強(qiáng)、極端微生物溫度、壓力、高鹽濃度、酸堿、枯燥、輻射、毒物等和化學(xué)合成法相比：常溫常壓、原料廉價(jià)、來源廣、不需其他特殊催化劑、環(huán)境友好6、易變異：本質(zhì)是基因突變，優(yōu)點(diǎn)，也是缺點(diǎn)——可調(diào)常用微生物：細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌1、細(xì)菌：球狀、桿狀、螺旋狀，分裂生殖，體積很小球菌：球形或橢圓形。分裂后產(chǎn)生的新細(xì)胞常保持一定的空間排列方式?！矄吻蚓?、葡萄球菌等〕桿菌：桿狀或圓柱形。發(fā)酵工業(yè)中最常用。螺旋菌：細(xì)胞呈彎曲桿狀?！不【?、螺旋菌〕醋桿菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、大腸桿菌、短桿菌屬

2、放線菌菌落呈放線狀而得名〔Actinomyces〕厭氣菌——放線菌屬好氣菌——鏈霉菌屬，也是放線菌放線菌多為腐生，少數(shù)寄生。菌落特點(diǎn)：枯燥，不透明，外表呈緊密的絲絨狀，上面有一層色彩鮮艷的干粉；菌落和培養(yǎng)基連接緊密，那以挑取；菌落正反面顏色常常不一致最突出的特性：產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素

目前已發(fā)現(xiàn)和別離的5500種以上的抗生素，其中4400多種為放線菌所產(chǎn)生。實(shí)際應(yīng)用的有100多種，如鏈霉素、井岡霉素等。此外，還可用于：

生產(chǎn)維生素、嵋制劑；甾體轉(zhuǎn)化、石油脫蠟、烴類發(fā)酵、污水處放線菌的存在范圍：土壤中最多，河流、湖泊和海洋中較少；大氣中也有很多菌絲和孢子，食品、動(dòng)物上放線菌為單細(xì)胞，革蘭氏陽性。菌絲分為：營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲放線菌孢子較耐枯燥，不耐高溫〔65度15分鐘〕放線菌的代表屬：鏈霉菌屬諾卡氏菌屬：可用于污水處理等放線菌屬：多為致病菌小單胞菌屬鏈孢囊菌屬：可形成孢子囊和孢囊孢子游動(dòng)放線菌屬：孢囊孢子可以運(yùn)動(dòng)3、霉菌〔mold〕是一類“絲狀真菌〞的通稱，不是分類學(xué)上的名詞，在分類學(xué)上分別隸屬于藻狀菌、子囊菌和半知菌。定義：凡在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)形成絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的真菌，通稱為霉菌。霉菌的菌落特征和放線菌類似，但是菌落較大，質(zhì)地一般比放線菌疏松。用途：釀酒、制醬、發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)、紡織、食品、皮革加工但是也會(huì)引起發(fā)霉變質(zhì)，是人和動(dòng)植物致病。全世界由于霉變而不能食〔飼〕用的谷物約占2％。目前的霉菌毒素達(dá)100種以上。其中毒性最強(qiáng)的是由黃曲霉菌產(chǎn)生的黃曲霉毒素——致癌常用霉菌：a.毛酶：制作腐乳、豆豉等食品，甾體轉(zhuǎn)化b.根霉：淀粉酶、糖化酶〔米根霉〕c.曲霉：制醬、釀酒、制醋、酶制劑、有機(jī)酸、糖化黑曲霉、米曲霉、黃曲霉d.青霉：產(chǎn)黃青霉、橘青霉、婁地青霉、展青霉e.紅曲、木霉、地霉、假囊霉、脈孢菌、交鏈孢霉、赤霉菌、白僵菌〔生物農(nóng)藥，昆蟲病害的防治〕4、酵母〔Yeast〕大多數(shù)酵母為單細(xì)胞。一般呈卵圓形、圓形、圓柱形或者檸檬形。常用的為：酵母屬〔Saccharomyces〕和假絲酵母〔Candida〕。主要有釀酒酵母、產(chǎn)阮假絲酵母、熱帶假絲酵母、畢赤酵母等。微生物菌種的別離1、采樣：地點(diǎn)確實(shí)定：篩選目的、微生物分別特征、菌種的特征一般在土壤中?！灿械姆攀浮橙臃秶獜V2、增殖培養(yǎng)：一般需要進(jìn)行目的菌種的富集選擇有利于目的菌種生長(zhǎng)繁殖而非目的菌種不容易生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)條件。如特殊底物、溫度、pH、微量元素、金屬離子、抑制劑等。4.2微生物的別離和選育3、純種別離增殖培養(yǎng)后——各種菌種的混合物發(fā)酵或者培養(yǎng)要求——純種方法：a.劃線法b.稀釋法目的：獲得單菌落過程中也可以參加篩選控制條件，提高篩選效率4、性能鑒定兩步法：初篩〔快速的培養(yǎng)和測(cè)定方法，也可在純種別離時(shí)進(jìn)行〕復(fù)篩〔比較復(fù)雜，精確，定量，可以確定目的菌種〕重復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)菌種性質(zhì)，獲得幾株野生型菌株誘變育種野生型菌種性能尚達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要進(jìn)行“育種：。方法：基因突變〔自然、誘發(fā)〕

誘變：誘變劑處理〔致死率和突變率，正突變和負(fù)突變〕、高效篩選方法：可以借鑒野生型的篩選方法存在主要問題：工作量大、缺乏人工控制、提高幅度有一定限度〔尤其對(duì)于高產(chǎn)突變菌種〕工作程序：a.選擇出發(fā)菌株〔連續(xù)誘變〕b.菌懸液的制備〔單細(xì)胞或者孢子進(jìn)行誘變〕c.誘變：化學(xué)誘變、物理誘變

物理誘變劑：各種射線，最常用的紫外線，太空育種對(duì)DNA發(fā)生作用化學(xué)誘變劑：作用原理比較復(fù)雜，常用的如亞硝基胍和甲基磺酸乙酯〔EMS〕d.變異株的別離和篩選初篩：菌落形態(tài)、色澤的變化〔有時(shí)會(huì)和性質(zhì)有關(guān)聯(lián)〕指示平板：平板培養(yǎng)基中有指示劑復(fù)篩：營(yíng)養(yǎng)缺陷型〔中間培養(yǎng)淘汰野生型〕缺陷的類型：氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶等發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢查其生產(chǎn)性能重組工程菌的構(gòu)建天然微生物中所需要的酶含量少，不能適應(yīng)生物催化的要求利用遺傳工程技術(shù)可以構(gòu)建新的工程菌大量表達(dá)生物催化所需要的酶滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要操作步驟：a.載體b.基因的別離c.DNA分子的切割和連接d.引入宿主細(xì)胞e.重組體的篩選f.外源基因的表達(dá)〔轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾〕原生質(zhì)體技術(shù)：多酶體系的重組包括：原生質(zhì)體誘變、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染、融合等。

克隆天然酶基因序列直接用PCR擴(kuò)增未知序列根據(jù)同類酶保守序列設(shè)計(jì)引物或探針釣基因建立genomicDNA或cDNA表達(dá)文庫(kù)篩選純化酶，測(cè)定局部序列，設(shè)計(jì)引物或探針釣基因表達(dá)系統(tǒng)的共性基因克隆至表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主細(xì)胞篩選轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)表達(dá)蛋白質(zhì)重組酶表達(dá)小結(jié)選用強(qiáng)啟動(dòng)子假設(shè)需翻譯后修飾選用酵母系統(tǒng)蛋白質(zhì)折疊和降解是高表達(dá)方案中的主要問題融合表達(dá)蛋白酶缺陷菌株發(fā)酵條件培養(yǎng)基：微生物的生長(zhǎng)、繁殖、產(chǎn)物形成、產(chǎn)品提取別離工藝的選擇a.提供構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的有關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)b.提供能量c.參加前體物質(zhì)用于提高產(chǎn)品的產(chǎn)量包括：碳源〔糖類、有機(jī)酸、醇和氨基酸、碳?xì)浠衔?、二氧化碳－光合作用，化學(xué)能〕氮源：有機(jī)氮、無機(jī)氮、固氮微生物〔空氣中的氮〕無機(jī)元素：酶活、生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)輔助物質(zhì)：營(yíng)養(yǎng)缺陷，酵母粉、麥芽汁水分：占細(xì)胞總量的80-90％氣體：氧氣和二氧化碳4.3微生物培養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化：?jiǎn)我蜃訉?shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)、代謝途徑研究?jī)?nèi)容：種類、濃度、比例、緩沖能力和種類粘度、雜質(zhì)影響、誘導(dǎo)物、前體、促進(jìn)劑的參加量、參加時(shí)間和參加方式，各種影響因素相互的作用文獻(xiàn)報(bào)道、菌種根本要求、同類微生物的要求細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)研究微生物的營(yíng)養(yǎng)類型：a.光能自養(yǎng)微生物：光合作用，光為能源，無機(jī)物作為氫的受體復(fù)原二氧化碳合成有機(jī)化合物如：藻類、藍(lán)細(xì)菌等b.光能異養(yǎng)微生物：有機(jī)物為氫受體復(fù)原二氧化碳合成有機(jī)物c.化能自養(yǎng)微生物：以無機(jī)物氧化所產(chǎn)生的化學(xué)能作為能源，以二氧化碳作為碳源合成有機(jī)物如：硝化細(xì)菌、硫細(xì)菌等d.化能異養(yǎng)微生物：大多數(shù)微生物都屬于這類。腐生型和寄生型微生物的培養(yǎng)方法外表培養(yǎng)：類似自然培養(yǎng)固體培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基，設(shè)備簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度低液體深層培養(yǎng)：可控性好，設(shè)備投資大，工業(yè)化生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)－新鮮的種子，菌種的別離純化和復(fù)壯一級(jí)種子：搖瓶培養(yǎng)，由斜面培養(yǎng)基中接入二級(jí)種子：種子罐，質(zhì)量檢查，是否染菌多級(jí)種子罐：50立的發(fā)酵罐一般使用三級(jí)發(fā)酵接種菌齡，接種量發(fā)酵：酶、次級(jí)代謝產(chǎn)物，純種培養(yǎng)，產(chǎn)品提取和精制目的：使菌種的生命得以延續(xù)并保持其生物學(xué)特性菌種保藏方法：根本原理：根據(jù)微生物的生理、生化特點(diǎn)，人工的創(chuàng)造條件使微生物處于代謝不活潑、生長(zhǎng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。——低溫、枯燥、缺氧1.斜面保藏法：4℃可以保藏3-6個(gè)月，到期轉(zhuǎn)接新鮮斜面容易發(fā)生變異、染菌，可覆蓋礦物油2.穿刺保藏法：用接種針將菌種穿刺接入培養(yǎng)基的1/2處，然后覆蓋無菌液體石蠟〔保持水分、隔絕氧氣〕從中接出來時(shí)要進(jìn)行復(fù)壯4.3菌種保藏3.枯燥保藏法：適用于形成芽孢的細(xì)菌、形成孢子的絲狀真菌和放線菌。原理：將微生物吸附在各種載體上，枯燥后保藏。使用時(shí)要進(jìn)行復(fù)壯，常用的為滅菌的沙子和土壤4.懸液保藏法：將微生物懸浮于不含養(yǎng)分的溶液中，如蒸餾水磷酸緩沖液或生理鹽水中，然后密封保藏5.冷凍枯燥保藏法：保藏期長(zhǎng)，變異小，便于大量保藏，適用范圍廣，是各保藏機(jī)構(gòu)的主要方法原理：將微生物或者孢子冷凍，然后在減壓情況下利用升華原理除去水分，使細(xì)胞的生命活度處于停止?fàn)顟B(tài)，然后進(jìn)行低溫保藏〔一般4℃〕。常用分散劑：脫脂牛奶和血清菌種：處于生長(zhǎng)后期的微生物，一般細(xì)菌培養(yǎng)24小時(shí)，酵母培養(yǎng)72小時(shí)，放線菌和絲狀菌種培養(yǎng)7天參加分散劑并刮下微生物菌體或孢子，制成懸液－30℃左右冷凍，真空枯燥，使水分升華枯燥完畢后，抽真空并熔封。復(fù)壯后使用6.液氮保藏法：效果好，方法簡(jiǎn)單，保藏對(duì)象最為廣泛濃的懸液參加滅菌后的分散劑中，參加最終濃度10％的甘油或者5％的DMSO作為防凍保護(hù)劑，立即熔封。緩慢冷卻到－25℃左右，保藏在－196℃的液氮罐中。使用時(shí)取出放入38－40℃的溫水振蕩融化，然后接種7.低溫保藏法－20℃的低溫中用15％甘油保藏。菌種保藏中心ATCC〔美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心〕ARC〔美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究效勞部〕NCTC〔英國(guó)國(guó)立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所〕CBS〔荷蘭霉菌中心保藏所〕IFO〔日本大阪發(fā)酵研究所〕中國(guó)有7個(gè)菌種保藏中心4.5微生物生物轉(zhuǎn)化定義：利用微生物中特定的酶將人工合成的非天然化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液經(jīng)別離純化可得到所需產(chǎn)品的過程。本質(zhì)上與直接發(fā)酵法是一樣的，為酶催化反響不同：發(fā)酵法：多酶低密度轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化：?jiǎn)蚊富蛘叨嗝傅母呙芏绒D(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化優(yōu)點(diǎn)：工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)物濃度高、轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)效率高，副產(chǎn)物少微生物種類多，含酶豐富，可進(jìn)行多種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)微生物生物轉(zhuǎn)化反響具有高度選擇性，尤其是立體選擇性，可完成一般化學(xué)反響難以實(shí)現(xiàn)的反響如甾體、萜類與生物堿等有機(jī)化合物中非活潑氫的羥化反響反響條件溫和，適用于不穩(wěn)定化合物的制備一般用游離細(xì)胞或者固定化細(xì)胞培養(yǎng)法

游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化法：1、底物的預(yù)處理考慮底物的各種性質(zhì)，包括滲透性，溶解度，穩(wěn)定性和毒性等。目的：保證底物和催化反響的酶能夠相互接觸a.酶的位置：胞內(nèi)，底物首先要和細(xì)胞充分接觸b.底物要透過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)真菌細(xì)胞壁透過性較好，因此轉(zhuǎn)化效率高細(xì)菌細(xì)胞壁透過性較差，因此轉(zhuǎn)化效率低一般底物在轉(zhuǎn)化體系中溶解度大，生物轉(zhuǎn)化率就高常用底物添加方法：微生物轉(zhuǎn)化反響一般在水溶液中進(jìn)行，因此水溶性強(qiáng)的底物可以高效進(jìn)行反響，對(duì)于水溶性差的底物(大多數(shù)生物轉(zhuǎn)化的底物水溶性都比較差，非天然有機(jī)化合物)可以采用以下方法：a.無毒性的溶劑溶解底物，如乙醇、丙酮等。b.直接添加固體底物，然后添加無毒性的外表活性劑如吐溫系列物，劇烈攪拌，形成乳化液，以減少傳質(zhì)阻力。如果底物對(duì)微生物有毒，那么會(huì)干擾微生物的生長(zhǎng)，可以采用以下方法：a.少量屢次添加，控制底物濃度在毒性濃度之下b.分步法：首先培養(yǎng)細(xì)胞，然后誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生，最后進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化c.酸性或者堿性底物以鹽的形式添加d.揮發(fā)性底物在密閉體系中反響e.光敏底物在黑暗條件下反響2、生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法在微生物細(xì)胞培養(yǎng)前或者培養(yǎng)一段時(shí)間后，將底物直接參加到培養(yǎng)基中，微生物在生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)對(duì)底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。優(yōu)點(diǎn)：容易，效率高缺點(diǎn)：產(chǎn)品別離純化困難尤其適用于能以底物作為唯一碳源的微生物3、靜態(tài)細(xì)胞