LAMP技術(shù)及應(yīng)用課件

LAMP技術(shù)及應(yīng)用湖北省疾控中心結(jié)防所22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(loopmediatedisothermalamplification,LAMP),是一種在恒定溫度下實現(xiàn)核酸的指數(shù)級擴增的技術(shù)已經(jīng)被用來快速檢測動物病原(病毒、細菌、寄生蟲)LAMP技術(shù)因其特異、敏感、簡便、快捷、檢測方式對實驗室基礎(chǔ)設(shè)施、設(shè)備的要求較少，逐步用于結(jié)核分枝桿菌診斷鑒別中世界衛(wèi)生組織于2016年8月11日，在日內(nèi)瓦發(fā)布了一份最新的推薦書，推薦發(fā)展中國家的基礎(chǔ)醫(yī)療單位使用該方法，可以作為痰涂片檢測方法的替代方案LAMP技術(shù)及應(yīng)用縣區(qū)級檢測結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增多色巢氏熒光PCR法交叉引物發(fā)RNA等溫擴增法等省、自治區(qū)檢測結(jié)核分枝桿菌檢測是否對利福平和異煙肼耐藥地市級結(jié)核分枝桿菌及是否對利福平和異煙肼耐藥基因芯片溶解曲線線性探針“十三五”規(guī)劃要求逐步推廣的新診斷技術(shù)LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP技術(shù)的原理

對靶基因的6個特異部位設(shè)定4種引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效、快速、特異地擴增。LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法使用的酶鏈置換型DNA聚合酶:BstDNAPolymerase擴增對象為雙鏈DNA時，其中一條鏈解離的同時進行鏈延長。LAMP法使用最適溫度65℃的聚合酶。22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法的引物設(shè)計22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法的原理22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法的原理22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP技術(shù)特點靈敏度高LAMP一般能檢測到比PCR低10倍的拷貝數(shù)，擴增模板可低至每測試10拷貝或更少。特異性強通過4對引物與靶序列上的6個特異部位準確結(jié)合來產(chǎn)生擴增效應(yīng),因此能獲得比PCR更高的特異性。速度快恒溫擴增反應(yīng),沒有PCR反應(yīng)中溫度變化的耗時,省卻溫度循環(huán)，在30min～60min內(nèi)即可完成反應(yīng)過程。設(shè)備簡單只需一個簡單的恒溫器,不需要昂貴的PCR儀。產(chǎn)物檢測便捷在合成DNA的同時產(chǎn)生的大量焦磷酸根離子,與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，從而能定性判斷LAMP反應(yīng)；可與熒光物質(zhì)結(jié)合。LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法和其他PCR法的比較22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法和其他PCR法的比較22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法所需的試劑22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP技術(shù)簡介

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）是由日本研究人員發(fā)明的一種新型的體外等溫擴增特異核酸片段的技術(shù)。該技術(shù)可以在等溫條件下（約65℃）進行核酸擴增反應(yīng)，克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通過反復(fù)的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點，從而實現(xiàn)在恒溫條件下進行連續(xù)快速的核酸擴增，并且可以通過簡易直觀的目測判讀結(jié)果，相比傳統(tǒng)PCR大大節(jié)省了時間和實驗操作步驟。22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法常規(guī)操作步驟22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法的檢測方法瓊脂糖凝膠電泳法由LAMP原理可知，LAMP反應(yīng)的最終擴增產(chǎn)物是莖環(huán)DNA組成的混合物，即有若干倍莖長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)。因此，LAMP擴增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠糖上呈現(xiàn)的是典型的梯狀條帶。（圖A）肉眼觀察法在LAMP反應(yīng)過程中，可以通過產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的產(chǎn)生來肉眼直接判斷擴增反應(yīng)是否進行。（圖B）通過熒光染料檢測有時，通過肉眼觀察白色沉淀來檢測會存在一定的誤差，所以也可通過添加熒光染料，如溴化乙錠(EB)、SYBRGreenI等進行染色，來檢測擴增是否發(fā)生。（圖C）22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用靶標限定:結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群gyrB基因作為結(jié)核分枝桿菌重要的功能基因，在復(fù)合群進化過程中非常保守，LAMP法檢測即以gyrB基因作為靶標。臨床上感染人類的是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌。對檢測對象的準確限定能避免假陽性過高而增加治療成本，長遠來說，更有利于避免耐藥性的產(chǎn)生。22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用適宜的檢測對象

以臨床上引起結(jié)核感染的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群為檢測對象，可避免假陽性過高。反應(yīng)管預(yù)裝反應(yīng)體系

擴增及檢測在全封閉反應(yīng)管中進行，有效降低氣溶膠污染；用戶操作簡便、減少操作誤差。結(jié)果易讀

產(chǎn)物和顯色液直接顯色即可肉眼判斷結(jié)果。技術(shù)特點：22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用臨床試驗——

LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結(jié)果靈敏度＝89.54%陽性結(jié)果預(yù)期值＝98.13%特異性＝98.93%陰性結(jié)果預(yù)期值＝93.77%總符合率＝95.31%22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用臨床試驗——

LAMP法和對照試劑（TB-qPCR）對比結(jié)果陽性一致率=88.56%陰性一致率=93.06%總符合率=91.36%22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用WHO認為LAMP法的檢測結(jié)果優(yōu)于痰涂片檢測。在已有肺結(jié)核癥狀的檢測者中進行對比，TB-LAMP法比痰涂片檢測法多檢出15%的患者。對比WHO近年推薦的其它快速檢測法，如果把TB-LAMP法用于對痰涂片檢測陰性患者的復(fù)查，TB-LAMP法檢出率要高40%。22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用現(xiàn)有結(jié)核診斷方法和環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法比較22一月2024LAMP技術(shù)及應(yīng)用痰標本目測法檢測流程100分鐘

LAMP技術(shù)及應(yīng)用一、樣品處理

1、用2~3倍體積的4%NaOH溶液消化痰液2、吸取1mL痰液液化液加入無菌1.5mL離心管中LAMP技術(shù)及應(yīng)用一、樣品處理

2、13000r/min離心10min，盡量吸棄上清LAMP技術(shù)及應(yīng)用一、樣品處理3、沉淀用1mL生理鹽水重懸洗滌LAMP技術(shù)及應(yīng)用一、樣品處理4、13000r/min離心10min，盡量吸棄上清5、重復(fù)步驟3、4一次LAMP技術(shù)及應(yīng)用一、樣品處理6、向含沉淀物的離心管分別加入100μLDNA提取液，混勻后沸水浴10minLAMP技術(shù)及應(yīng)用一、樣品處理7、冷卻至室溫后，

13000r/min離心﹥5min，上清即為核酸模板LAMP技術(shù)及應(yīng)用二、核酸擴增1、向反應(yīng)管內(nèi)按順序分別加入陰性對照、待檢模板和陽性對照各2.5μL，注意加樣時槍頭要穿透穩(wěn)定液層加至反應(yīng)管大腔內(nèi)，蓋緊管蓋并做好標記，移至反應(yīng)區(qū)LAMP技術(shù)及應(yīng)用二、核酸擴增2、置65℃恒溫反應(yīng)60minLAMP技術(shù)及應(yīng)用三、結(jié)果判斷1、反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)管倒置甩動2次，再正置甩動2次，使工作液與顯色液充分混合LAMP技術(shù)及應(yīng)用三、結(jié)果判斷2、在陰性對照反應(yīng)管液體顏色為無色（或橙色），陽性對照反應(yīng)管液體顏色呈綠色的條件下：若待檢樣本反應(yīng)管中液體顏色呈綠色，則可報告該樣本檢測結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性；若待檢樣本反應(yīng)管中液體顏色為無色（或橙色），則可報告該樣本檢測結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陰性；若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測。LAMP技術(shù)及應(yīng)用（1）LAMP結(jié)果為陽性，涂片結(jié)果也為陽性?？勺龀龌颊咭伤苹加薪Y(jié)核病的診斷，并開始抗結(jié)核治療，同時等待培養(yǎng)結(jié)果。（2）LAMP結(jié)果陽性，而涂片結(jié)果為陰性。根據(jù)臨床癥狀判斷是否開始抗結(jié)核治療，同時等待培養(yǎng)結(jié)果。這時可考慮增加一個或一個以上的標本進行LAMP檢測以確認。如果增加的標本檢測結(jié)果也為陽性，則患者可被初步診斷為患有結(jié)核病，并等待培養(yǎng)的結(jié)果。（3）LAMP結(jié)果為陰性，涂片結(jié)果為陽性。應(yīng)考慮LAMP結(jié)果是否受痰標本中的抑制物影響，并增加一個或一個以上的標本檢測。若增加的標本檢測結(jié)果仍不變，且排除抑制物因素，則患者可初步考慮為非結(jié)核分枝桿菌感染，進行進一步確診實驗。（4）LAMP結(jié)果為陰性，涂片結(jié)果亦為陰性。根據(jù)臨床癥狀判斷是否開始抗結(jié)核治療，并等待培養(yǎng)結(jié)果。（5）隨訪患者LAMP結(jié)果陽性，不能作為隨訪患者的療效評價。LAMP檢測結(jié)果的臨床應(yīng)用LAMP技術(shù)及應(yīng)用一點建議?根據(jù)試劑盒