資助類別亞類說(shuō)明版面上項(xiàng)目proposal

國(guó)家自然科學(xué)基書(shū)（2015資助類別亞類說(shuō)明附注說(shuō)明項(xiàng)目名稱依托單位通訊地址廣州市越秀區(qū)沿江西路107郵國(guó)家自然科學(xué)基書(shū)（2015資助類別亞類說(shuō)明附注說(shuō)明項(xiàng)目名稱依托單位通訊地址廣州市越秀區(qū)沿江西路107郵政編碼單位電話02084111595、電子郵箱申報(bào)日期2015年03月05版本第1 男 每年工作時(shí)間（月 廣州市越秀區(qū)沿江西路107 版本第1 男 每年工作時(shí)間（月 廣州市越秀區(qū)沿江西路107 StudyonFunctionofHedgehogsignalingpathwayduringliverregenerationanditspotentialapplicationinfutureclinic2016年012019年12liverregeneration;sub-acutehepaticinjury;Hedgehogsignalingpathway;hepatocytestransplant;fumarylacetoacetatehydrolase(Fah)版本第2版本第2模型，研究亞急性肝損傷引起的肝再生中Hedgehog(Hh)信號(hào)通路激活與增殖肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在肝Liverregenerationistheprocessofliverreconstructionandrestorationaftervariousliverinjuriesinducedbymechanicaldamage,toxicationandvirusinfection.Recently,activationofHedgehog(Hh)pathwayhasbeenfoundduringpartialheptectomy-inducedliverregeneration.However,duetothelimitsofthismodelsystem,pathologicalinjury-inducedliverregenerationsarestillpoorlyunderstood.Inthisproposal,wewilluseFah-/-mouse,atyrosinimiarelativeliverinjury-inducedliverregenerationmodelsystem,tostudythefunctionofHhsignalingpathwayduringliverregenerationandtestitspotentialforfutureclinicapplication.Inpreliminarystudy,wehavefoundsomeuniquefeaturesofHhpathwayactivationduringliverrepopulationinFah-/-mouse.Inthisproject,weproposetheplanforcontinuedinvestigation;First,wewillbroadlystudythedetailsofactivationofHhsignalingpathwayduringtheprocessofliverrepopulationoftransplantedhepatocytesinFah-/-mouse.Second,wewillevaluatewhethertheinhibitorsofHhsignalingpathwaycanblocktheliverrepopulationofhepatocytesinFah-/-mouse.Finally,wewilltestwhethertheup-regulationofHhsignalingpathwaycanfurtherpromotetheliverregenerationinsub-acutehepaticinjury.Ourstudywillsupplynewinformationforapplicationofliverregenerationintofutureclinicandforfindingthetargetsofdruginscreeningtocontrolliverregeneration.項(xiàng)目組主要參與者（項(xiàng)目組主要參與者不包括項(xiàng)目申請(qǐng)人版本第392210041男0471-82男020-83男0471-94男020-5男0471-6男020-7項(xiàng)目組主要參與者（項(xiàng)目組主要參與者不包括項(xiàng)目申請(qǐng)人版本第392210041男0471-82男020-83男0471-94男020-5男0471-6男020-7男020-8男020-國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資金預(yù)算表（定額補(bǔ)助項(xiàng)目名稱：Hedgehog版本第41/231456728394567國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資金預(yù)算表（定額補(bǔ)助項(xiàng)目名稱：Hedgehog版本第41/23145672839456791011預(yù)算說(shuō)明本項(xiàng)目申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)80預(yù)算說(shuō)明本項(xiàng)目申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)8066.666713.3333（一）66.66671.：02.材料費(fèi)：41.6667材料四：RNA-pulldown，0.5萬(wàn)元/個(gè)，需6個(gè)，共計(jì)3材料五：MagnaRIPTMRNA-BindingProteinImmunoprecipitationKit：材料七：購(gòu)買普通shRNA0.3萬(wàn)元/份，需5份，共計(jì)1.5萬(wàn)元。材料九：SleepingBueaty試劑：1萬(wàn)元/份，需8份，共計(jì)8萬(wàn)元。材料十：LipofectamineTMRNAiMAX：0.4萬(wàn)元/份，需6份，共計(jì)2.4材料十二：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c裸鼠0.01萬(wàn)元/只，需100只，共計(jì)1萬(wàn)元。其他：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)費(fèi)用0.0003元/只/天，共100只×100天，共計(jì)3萬(wàn)元。檢測(cè)項(xiàng)目四：Deletionmapping，1萬(wàn)元/次，需5次，共計(jì)5差旅費(fèi)：1.5萬(wàn)元。（參加肝再生學(xué)術(shù)交流會(huì)議6人次，每人次0.25萬(wàn)元，共計(jì)1.5萬(wàn)元0，約1萬(wàn)元專家咨詢費(fèi)：0.5萬(wàn)元。（研究期間邀請(qǐng)專家咨詢，擬邀請(qǐng)5人次。專家咨詢費(fèi)1000元/天×1天×5人×1次=0.5萬(wàn)元11.：0（二）：13.3333版本第5（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容（4000-字1（研究國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容（4000-字1（研究國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析獻(xiàn)目錄肝再生是肝臟損傷后肝內(nèi)細(xì)胞增殖重建肝臟的過(guò)程。引起肝的損傷誘因是多方面的，包括肝臟的直接機(jī)械損傷，中毒、病毒侵以及各種肝臟疾病[1]。肝再生通過(guò)激活肝內(nèi)細(xì)胞（包括肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膽管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞等）增殖重建肝臟組織達(dá)到肝功能的恢復(fù)3]。因?yàn)楦卧偕c臨床治療緊密相關(guān)，對(duì)機(jī)理的深入研究，將有助于利用肝再生最終為臨床的治療服現(xiàn)有的對(duì)肝再生的認(rèn)識(shí)建立在部分肝切除模型，人們?cè)谶^(guò)去十年中對(duì)肝再生過(guò)程的機(jī)制進(jìn)行了深入研究5]。近期指出[6]，Hedgehog(Hh)信號(hào)通路激活參與了在小鼠70％部分（PH）后肝臟再生過(guò)程（公認(rèn)的成年人肝臟再生模型肝切除誘再生過(guò)程肝內(nèi)Hh配體表達(dá)增Hh信號(hào)通路的成激活，體現(xiàn)在他們本身的表達(dá)加強(qiáng)，表達(dá)后活動(dòng)加強(qiáng)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)提了信號(hào)通路的激可能對(duì)肝再生的發(fā)生和調(diào)控起主導(dǎo)作用也進(jìn)一步提示，對(duì) 信號(hào)通路的激活將有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)肝再生的控[8]，從而有助于肝再生臨床工作中的應(yīng)用。然而，利用部分肝切除型研究所獲得的結(jié)果得出的結(jié)論還沒(méi)有證明具有普遍意義。這是因引起肝再生的損傷誘因是多方面括肝臟的直接機(jī)械損傷版本第6病毒侵染以及各種肝臟疾病。在基礎(chǔ)研究中，針對(duì)肝損傷誘導(dǎo)肝再模擬的動(dòng)物病毒侵染以及各種肝臟疾病。在基礎(chǔ)研究中，針對(duì)肝損傷誘導(dǎo)肝再模擬的動(dòng)物模型有幾種類型部分肝切除模型只是其中的一種于研究肝切造成的肝損傷誘導(dǎo)再生的模型，是有局限性的。近期，應(yīng)有其他的肝再生研究模型的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了(Hh)號(hào)通路的激活在不同的研究模型誘發(fā)的肝再生中存在不同的激活因此(Hh)信號(hào)通路進(jìn)一步廣泛深入的研究，將獲得(Hh)更加全面的認(rèn)識(shí)，為臨床應(yīng)用打下良礎(chǔ)肝再生動(dòng)肝再生動(dòng)物模型的不同，對(duì)肝再生機(jī)制的研究有重要影響肝再生研究中所運(yùn)用的動(dòng)物模型主要為嚙齒類的大鼠和小鼠，根據(jù)發(fā)肝損傷的類型可劃分為三類第一類：手術(shù)誘導(dǎo)肝損傷模型。主要通過(guò)部分肝切除、門靜支結(jié)扎等方法誘導(dǎo)肝再生[10]。其中部分肝切除一直是肝再生主要的研究模型。該模型做為肝再生模型具有顯著的優(yōu)勢(shì)：一、容操作，容易標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果容易重復(fù)[11]；二、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖致，易于研究[9]；三、研究基礎(chǔ)深厚。但值得注意的是，該模型依有諸多不足：一、肝再生過(guò)程快速啟動(dòng)并快速完成，有些信號(hào)轉(zhuǎn)瞬逝，難以捕捉；二、理論上肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞僅需1.66次增殖即可完成生，而臨床上肝再生往往需要肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的連續(xù)大規(guī)模擴(kuò)增；三、臨床常見(jiàn)的肝再生情況不同，該模型無(wú)明顯肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷，且余肝臟組織結(jié)構(gòu)沒(méi)有破壞，免疫系統(tǒng)參與較少9]版本第7第二物誘導(dǎo)肝損傷主要CCl4D-galactosamineacetaminophen、等藥物引起肝損傷后誘導(dǎo)肝再生。藥第二物誘導(dǎo)肝損傷主要CCl4D-galactosamineacetaminophen、等藥物引起肝損傷后誘導(dǎo)肝再生。藥物誘導(dǎo)的再生被認(rèn)為與臨床中常見(jiàn)的肝再生情況更為接近[9類模型往往于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的大量壞性粒巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)清除死亡而剩余肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞連續(xù)大量增殖重建肝臟[12]。其肝再生過(guò)程更接疾病和中毒引起的肝損傷后肝再生過(guò)程。但這類模型非常依賴藥物劑量、給藥方式、動(dòng)物年齡、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、代謝酶活性等[13]。個(gè)異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響巨大，導(dǎo)致這類模型難以標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較難復(fù)第三類：基因工程誘導(dǎo)肝損傷模型。主要有延胡索酰乙酰乙解酶缺失（Fah-/-）引起的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷動(dòng)物，通過(guò)外源肝實(shí)質(zhì)細(xì)移植實(shí)現(xiàn)肝再生本項(xiàng)目采用的（Fah-/-I酪氨酸血癥模型[14]Fah基因缺失時(shí)，氨酸代謝通路的延胡索酰乙酰乙酸不能水解，使得有毒的代謝中間物延胡索酰乙酰乙酸和順丁烯二酸單酰乙酰乙酸在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中大積累，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡，從而引起肝衰竭。Fah-/-小鼠比I酪氨酸血癥患者有更嚴(yán)重的肝損傷，會(huì)導(dǎo)致小鼠出生后死亡。但治人I氨酸血癥NTBC可阻斷酪氨酸代謝通路。如小鼠喂食NTBC水，小鼠將正常存活[14]。一NTBC，F(xiàn)ah-/-將因肝衰竭死如果通過(guò)細(xì)胞移植方法將肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移植小鼠肝臟中，同時(shí)撤NTBC，外源肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞將再生并重建小結(jié)構(gòu)和功能[15]版本第8圖1.Fah-/-小鼠作為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移植后再生模型。A.F圖1.Fah-/-小鼠作為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移植后再生模型。A.Fah-/-小鼠酪氨酸代謝途徑因Fah基因缺失被阻斷。Maleylacetoacetate和Fumarylacetoacetate會(huì)引起肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷并死亡。而NTBC可阻斷酪氨酸代謝途徑，防止產(chǎn)生有毒代謝中間產(chǎn)物。B.Fah-/-小鼠依賴NTBC存活。撤NTBC將導(dǎo)致小鼠因肝衰竭死NTBC的生，并重建肝臟的結(jié)構(gòu)和功能Fah-/-小鼠模型是基于外源肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在肝再生機(jī)制的作用下整合到受體小鼠肝臟中再植實(shí)現(xiàn)重建肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。因?yàn)楦螌?shí)細(xì)胞Fah-/-小鼠中的再植集中反映肝再生中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的全貌，結(jié)合該模型更接近臨床病理情況的優(yōu)點(diǎn)，和便于對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)在再生中的定量分析的優(yōu)點(diǎn)，我們?cè)诒狙芯恐袑⒛軌蛞酝庠锤螌?shí)質(zhì)胞Fah-/-小鼠中的再植作為研究目標(biāo)，把研究集中細(xì)胞的活動(dòng)特點(diǎn)，以闡明通路促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞Fah-/-小鼠作為肝再生模型以下優(yōu)勢(shì)：一、易于操作，于標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果容易重復(fù)；二、與疾病引起的肝損傷情況類似，更版本第9近臨床；三、增殖的外源肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與受損的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞易于區(qū)分可通近臨床；三、增殖的外源肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與受損的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞易于區(qū)分可通過(guò)細(xì)胞移植攜帶其他基因或shRNA等研究工具，方便研究肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞會(huì)連續(xù)發(fā)生大規(guī)模的肝再生過(guò)程長(zhǎng)達(dá)數(shù)個(gè)星期易于捕捉肝再生不同階段的事件。之前在肝切模型中，人們就發(fā)現(xiàn)胞外基質(zhì)的降解與重建對(duì)肝再生有重要作用其調(diào)控過(guò)程非常迅速往往在幾分鐘內(nèi)就能完成調(diào)控，使得對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的研究十分困難而Fah-/-小鼠模型細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控過(guò)程長(zhǎng)達(dá)數(shù)天甚至幾個(gè)星期，得我們可以對(duì)其調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行深入研究[16]。Fah-/-小鼠世界上僅有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室建立了完整Fah-小鼠研究系統(tǒng)。人們對(duì)其肝再生的機(jī)制研究還比較少。我們實(shí)驗(yàn)室于申請(qǐng)人過(guò)去6年使用Fah-/-小鼠的研究經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)建立了完Fah-/-小鼠研究系統(tǒng)。我們準(zhǔn)備充分發(fā)揮我們的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行研Hh信號(hào)通路在肝切損傷誘導(dǎo)出的肝再生的現(xiàn)有Hedgehog基因1980先由Nuslein-VolhardC在對(duì)篩選能引起果蠅突變的基因時(shí)發(fā)現(xiàn)[17]。哺乳動(dòng)物中存在三個(gè)的同源基因：SonicHedgehog(SHH)、 Hedgehog(IHH)和Hedgehog(DHH)，分別編碼Shh、Ihh和DhhHh白通過(guò)修飾才能獲得完全功能Smoothened(Smo)及通路下游的類運(yùn)動(dòng)蛋白(Cos2)、絲氨白激酶(Fu)、Fu抑制劑(SuFu)、蛋白A(PKA)、Hedgehog用蛋白(Hhip),哺乳動(dòng)物中Gli1、Gli2、Gli3等多種蛋白。Ptch是次跨膜蛋白,在人2個(gè)同源基因：Ptch1和Ptch2結(jié)合;Smo7膜蛋G偶聯(lián)型受體同源,負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)信版本10傳導(dǎo)及靶基因的活Gli蛋白家族成員是較大的多功的轉(zhuǎn)錄因傳導(dǎo)及靶基因的活Gli蛋白家族成員是較大的多功的轉(zhuǎn)錄因PKA起負(fù)調(diào)控Hhip是僅存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)高度保守的Hh相互作用蛋白,作為抑制因子Hhip能夠Ptch的結(jié)合HhHh配體喪失Hh信號(hào)通路的功能[19肝再生過(guò)程是一個(gè)嚴(yán)格有序的過(guò)程。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖和增肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的有序構(gòu)建肝組織使得肝再生過(guò)程嚴(yán)格受控，明顯不同肝癌細(xì)胞在肝臟中成瘤生長(zhǎng)[2,20,21]。在肝再生的過(guò)程中肝非細(xì)胞參與調(diào)控了對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞調(diào)控[22]，最近的報(bào)道指出，成性肝損傷后出現(xiàn)刺猬（Hh）配體和發(fā)育形態(tài)發(fā)生因子的增加，這些子在胚胎發(fā)育過(guò)程中控制祖細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)各方面組織生長(zhǎng)[23]提示 信號(hào)通路也可能調(diào)節(jié)成年人肝臟再生。在小鼠肝切引起的再生模型中肝切除誘導(dǎo)肝細(xì)Hh配體增Hh信號(hào)通路。用定的 信號(hào)抑制劑干擾正常肝再生的幾個(gè)關(guān)鍵組件，顯著抑制了細(xì)胞反應(yīng)、基質(zhì)重塑、肝細(xì)胞膽管細(xì)胞增殖和肝體積恢復(fù)[24]臟再生的這些全面抑制作用顯著降低小鼠肝切除后的生存率。所以節(jié)肝臟發(fā)育的機(jī)制如 通路的激活，將有可能維持和促進(jìn)成人肝損傷后的肝再生，這是本課題申請(qǐng)的意義所在。為將來(lái)臨床肝再礙性疾?。òǜ鞣N原因的肝硬化、肝切除后肝功能不全/種肝炎導(dǎo)致肝衰竭治療提供試驗(yàn)在先期的研究中，應(yīng)用外源肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在Fah-/-小鼠模植作為研究目（見(jiàn)本課題申請(qǐng)研究基礎(chǔ)部分我們的發(fā)現(xiàn)版本11前期報(bào)道中對(duì)(Hh)信號(hào)通路激活在作用于促進(jìn)肝再作用，前期報(bào)道前期報(bào)道中對(duì)(Hh)信號(hào)通路激活在作用于促進(jìn)肝再作用，前期報(bào)道認(rèn)為Hh配體作為肌纖維母肝細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，刺激止期肝星狀細(xì)胞獲得肌纖維母細(xì)胞表型，并誘導(dǎo)未成熟膽管EMT[25]。因此，Hh通路的活化促進(jìn)慢性肝損傷的纖維化修復(fù)反應(yīng)不同于這個(gè)前期報(bào)道，我們研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，Hh通路激活能促進(jìn)肝臟細(xì)胞的生長(zhǎng)，有助于替換死亡的成熟肝細(xì)胞。我們的發(fā)現(xiàn)與最近的一篇報(bào)道的發(fā)現(xiàn)是吻合[23]3）Hh信號(hào)通路肝再生健康成人肝臟有巨大的再生能力。這使得人在接受70切除（PH）后數(shù)周內(nèi)恢復(fù)正常的肝功能和肝質(zhì)量。嚙齒動(dòng)物的肝再進(jìn)行得更迅速，PH后7至10天就能完成肝臟所以嚙齒動(dòng)物經(jīng)用來(lái)作為研究肝再生機(jī)制的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。研究表明PH后的初始48細(xì)胞DNA合成劇烈增加，伴隨（但高度顯著）肝細(xì)胞有絲分裂和肝臟量的增加，所以認(rèn)為PH后的肝再生很大程度上依賴于成熟肝細(xì)胞的加的復(fù)制28]。最近的研究已經(jīng)證明，Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)肝切除術(shù)后激活[7Hh體通常促進(jìn)祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，并出對(duì)人類和嚙齒類動(dòng)物的肝臟祖細(xì)胞有促進(jìn)生長(zhǎng)的功能，包括卵圓胞[29]。在胚胎發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Hh路的激活擴(kuò)增基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，通過(guò)保留現(xiàn)有間充質(zhì)細(xì)胞原始的、遷徙的表型和在幼稚的上細(xì)胞中促進(jìn)上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT版本12既往的研究沒(méi)有闡明Hh是如何釋放出來(lái)的。即是什么細(xì)胞在除的再既往的研究沒(méi)有闡明Hh是如何釋放出來(lái)的。即是什么細(xì)胞在除的再生過(guò)程中釋放了Hh在損傷后的肝否同樣是這些細(xì)胞我們所利用的Fah基因敲除的肝損傷模型與肝切除模型相比有程度和損傷的時(shí)間可控制的優(yōu)點(diǎn)，將利于我們研究操作后Hh釋放胞。Hh作用于肝再生中的靶細(xì)胞，前期研究發(fā)表的結(jié)果提示可能的細(xì)胞為星型細(xì)胞的前體我們將首先觀察在Fah損傷模型也是同樣的細(xì)胞，下一步我們將深入研究Hh是否直接做用于肝實(shí)質(zhì)胞上。這是因?yàn)镠h是刺激肝細(xì)胞數(shù)目的增多，有可能Hh直接作用實(shí)質(zhì)上發(fā)揮促進(jìn)實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖的作用。在肝再生過(guò)程中細(xì)胞與細(xì)胞相互作用激活調(diào)控肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的肝組織重建活動(dòng)，已知的Hh信號(hào)參與肝再生的調(diào)控機(jī)理認(rèn)識(shí)還沒(méi)有真正搞清楚，現(xiàn)有的研究存在兩最大的問(wèn)題：I，本領(lǐng)域長(zhǎng)期普遍認(rèn)為，在急性肝損傷引起的肝再生程中主要活動(dòng)是成熟的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的激活增值和組織構(gòu)建然不能排除誘導(dǎo)和激活和肝內(nèi)干細(xì)胞的分化增值，但肝內(nèi)干細(xì)胞的活參與為非主要活動(dòng)31]，而最新報(bào)道文章的觀點(diǎn)卻損傷引起的肝再生過(guò)程中星形細(xì)（HSC）干細(xì)胞被激活并分化為肝質(zhì)細(xì)胞是主要的33]。II，先前的文章研究所用的肝性肝損傷引起的肝再生對(duì)于另外兩類的肝再生模型中Hh的是否一尚待研究。為了研究這兩個(gè)問(wèn)題，我們?cè)诮诮⒘伺c內(nèi)蒙古大學(xué)欣教授的合作，并獲得了充實(shí)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為此基金的研究打了良好基礎(chǔ)版本13Michalopoulos,G.K.,Liverregeneration.JournalofCellularPhysiology,2007.213(2):p.Michalopoulos,G.K.,Liverregeneration.JournalofCellularPhysiology,2007.213(2):p.Michalopoulos,G.K.andM.C.DeFrances,Liverregeneration.Science,1997.276(5309):p.DeLeve,L.D.,Liversinusoidalendothelialcellsandliverregeneration.JClinInvest,123(5):p.1861-Kuramitsu,K.,etal.,Carbonmonoxideenhancesearlyliverregenerationinmiceafterhepatectomy.Hepatology,2011.53(6):p.2016-26.Ogasawara,T.,etal.,BeneficialeffectsofKampomedicineInchin-ko-toonliverfunctionandregenerationafterhepatectomyinrats.HepatolRes,2008.38(8):p.818-24.Ochoa,B.,etal.,Hedgehogsignalingiscriticalfornormalliverregenerationafterpartialhepatectomyinmice.Hepatology,2010.51(5):p.1712-23.Hanaoka,J.,etal.,SignificanceofsonichedgehogsignalingaftermassivehepatectomyinaOmenetti,A.,etal.,Hedgehogsignalingintheliver.JHepatol,2011.54(2):p.366-Palmes,D.andH.U.Spiegel,Animalmodelsofliverregeneration.Biomaterials,2004.25(9):p.Mortensen,K.E.andA.Revhaug,Liverregenerationinsurgicalanimalmodels-ahistoricalperspectiveandclinicalimplications.EurSurgRes,2011.46(1):p.1-18.Gonzales,E.,etal.,ATPreleaseafterpartialhepatectomyregulatesliverregenerationintherat.JHepatol,2010.52(1):p.54-62.Michalopoulos,G.K.,LiverRegenerationafterPartialHepatectomyCriticalAnalysisofMechanisticDilemmas.AmericanJournalofPathology,2010.176(1):p.2-13.Diehl,A.M.,Nutrition,Hormones,Metabolism,andLiver-Regeneration.SeminarsinLiverDisease,1991.11(4):p.315-320.Grompe,M.,etal.,PharmacologicalCorrectionofNeonatalLethalHepatic-DysfunctioninaMurineModelofHereditaryTyrosinemiaType-I.NatureGenetics,1995.10(4):p.453-460.Huang,P.,etal.,Inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.Nature,2011.475(7356):p.386-9.Mars,W.M.,etal.,Immediateearlydetectionofurokinasereceptorafterpartialhepatectomyanditsimplicationsforinitiationofliverregeneration.Hepatology,1995.21(6):p.1695-701.Jimenez-Sanchez,M.,etal.,TheHedgehogsignallingpathwayregulatesautophagy.NatCommun,2012.3:p.1200.Carpenter,R.L.andH.W.Lo,HedgehogpathwayandGLI1isoformsinhumancancer.DiscovMed,2012.13(69):p.105-13.Eichenmuller,M.,etal.,BlockingthehedgehogpathwayinhibitshepatoblastomaHepatology,2009.49(2):p.482-Duncan,A.W.,C.Dorrell,andM.Grompe,StemCellsandLiver14Gastroenterology,2009.137(2):p.466-Mishra,L.,etal.,Liverstemcellsandhepatocellularcarcinoma.Hepatology,2009.49(1):p.Yang,L.,etal.,Sonichedgehogisanautocrineviabilityfactorformyofibroblastichepaticstellatecells.JHepatol,2008.48(1):p.98-106.Jung,Y.,etal.,Accumulationofhedgehog-responsiveprogenitorsparallelsalcoholicliverdiseaseseverityinmiceandhumans.Gastroenterology,2009.137(2):p.466-Mishra,L.,etal.,Liverstemcellsandhepatocellularcarcinoma.Hepatology,2009.49(1):p.Yang,L.,etal.,Sonichedgehogisanautocrineviabilityfactorformyofibroblastichepaticstellatecells.JHepatol,2008.48(1):p.98-106.Jung,Y.,etal.,Accumulationofhedgehog-responsiveprogenitorsparallelsalcoholicliverdiseaseseverityinmiceandhumans.Gastroenterology,2008.134(5):p.1532-43.Michelotti,G.A.,etal.,Smoothenedisamasterregulatorofadultliverrepair.JClinInvest,2013.123(6):p.2380-94.Tsukamoto,H.,etal.,Morphogensandhepaticstellatecellfateregulationinchronicliverdisease.JGastroenterolHepatol,2012.27Suppl2:p.94-8.myofibroblastictransformationofrathepaticcellsincultureandcirrhosis.AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2009.297(6):p.G1093-106.Nejak-Bowen,K.N.,etal.,Gliotoxin-inducedchangesinratliverregenerationafterpartialhepatectomy.LiverInt,2013.33(7):p.1044-55.Suarez-Cuenca,J.A.,etal.,Partialhepatectomy-inducedregenerationacceleratesreversionofliverfibrosisinvolvingparticipationofhepaticstellatecells.ExpBiolMed(Maywood),2008.233(7):p.827-39.Chan,I.S.,etal.,Alcoholactivatesthehedgehogpathwayandinducesrelatedprocarcinogenicprocessesinthealcohol-preferringratmodelofhepatocarcinogenesis.AlcoholClinExpRes,2014.38(3):p.787-800.Sawitza,I.,etal.,Thenicheofstellatecellswithinratliver.Hepatology,2009.50(5):p.Kordes,C.,I.Sawitza,andD.Haussinger,Hepaticandpancreaticstellatecellsinfocus.BiolChem,2009.390(10):p.1003-12.Kordes,C.,etal.,Hepaticstellatecellscontributetoprogenitorcellsandliverregeneration.JClinInvest,2014.124(12):p.5503-15.Mogler,C.,etal.,Hepaticstellatecell-expressedendosialinbalancesfibrogenesisandhepatocyteproliferationduringliverdamage.EMBOMolMed,2015.7(3):p.332-8.2．項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題（此分為重點(diǎn)闡述內(nèi)容（1）Fah-/-小鼠肝再植過(guò)程中信號(hào)激活的表現(xiàn)雖然Hh信號(hào)通路的激活在部分肝切誘導(dǎo)的肝再生動(dòng)物模型得現(xiàn)，F(xiàn)ah-／－小鼠做為肝損傷的模型早已用于肝再生的研究，但對(duì)在再生過(guò)程中Hh信號(hào)的激活和作用方式至今沒(méi)有研究。主要原因在版本15前期的肝再生的研究集中于對(duì)肝切除模型中的實(shí)驗(yàn)觀察。如果充分識(shí)Hh信號(hào)激前期的肝再生的研究集中于對(duì)肝切除模型中的實(shí)驗(yàn)觀察。如果充分識(shí)Hh信號(hào)激活與各種肝再生的關(guān)系，尤其是更加接近于臨床相關(guān)的再生，有必要廣泛觀察在各個(gè)現(xiàn)有的肝再生模型中是否普遍存在，進(jìn)一步去追蹤在不同的肝再生模型中是否有特殊性。在我們的長(zhǎng)期作積累中，我們已經(jīng)較全面地掌握了Fah-小鼠肝再生的基本規(guī)律其在近期的研究結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路成部分在Fah-的肝再生過(guò)程中有基因表達(dá)水平的改變，并且這發(fā)現(xiàn)的組成部分在基因水平改變與部分肝切除后的肝再生過(guò)程中的同在對(duì)這些成員的分我們將利用我們實(shí)驗(yàn)室專長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)手段行觀察分析。首先所得到的結(jié)果，是一個(gè)較長(zhǎng)程中的時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果，因此，我們的第一步工作將分析每一種發(fā)現(xiàn)因的Fah－／－小鼠肝再植過(guò)程中的時(shí)相變化，以期獲得每關(guān)基因的變化過(guò)程，這個(gè)研究工作將應(yīng)用Q-PCR來(lái)實(shí)的工作，將是對(duì)某些參與激活的成員在蛋白水平上的時(shí)相變化進(jìn)行量分析，這個(gè)分析研究的目的在于，轉(zhuǎn)錄水平的改變與最終在蛋白平的結(jié)果有不一致的存在可能。在獲得了對(duì)所發(fā)現(xiàn)的每一種基因的細(xì)變化過(guò)程的認(rèn)識(shí)后，下一步的工作就是綜合分析所有變化的基因相互關(guān)系，這是因信號(hào)通路中包含多個(gè)成員參與，對(duì)于Hh信號(hào)通路活動(dòng)的作用，有可能存在Hh信號(hào)通路活動(dòng)內(nèi)部的相互用。我們?cè)诟伟┭芯恐械淖钚掳l(fā)現(xiàn)也證實(shí)這種存在進(jìn)miR-1249的轉(zhuǎn)錄來(lái)下調(diào)PTCH1成正反饋循環(huán)促進(jìn)肝癌版本16YB,ChenJetal,待發(fā)表。Fah－／－小鼠肝再植過(guò)程中，多個(gè)信號(hào)通路成員在YB,ChenJetal,待發(fā)表。Fah－／－小鼠肝再植過(guò)程中，多個(gè)信號(hào)通路成員在基因表達(dá)水平上的改變，已經(jīng)反映有可能存在這種細(xì)的內(nèi)部成員相互制約的調(diào)控機(jī)在分析了具體基因水平在時(shí)間過(guò)程中的變化規(guī)律，我們將實(shí)具體基因在空間上的相互關(guān)系。通過(guò)免疫組化和免疫熒光的方法，用針對(duì)某一具體成員的抗體，我們將有把已知有作用的成員，包括活作用和抑制作用，定位到具體的肝內(nèi)特定細(xì)胞比如肝星狀細(xì)胞，管細(xì)胞竇內(nèi)皮細(xì)將有利于認(rèn)識(shí)Hh信號(hào)通路成員對(duì)目標(biāo)的具體作用方式。例如，在我們前期的研究中，我們已發(fā)現(xiàn)移植細(xì)的再植簇群（repopulatingnodule）與炎癥細(xì)胞簇在取自再植過(guò)程S4，Hh互作用將得以另外，我們將信號(hào)通路的過(guò)程中，根據(jù)最新的研究啟示，進(jìn)一步應(yīng)用我們前期建立Fah－／－小鼠肝再植過(guò)程于篩的樣品庫(kù)，進(jìn)一步尋找新的相關(guān)基因，包括Hh通路中未被發(fā)現(xiàn)的新成員，和影響信號(hào)通路的其他通路的成（2Hh通路對(duì)肝再生中肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)Fah-/-小鼠肝再植過(guò)程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了信號(hào)通路的為了進(jìn)一步了信號(hào)通路的激活是否影響及如何影響肝再生的程，包括對(duì)實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的既往的小鼠肝切除模型給予Hh通路的抑制劑后發(fā)現(xiàn)通路下游Gli表達(dá)降低，肝再生能力減弱。首先我們將在Fah-/-小鼠肝版本17型中比較給予Hh信號(hào)通路抑制Smo，Hhip，Gli基因的表達(dá)否與肝切除模型中比較給予Hh信號(hào)通路抑制Smo，Hhip，Gli基因的表達(dá)否與肝切除模型的有無(wú)然后分析給藥28Hh成員基因的變及在不同的時(shí)間過(guò)程中定量地分析肝再植的程度再綜合分析這些基因的變化與肝再植程度的關(guān)系。目前已有特異性對(duì)Hh信號(hào)通路HhSmo、Gli不同基因的抑制劑，我們將分應(yīng)用后研信號(hào)通路在經(jīng)典的激活途徑之外是否存在內(nèi)部其他相互作用。另外，通過(guò)免疫組化和免疫熒光的方法，研究Hh的抑制對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和/或肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的分析有無(wú)存在肝非質(zhì)細(xì)胞如星狀細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞自分泌或旁分泌信號(hào)因子途（3）提高Hh信號(hào)途徑中關(guān)鍵因子的表達(dá)肝再生中肝內(nèi)細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞的提高Hh信號(hào)通路中關(guān)鍵因子如Smo的表達(dá)，上調(diào)Hh信號(hào)通路活性，研究其對(duì)肝再生的影響。首先我們將利SleepingBeaty統(tǒng)攜帶shRNA等手段，驗(yàn)證Hh信號(hào)通路活性能否上調(diào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基轉(zhuǎn)入方法提高Hh通路的可行性認(rèn)識(shí)。在這個(gè)基礎(chǔ)上研Hh的成員對(duì)移植細(xì)胞肝再生的調(diào)控關(guān)系。這樣我們就了解了在亞急性損傷的情況下Hh信號(hào)通路的活性對(duì)移植細(xì)胞肝再生的作用。果這是可行的們將進(jìn)一步探討在健康肝的情況Hh路的活性對(duì)肝再生有無(wú)影響及其安全性的研究。這將有助于將來(lái)利調(diào)控信號(hào)通路成員來(lái)實(shí)現(xiàn)在臨床的初步應(yīng)用2）研究版本18（1）總體目研究在肝再生過(guò)程中信號(hào)通路的激活是否遍存在。而對(duì)于不同類型肝（1）總體目研究在肝再生過(guò)程中信號(hào)通路的激活是否遍存在。而對(duì)于不同類型肝損傷引起的不同肝再生過(guò)程是否存在特的調(diào)控方各類肝損傷引起的再生中Hh通路是被激活的此通路是否對(duì)臨床治療有指導(dǎo)意義和臨床應(yīng)用（2）具①各種類型的肝再生過(guò)程中的激活是否廣泛存在，并是否針對(duì)特定肝再生的情況，具有不同的活動(dòng)②確定肝再生中 配體的誘導(dǎo)釋放和某些通路成員基因的表是如何被誘導(dǎo)激活的③確定肝再生中，Hh以及Hh通路下游的靶細(xì)胞的類型，將來(lái)潛在在肝損傷修復(fù)的作用獲得理論依據(jù)和潛在Hh④確定通路激活產(chǎn)生的作用是否為肝再生過(guò)程中無(wú)可替⑤檢驗(yàn)通路的特異激活能促進(jìn)肝究論文1篇，5分以上的研究論文2擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)（1）肝再生是否有普遍激活，針對(duì)特殊的肝導(dǎo)的肝再生有無(wú)存在顯著的特異（2）是什么原因引起配體的釋放，是由什么細(xì)胞（3）再生中Hh配體作用的靶細(xì)胞，其具體方式如何（4）Hh激活是否為肝再生必要（5）對(duì)激活的專一調(diào)控能否促進(jìn)肝再生中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞版本19實(shí)質(zhì)細(xì)胞3．?dāng)M采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技術(shù)路驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說(shuō)明 研究實(shí)質(zhì)細(xì)胞3．?dāng)M采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技術(shù)路驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說(shuō)明 研究Hh信號(hào)激活的表現(xiàn)形式。首先，在先前結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們將全面分析Hh信號(hào)激Fah-/-小鼠中移植肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的再植過(guò)程中的表現(xiàn)形式。對(duì)移植肝質(zhì)細(xì)胞的再植過(guò)程中的Hh信號(hào)激活表現(xiàn)形式的全面分析，有助于獲具體Hh信號(hào)通路成員活動(dòng)特點(diǎn)，和它們?cè)谡麄€(gè)過(guò)程中的具體變化，下一步的研究提供線索實(shí)現(xiàn)最終能夠調(diào)控Hh信號(hào)激活的位點(diǎn)和程度在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移植入Fah-/-小鼠的肝臟后，每隔1周取再植小鼠肝臟組織，共8周，采用qRT-PCR和blot/免疫組化分別從水平和蛋白水平比較Hh信號(hào)通路在不同的時(shí)相的表達(dá)和激活情況將用到的PCR引物如下primerSequence(5'-TmProductsize2018s通過(guò)免疫熒光染色分析上述基因在肝再生進(jìn)程中不同時(shí)間把上述基18s通過(guò)免疫熒光染色分析上述基因在肝再生進(jìn)程中不同時(shí)間把上述基因表達(dá)定位于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和/或非實(shí)質(zhì)細(xì)胞而表達(dá)的非實(shí)細(xì)胞又具體定位于肝星狀細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)所獲取的最新信息進(jìn)一步篩選未知Hh信號(hào)通路其他成員和與Hh信號(hào)通路相聯(lián)系的其他信號(hào)途徑的可能與。提取上述各階段肝臟組織的RNA，通分析基因譜。在基因表達(dá)的時(shí)項(xiàng)分析中，以傳統(tǒng)肝切模型中各相關(guān)階段的基表達(dá)譜作為研究的對(duì)照處理。根據(jù)基因表達(dá)譜篩選肝再生關(guān)鍵階段信號(hào)通路其他成員如類運(yùn)動(dòng)蛋白(Cos2酸/蘇氨酸蛋白激酶(FuFu抑制劑(SuFu)、蛋白激酶A(PKA)的可 Hh抑制劑對(duì)Fah-/-小鼠肝再植效率的影實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用Hh抑制劑的目的在于證明已發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路的激Fah-/-小鼠肝再植效率的影響，以及影響的程度。由于Fah再植的程度在研究中能夠定量分析，因此，此項(xiàng)指標(biāo)能體現(xiàn)Hh路激活對(duì)促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖的程度。同時(shí)，預(yù)期結(jié)果也將能夠說(shuō)是否Hh信號(hào)通路激活的作用一旦被阻斷，是否能被其他未知的促進(jìn)生機(jī)理所在研究實(shí)驗(yàn)的實(shí)施中在再植的第2周開(kāi)始應(yīng)用Hh配體的抑制劑(GDC-版本21至第8Hh信號(hào)通路中各成員在mRNA水平和蛋白水平的抑制情至第8Hh信號(hào)通路中各成員在mRNA水平和蛋白水平的抑制情定量分析這個(gè)過(guò)程中移植細(xì)胞再植簇群是增長(zhǎng)是否受到抑與Hh信號(hào)通路中成員受抑制的時(shí)序關(guān)系c.用相同的方法分析應(yīng)用Smoothened(Smo)的口服拮CyclopamineGli1及Gli2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的抑制劑GANT61的情況下Hh信號(hào)路中各成員和移植細(xì)胞再植簇群的改變 提高Hh信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)對(duì)肝再植的影此部分的研究將成為探討將來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)控Hh信號(hào)通路的活性所嘗試。我們認(rèn)真分析和不同Hh信號(hào)通路的成員后，選定了一下過(guò)基因轉(zhuǎn)入的方式，實(shí)現(xiàn)這些成員基因的高表達(dá)。通過(guò)此部分的研實(shí)驗(yàn)，將實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)入方法提高Hh信號(hào)通路活性的可行性的認(rèn)識(shí)對(duì)具體的Hh信號(hào)通路成員基因轉(zhuǎn)入實(shí)現(xiàn)初步的認(rèn)識(shí)。此結(jié)果探討將來(lái)利用Hh信號(hào)通路成員基因轉(zhuǎn)入實(shí)現(xiàn)初步在臨床應(yīng)用的可a.采用SleepingBeaty轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，將Smo基因的shRNA導(dǎo)入Fah鼠肝利用定量PCR和免疫熒光染色研究Hh信號(hào)通路中各成員的達(dá)是否增強(qiáng)，再分析比較其是否能促進(jìn)移植細(xì)胞再植簇群的給導(dǎo)入Smo基因的shRNA的Fah-/-小鼠從第2周開(kāi)始給予NTBC以停肝損傷，通過(guò)定量PCR、免疫熒光染色、免疫組化染色分析Hh信號(hào)的激活對(duì)健康肝的肝再植的2）關(guān)鍵本項(xiàng)目所涉及的研究方法主版本22（1）Fah-/-小鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移Fah-/-小鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞術(shù)是申請(qǐng)人長(zhǎng)期使用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。主（1）Fah-/-小鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移Fah-/-小鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞術(shù)是申請(qǐng)人長(zhǎng)期使用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。主要操作是將分離好的肝實(shí)質(zhì)細(xì)分散在PBS液中，通過(guò)脾臟注射將肝實(shí)質(zhì)細(xì)同時(shí)撤除水喂外源肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞將在Fah-/-小鼠肝臟中再生重建整個(gè)（2）SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子系轉(zhuǎn)座酶可將兩個(gè)轉(zhuǎn)座子間的序列轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組當(dāng)中。們?cè)O(shè)計(jì)的Beauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的兩個(gè)轉(zhuǎn)座子間，包括Fah基和shRNA的表達(dá)序列（圖1。當(dāng)將該Beauty轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒通尾靜脈快速注射到Fah-/-小鼠體內(nèi)后，部分質(zhì)?？蛇M(jìn)入肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)座酶，并將轉(zhuǎn)座子間的序列插到基因組當(dāng)中。當(dāng)給Fah撤除NTBC水后，插入該序列的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)Fah基因而存表達(dá)Fah的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞將會(huì)死亡。表達(dá)Fah基因的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞從而大增殖重建小鼠3）可行性分在本項(xiàng)目中，影響其可行性的主要因（1）Fah-/-小鼠肝再生實(shí)驗(yàn)室已大量繁育出該小鼠用實(shí)驗(yàn)。申請(qǐng)人過(guò)去多年的研究中一直使用該小鼠模型，十分熟悉相的如肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移植、尾靜脈注射等版本23（2）SleepingBeauty統(tǒng)。該轉(zhuǎn)座系統(tǒng)早已應(yīng)Fah-/-小的肝再生研究當(dāng)中，且已發(fā)表多篇論文。（2）SleepingBeauty統(tǒng)。該轉(zhuǎn)座系統(tǒng)早已應(yīng)Fah-/-小的肝再生研究當(dāng)中，且已發(fā)表多篇論文。申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室已獲得該轉(zhuǎn)系統(tǒng)，并已開(kāi)始應(yīng)用除上述實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)外，其余的實(shí)驗(yàn)均為常規(guī)的生化、分子、遺驗(yàn)。申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室均已建立相關(guān)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。申請(qǐng)人認(rèn)為本項(xiàng)目已備了順利開(kāi)展和圓滿完成的4．首次系統(tǒng)性驗(yàn)信號(hào)通路激活在亞急性肝損傷肝過(guò)程中的5．年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果（包括擬組織的重活動(dòng)、國(guó)際合作與交流計(jì)劃等1）年度2016.1-確定Fah-/-小鼠中移植肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的再植肝再生過(guò)程中的分析信號(hào)激活的表現(xiàn)2017.1-抑制和激活Hh號(hào)通路對(duì)肝再生中肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞的影響2018.1-2018.12:確定信號(hào)通路調(diào)控肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖2019.1-2019.12:在其他肝損傷模型中驗(yàn)證上述機(jī)制理數(shù)文章并投稿2）預(yù)期（1確定Fah-/-小鼠肝再生過(guò)程中Hh信號(hào)激活的表現(xiàn)形式和時(shí)空（2）確定Hh信號(hào)激活對(duì)促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增（二）版本241．工作基礎(chǔ)（與本項(xiàng)目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究成績(jī)我1．工作基礎(chǔ)（與本項(xiàng)目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究成績(jī)我們通過(guò)分析肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移植Fah擴(kuò)增過(guò)程，確認(rèn)該肝再生模型中，外源肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增主發(fā)生在細(xì)胞移植后2-5周（圖S1AKi67染色說(shuō)明該有外源肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞（Fah性細(xì)胞）發(fā)生增殖（圖S1B。由于實(shí)質(zhì)細(xì)胞易于實(shí)驗(yàn)操作，F(xiàn)ah-/-小鼠肝損傷模型十分適于研究肝實(shí)細(xì)胞在肝再生過(guò)程中的圖 Fah-/-小鼠肝再生過(guò)程2）我們的前期研究工Fah-/-小鼠移植細(xì)第1周至第8周的存活情況以看到在第5開(kāi)始出現(xiàn)明顯的增殖并且在第6周達(dá)到平臺(tái)期，在第8周的時(shí)候趨于穩(wěn)定（圖S2版本25Fah-/-小鼠移植細(xì)胞后再植簇群的Fah-/-小鼠移植細(xì)胞后再植簇群的增殖情3）我們microarray了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞Fah2周70%肝切12小時(shí)（即肝切模型中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞起始增殖的時(shí)間）肝臟基因表達(dá)譜。我們發(fā)現(xiàn)，與肝切模型相比，肝Fah肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞起始增殖時(shí)，Hh信號(hào)通路中的Ptch著上調(diào)12（S3A而作為抑制因子的Hhip顯著下調(diào)5倍（S3B未顯示沒(méi)有明顯變化的版本26圖S3Fah-/-小鼠和肝切除模型肝再生圖S3Fah-/-小鼠和肝切除模型肝再生過(guò)程的基因表達(dá)4我們已發(fā)現(xiàn)Fah-/-小鼠移植細(xì)胞的再植（repopulating與炎癥細(xì)胞簇在取自再植過(guò)程的肝組織免疫組化切片染色分析中信號(hào)通路作用下的細(xì)胞與細(xì)胞相互作用（圖S4圖S4細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，Hh配體的釋放可能包括來(lái)自與再殖區(qū)相接觸的炎細(xì)胞5小鼠的基因治療（S5A。將含有Fah光素cDNASBFah-/-小鼠的肝細(xì)胞，獲得了Fah基因（S5，B）和熒光素基（S5，C）的穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)非侵入性活體體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)，版本27時(shí)定量觀察了表達(dá)蛋白的肝細(xì)胞在Fah-/-小鼠肝臟中的再殖情因此，我們時(shí)定量觀察了表達(dá)蛋白的肝細(xì)胞在Fah-/-小鼠肝臟中的再殖情因此，我們已經(jīng)具備了系統(tǒng)傳遞外源基和利用非侵入性體外熒光成像技術(shù)評(píng)價(jià)肝臟再殖的圖S5課題合作者實(shí)驗(yàn)室曾進(jìn)行Fah-/-小鼠肝臟中非病毒性轉(zhuǎn)基因載體的檢測(cè)6）課題合作者實(shí)驗(yàn)室比較了誘導(dǎo)酪氨酸血癥和不誘導(dǎo)酪氨酸血癥但分肝切Fah-/-小鼠間肝細(xì)胞移植后的肝臟再殖情況。移植型肝細(xì)胞，停藥后Fah-/-小鼠的肝臟再殖可達(dá)到95%以上（圖6，細(xì)胞移植后的時(shí)間效應(yīng)。在肝臟再殖過(guò)程因?yàn)檠Y，其內(nèi)在的肝細(xì)胞逐漸死亡，供體肝細(xì)胞明顯增3000倍。另一方面，給與NTBC藥物的Fah-/-小鼠是健康的大部肝切除，小鼠肝臟再殖效率卻不超過(guò)1%氨酸血癥，內(nèi)源性肝細(xì)胞與供體肝細(xì)胞相比更具生長(zhǎng)版本28圖 誘導(dǎo)酪氨酸血癥和不誘導(dǎo)酪氨酸血癥但部分肝圖 誘導(dǎo)酪氨酸血癥和不誘導(dǎo)酪氨酸血癥但部分肝切Fah-/-小鼠間肝細(xì)胞移后肝臟再植的比2．工作條件（包括已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條； 也是動(dòng)物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科、國(guó)家“實(shí)版本2942503．承擔(dān)科研項(xiàng)目情況（申請(qǐng)人和項(xiàng)目組主要參與者正在承擔(dān)項(xiàng)目包括國(guó)家42503．承擔(dān)科研項(xiàng)目情況（申請(qǐng)人和項(xiàng)目組主要參與者正在承擔(dān)項(xiàng)目包括國(guó)家自然科學(xué)基金的項(xiàng)項(xiàng)目的名稱和編號(hào)經(jīng)費(fèi)來(lái)源、起止年月、與本項(xiàng)目的關(guān)系及負(fù)責(zé)的內(nèi)容等王欣正在承擔(dān)的基金1、轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Foxa2在調(diào)控內(nèi)胚層細(xì)胞肝向分化中的相互作用。（31271469，902利用新型基因敲除和細(xì)胞轉(zhuǎn)移技術(shù)建立人源化肝臟豬的模型（31271042，804．完成國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目情況（對(duì)申請(qǐng)人負(fù)責(zé)的前一個(gè)科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱及批準(zhǔn)號(hào)）完成情況、后續(xù)研究進(jìn)展及與申請(qǐng)項(xiàng)目的關(guān)系加以詳細(xì)說(shuō)明。另附該已結(jié)題項(xiàng)目研究工作總結(jié)摘（限字）和相關(guān)成果的詳細(xì)目錄無(wú)（三）購(gòu)置單項(xiàng)經(jīng)費(fèi)萬(wàn)元以上固定資產(chǎn)及設(shè)備等，須逐項(xiàng)說(shuō)明與項(xiàng)的直接相關(guān)性及必（四）無(wú)版本30教育經(jīng)歷（按時(shí)間倒排序---教育經(jīng)歷（按時(shí)間倒排序---工作經(jīng)歷（科研與學(xué)術(shù)工作經(jīng)歷，按時(shí)間倒序排序授；1992/7—1995/9：B2012101；2012.9-2014.9版本31版本32王簡(jiǎn)歷王欣，男，1963年7月18日生，理學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師現(xiàn)在任東莞明珠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司客座教授，內(nèi)王簡(jiǎn)歷王欣，男，1963年7月18日生，理學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師現(xiàn)在任東莞明珠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司客座教授，內(nèi)蒙古大學(xué)教授，美國(guó)兩公司的創(chuàng)辦人。主要從事肝細(xì)胞生物學(xué)、肝臟和胰腺干細(xì)胞以及全能性干的肝向分化、人源化肝臟嵌合體動(dòng)物等研究，近年來(lái)取得了一系列突出的成績(jī)。項(xiàng)目的共同設(shè)計(jì)教育經(jīng)歷（從大學(xué)本科開(kāi)始，按時(shí)間倒排序年——2003年，美國(guó)Oregon大學(xué)，醫(yī)學(xué)院年——1998年，美國(guó)紐約州立大學(xué)，攻讀博士年——1990北京醫(yī)科大學(xué)，生物與遺傳系，攻讀年——1985年，山東大學(xué)，生物系，攻讀本科學(xué)工作經(jīng)歷（科研與學(xué)術(shù)工作經(jīng)歷，按時(shí)間倒排序2011年至今，東莞松山湖明珠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，客座教2006年——2011年中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所，中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主年——2008年，明尼蘇達(dá)大學(xué)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和病理學(xué)系，干細(xì)胞研所任助理教年——1998年，美國(guó)紐約州立大學(xué)，藥物與藥理學(xué)院，生物化學(xué)的理學(xué)系，研究生研究1990年——1992年，北京醫(yī)科大學(xué)，生物與遺傳系1987年——1990年，北京醫(yī)科大學(xué)，生物與遺傳系版本331、發(fā)現(xiàn)了造血干細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為有代謝功能的肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞（AmericanJournalof（Nature20031、發(fā)現(xiàn)了造血干細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為有代謝功能的肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞（American