系統(tǒng)生物學與蛋白質(zhì)組學

系統(tǒng)生物學與蛋白質(zhì)組學

Introductiontosystematicbiology&proteomics1系統(tǒng)生物學2系統(tǒng)生物學345基因組學與人類基因組計劃1984年，由美國能源部發(fā)起——$530萬1988年，NIH，詹姆斯·沃森，1992年，柯林斯1990年，美國能源部、NIH——$30億1998年，CeleraGenomics——J.CraigVenter，陳奕雄1999年，中國加入1%，第3號染色體上3000萬個堿基對2000年6月26日，工作草圖完成6轉(zhuǎn)錄組與基因芯片廣義：一個細胞、組織或生物體中出現(xiàn)的所有RNA的總和，包括mRNA、rRNA、tRNA及非編碼RNA；狹義：mRNA1991年Fodor第一張芯片1994年Affymetrix第一張商業(yè)化芯片7代謝組學metabonomics/metabolomics效仿基因組學和蛋白質(zhì)組學的研究思想，對生物體內(nèi)所有代謝物進行定量分析，研究對象大都是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。1999年，英國帝國理工大學JeremyNicholson8生物信息學9蛋白質(zhì)組與人類蛋白質(zhì)組計劃由澳大利亞學者Wilkins和Willian于1994年提出。人類蛋白質(zhì)組計劃：血液、腦、肝………10蛋白質(zhì)組學定義蛋白質(zhì)組學定義（proteome)

一個基因組，一個細胞或組織，一種生物在一定時間，一定條件下所表達的全部蛋白組成，存在形式，活動方式及時空動態(tài)。為什么除基因組學外還要研究蛋白質(zhì)組學：（1）蛋白質(zhì)是功能的執(zhí)行者。（2）基因組與蛋白質(zhì)組不一樣：轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪切，翻譯后的修飾等等，導致蛋白質(zhì)組遠比基因組復雜。（3）與基因組相比，蛋白質(zhì)組具有以下特點：多樣性，無限性，動態(tài)性，相互作用，時空變化，需要多種技術(shù)，組學間的互助11蛋白質(zhì)組學研究內(nèi)容蛋白質(zhì)的表達模式（1）生理、病理或不同發(fā)育狀態(tài)下蛋白質(zhì)組表達差異蛋白質(zhì)信息庫。（2）蛋白質(zhì)及其組成質(zhì)點的分離、分析、鑒定。蛋白質(zhì)的功能模式（1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。（2）蛋白之間相互作用，翻譯后修飾，細胞定位等。12蛋白質(zhì)組學研究內(nèi)容1314蛋白質(zhì)組學研究的基本技術(shù)蛋白分離技術(shù)：

（1）經(jīng)典雙向電泳方法（2）DIGE

（3）SILAC

（4）iTRAQ質(zhì)譜技術(shù):蛋白鑒定、翻譯后修飾（磷酸化、糖基化）151：常規(guī)雙向電泳雙向電泳基本原理：雙向電泳(Two-dimensionalelectrophoresis)的基本原理是利用蛋白質(zhì)的等電點（pI)和分子量(Mr)不同而分離蛋白質(zhì)：第一向電泳——等電聚焦（IsoelectricFocusing，IEF）根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同將蛋白質(zhì)分離，第二向電泳——十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis,SDS—PAGE）利用蛋白質(zhì)的分子量大小不同將蛋白質(zhì)分離。

16雙向電泳流程

基于2D的經(jīng)典定量分析方法。

1、樣品準備和定量：抽提對照組和各種不同實驗組的蛋白質(zhì)。

2、蛋白質(zhì)分離：蛋白質(zhì)經(jīng)過2D分離后染色（銀染、考染等）。

3、蛋白質(zhì)的定性與定量分析：通過與對照組相ImageMaster7.0分析出實驗組中差異點，質(zhì)譜鑒定差異點蛋白質(zhì),同時應(yīng)用軟件分析出其表達量的變化。172：DIGE

DIGE熒光定量方法流程圖.1、樣品準備：提取對照組和不同實驗組的蛋白質(zhì),定量,cy3和cy5交叉標記，同時將所有實驗組與對照組的樣品等量混合后cy2標記，作為內(nèi)標。

2、蛋白質(zhì)分離：等量混合三種熒光素標記后的蛋白質(zhì)，2D電泳分離，熒光顯色。

3、蛋白質(zhì)定量分析：ImageMaster7.0（DIGE)分析同一蛋白質(zhì)不同處理后的表達量變化。183:化學標記法—iTRAQiTRAQ法。

1：樣本經(jīng)過不同處理后，提取蛋白質(zhì);2：蛋白質(zhì)經(jīng)過還原，封閉后胰蛋白酶酶切;3：肽段混合物分別用不同的iTRAQ標記;4：等量混合各種iTRAQ試劑標記的肽段;5：MS/MS質(zhì)譜檢測及分析。194:SILAC

SILAC法。細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術(shù)(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)

1、標記：在缺乏Lys和Arg的培養(yǎng)基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C615N4)、Arg(13C6,或13C615N4)等培養(yǎng)細胞，使蛋白質(zhì)被標記成“中型”或“重型”；

2、細胞處理，如藥物處理；

3、細胞裂解、提取蛋白質(zhì)；

4、等量混合對照與處理組蛋白質(zhì)、SDS電泳、染色；

5、割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶消化，質(zhì)譜分析。20

MassSpectrometry:Methods&Theory21MassSpectrometryAnalyticalmethodtomeasurethemolecularoratomicweightofsamples22PeptideMassFingerprinting(PMF)23MassSpecPrinciplesIonizerSample+_MassAnalyzerDetector24m/zratio:MolecularweightdividedbythechargeonthisproteinAllproteinsaresortedbasedonamasstochargeratio(m/z)25TypicalMassSpectrumaspirinRelativeAbundance120m/z-forsinglychargedionthisisthemass26ResolutioninMS27ResolutioninMSQTOF783.455784.465785.475783.62829SoftIonizationMethods337nmUVlaserMALDIcyano-hydroxycinnamicacidGoldtipneedleFluid(nosalt)ESI+_30Query(MALDI)Spectrum50010001500200025006982098119910076094502211(trp)1940(trp)31Queryvs.DatabaseQueryMasses

DatabaseMassList

Results450.2017(P21234)609.2667(P12345)664.3300(P89212)1007.4251(P12345)1114.4416(P89212)1183.5266(P12345)1300.5116(P21234)1407.6462(P21234)1526.6211(P89212)1593.7101(P89212)1740.7501(P21234)2098.8909(P12345)450.2201609.3667698.31001007.53911199.49162098.99092Unknownmasses1hitonP212343hitsonP12345ConcludethequeryproteinisP1234532DatabasesearchtheoreticalexperimentalMascotProteinIDPeptIdent(ExPasy)Mascot(MatrixScience)MS-