北大醫(yī)學(xué)研究生課程-分子免疫學(xué)-程序性細(xì)胞死亡-陳玉英教授

陳英玉

CellLifeCellDeath“Lifecannotexistwithoutdeath〞withoutcelldeath,an80-year-oldpersonwouldhave2tonsofbonemarrowandlymphnodes,andagut16kmlong(Nature,412:23,2001)

ApoptosisNecrosis-like

AutophagyParaptosisOncosisPragrammedCellDeathPCDMitoticcatastropheentosisAnoikisSectionⅠApoptosis

(Type-ⅠPragrammedCellDeath)ApoptosisandDiseases1090–131=959(cells)研究歷程ProcessofApoptosisApoptosisTRAIL/TRAIL-RFasL/FasTNFR1/TNF-

ChemicalsUV,stressprocaspase3Activecaspase3ERpathwayRegulationofApoptosis特點(diǎn)多樣性耦聯(lián)性統(tǒng)一性

多途徑CaspaseActivationinapoptosisCaspase種類：18種1細(xì)胞因子的加工和成熟相關(guān)：Caspase1,4,5,11,13,12,14,15,162啟動性Caspase:Caspase2,8,9,10,183效應(yīng)性Caspase:Caspase3,6,7，17Caspase的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Caspases具有相似的氨基酸序列、三維結(jié)構(gòu)和底物特異性，都以無活性的酶原形式(procaspase)表達(dá)。Caspase酶原〔pro-Caspase〕分子含有三個結(jié)構(gòu)域：N端結(jié)構(gòu)域、大亞基〔～20KD〕和小亞基〔～10KD〕。酶原經(jīng)結(jié)構(gòu)域間的肽鏈水解，別離出大、小亞基并結(jié)合成二聚體，再與另一個二聚體形成四聚體，獲得Caspase蛋白水解酶活性。酶原的水解位點(diǎn)是Asp，且本身就是Caspase的靶序列。Schematicrepresentationofthehumancaspasesdepictingtheirstructureandproposedfunction酶活性位點(diǎn)ProdomainLargesubunitSmallsubunitAspAspProcaspase3〔～20kD〕〔～10kD〕活化Caspase3多變性CaspaseSubstratesMitochondriaandApoptosis

線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用Bcl-2familyproteinsinapoptosisBcl-2家族蛋白種類：30余種1抗凋亡蛋白：包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1、Boo和Ced-9等2促凋亡蛋白：包括Bax、Bak、Bcl-Xs、Bcl-rambo等3BH3-only促凋亡蛋白，包括Bid、Bad、Bim、Bik/Nbk、Hrk/DP5、BNIP3、EGL-1、Noxa、Bmf、PUMA/Bbc3等Bcl-2家族的大局部抗凋亡蛋白一般作為膜整合蛋白插入到線粒體外膜上，而促凋亡蛋白那么以非活性的形式分布于胞質(zhì)中或細(xì)胞質(zhì)骨架上。當(dāng)細(xì)胞受到死亡信號刺激后，促凋亡蛋白便從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)位到細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)上，尤其是線粒體外膜上，引起細(xì)胞器功能喪失和各種促凋亡因子包括線粒體細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子〔AIF〕、Smac/Diablo等的釋放，經(jīng)凋亡信號的逐步放大，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

StructureofBcl-2familyProteinBH4BH2BH1BH3BH3BH2BH1BH3BH3結(jié)構(gòu)域是促凋亡蛋白必需的致死結(jié)構(gòu)域，也是Bcl-2蛋白家族成員之間相互作用及促凋亡活性極為重要的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)。一、形態(tài)學(xué)檢測光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡，電鏡二、磷脂酰絲氨酸外翻分析〔AnnexinV法〕FCM分析，熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡，三、Caspase活性的檢測WesternBlot,熒光分光光度計(jì)分析Caspase3、8、9的活性分析四、細(xì)胞周期的檢測FCM分析亞二倍體細(xì)胞以及各周期變化五、DNA片斷化檢測TUNEL實(shí)驗(yàn)，DNAladder六、線粒體功能的檢測膜電位，細(xì)胞色素C釋放,BCL-2家族蛋白檢測等七、其它細(xì)胞凋亡的檢測方法〔主要介紹基因中心的研究成果〕一細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡3電子顯微鏡4流式細(xì)胞計(jì)分析1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡〔1〕未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落?！?〕染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍，凋亡晚期核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。1光學(xué)顯微鏡MockTMEM166BaxTMEM166inducescelldeath—293T，36hoursWangL,etal.APOPTOSIS,2007,12:1489–1502Chromosomecondensation,cellbodyshrink2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPIDAPI用于固定滲透化的細(xì)胞HO33342用于活細(xì)胞的染色TMEM166inducescellapoptosispcDBTMEM166Bax

DAPIstaining—293T結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮,邊緣化。細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。3電子顯微鏡觀察pcDBBaxTMEM166 HeLacellsapoptosisinducedbyTMEM166andBaxoverexpression電子顯微鏡觀察4Morphology---ShrinkageofCellsFACSanalysisJurkatcellapoptosisinducedbyTRAIL凋亡細(xì)胞位置左移ApoptoticcellsUntreatedTRAILtreated二、磷脂酰絲氨酸〔PS〕外翻分析〔AnnexinV法〕

磷脂酰絲氨酸〔Phosphatidylserine,PS〕正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡時，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素〔FITC、R-PE〕或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。apoptosisExternalizationofPSCa+Ca+Ca+Ca+PSFACSanalysisFITC-Annexin-V-FluorescenceMCF-7cellapoptosisinducedbyTRAIL-170

------dosedependentmannerPIFluorescenceTMEM166inducesapoptosisFACSHeLacellsapoptosisinducedbyTMEM166andBaxoverexpressionOverexpressionofPDCD5promotes293cellapoptosisinducedbyserumwithdrawal

PDCD5是凋亡的促進(jìn)分子mockPDCD57.5ug/mlPDCD515ug/mlPDCD530ug/mlIDR56ng/mlIDR56ng/ml+PDCD57.5ug/mlIDR56ng/ml+PDCD515ug/mlIDR56ng/ml+PDCD530ug/mlRecombinanthumanPDCD5couldpromotetheapoptosisofK562cellsinducedbyIdarubicinfor24hours

7.29%7.88%7.94%22.57%25.11%29.87%37.86%7.91%ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI三、Caspase活性的檢測

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用。其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原〔32KD〕的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活性形式的Caspase-3由兩個大亞基〔17KD〕和兩個小亞基〔12KD〕組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物(如PARP、lamin等〕。方法1.Westernblot分析2.熒光分光光度計(jì)分析

3.caspase抑制劑的應(yīng)用Westernblotanalysisofcaspase-3,PARPduringTRAILinducedJurkatcellapoptosisActivationofCaspase-3CleavageofPARPResultsofWesternBlot熒光分光光度計(jì)或光譜分析

原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)或pNA(p—Nitroaniline,p-硝酸酯〕偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC或Ac-DEVD-pNA。在共價偶聯(lián)時，AMC或pNA不能被激發(fā)熒光或顯色，短肽被水解后釋放AMC或pNA，自由的AMC或pNA才能被激發(fā)發(fā)射熒光或顯色。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小以及pNA顯色的深度，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。Ac-DEVD-AMC的敏感性高于Ac-DEVD-pNA酶活性位點(diǎn)ProdomainLargesubunitSmallsubunitAspAspCaspase3酶原〔～20kD〕〔～10kD〕活化Caspase3Ac-DEVD-AMCAMCAc-DEVD-pNApNACaspaseactivityAssayInductionofapoptosis

Proteaseactivation

CelllysatepreparationCaspase-3Caspase-8Caspase-9DEVD-AMCorpNAIETD-AMCorpNALEHD-AMCorpNAAMCorpNAAMCorpNAAMCorpNAPOLARSTARorELISAReader405caspase-3activityinHeLacellstreated

withTMEM166andmeasuredbyPOLARstar3CASPASE抑制劑的應(yīng)用

鑒定凋亡誘導(dǎo)基因或促凋亡基因是caspase依賴？caspase非依賴？兩者都有？

z-VAD-fmkcaspaseinhibitorz-DEVD-fmkcaspase3inhibitorz-IETD-fmkcaspase8inhibitorz-LEHD-fmkcaspase9inhibitor

Z-ATAD-fmkcaspase12inhibitor

z-VAD-fmkpartiallyblockedtheIM9/Bcl-2cellapoptosisinducedbygossypolPan-caspaseinhibitorInhibitioneffectsofz-VAD-fmkonJurkatcellapoptosisinducedbyTRAIL170.Jurkatcellswerepre-incubatedwith50

mofz-VAD-fmkfor1h,andtreatedwithsTRAIL-170indifferenttime,thenstainedwithFITC-AnnexinV+PIandanalyzedbyFlowcytometry.Resultsshownthatz-VAD-fmkcaninhibitJurkatcellapoptosisinducedbysTRAIL-170.inhibitionTMEM166inducesapoptosisz-VAD-fmkpartiallyblockedtheHeLacellapoptosisinducedbyTMEM166四、細(xì)胞周期分析

流式細(xì)胞計(jì)分析

0h12h24h36h48hAnalysisofcellcycleinIM9cellstreatedwithetopside.Cellsweretreatedwithetopside(20

M)fordifferenttimeandthenfixedandstainedwithPI.SampleswereanalyzedbyFlowcytometry.Percentagesofsub-G1areshownDNAFragmentation---Hypodiploid五DNA片斷化檢測

1瓊脂糖電泳(DNAladder)2TUNEL法方法

在細(xì)胞核內(nèi)，DNA與組蛋白結(jié)合形成核小體，然后形成松散的染色質(zhì)，超螺旋后形成致密的染色體。在細(xì)胞凋亡后期，活化的核酸酶以核小體為單位剪切染色體，形成許多長度為200bp倍數(shù)的DNA片斷，在凝膠電泳中顯示為DNA梯度。是細(xì)胞凋亡后期確實(shí)切證據(jù)和檢測指標(biāo)。1DNAladder的檢測GelelectrophoresisanalysisofDNAfromTF-1cellsafterGM-CSFdeprivationNote:lane1,2,3,4,5,6,7:Representativesof0,4,8,16,24,36,48hsafterGM-CSFdeprivation,respectively細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3‘-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶〔TdT〕的作用下，將dUTP和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。。TUNEL方法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中別離的細(xì)胞的形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。2原位TUNEL方法〔Terminal-deoxynucleotidyltransferasemediated-dUTPNickEndLabeling〕脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記DNAFragmentation---insituTUNEL重組PDCD5促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡ChenC,etalApoptosis,2021,15:805–813六、線粒體介導(dǎo)凋亡的檢測

1mt的檢測2ROS的檢測3WesternBlot細(xì)胞色素C的轉(zhuǎn)位、BCL-2家族蛋白的變化〔BCL-2,BCL-XL,BAX,BAK,PUMA,tBid等)1線粒體膜勢能〔mt〕的檢測

線粒體熒光染料：Rhodamine123、DiOC6〔3〕、JC-1、等對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。本卷須知1.始終保持平衡染液中pH值的一致性，因?yàn)閜H值的變化將影響膜電位。2.與染料到達(dá)平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與局部染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。3.染色后的細(xì)胞檢測前一定放在冰浴中!!OverexpressionofTMEM166causesthedecreaseofmitochondriamembranepotentialinHeLacellline活性氧對細(xì)胞凋亡的調(diào)控是通過線粒體膜透過性轉(zhuǎn)運(yùn)孔而起作用。氧化應(yīng)激可影響線粒體PTP的開放與關(guān)閉，線粒體ROS產(chǎn)生增多可以引起線粒體PTP開放。PTP的開放會引起線粒體膜電位下降，線粒體腫脹和細(xì)胞色素C釋放，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡。

2細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測試劑CM-H2DCFDA,Mw=535.8 溶劑:無水乙醇或DMSO儲存液：0.5mM原理

CM-H2DCFDA進(jìn)入細(xì)胞后，被酯酶切割，從而被trapping在細(xì)胞中。此染料本身是不發(fā)光的，在細(xì)胞中被自由基氧化成可發(fā)光的物質(zhì)，因此，可用此染料測定細(xì)胞內(nèi)的自由基水平〔詳見MolecularProbes網(wǎng)頁或指南〕。FCM分析細(xì)胞內(nèi)ROS的水平WesternBlot

細(xì)胞色素C的轉(zhuǎn)位

BCL-2家族蛋白的變化

BCL-2,BCL-XL表達(dá)下調(diào)？

BAX表達(dá)上調(diào)？轉(zhuǎn)位？

BidtBid

BAK,PUMA等表達(dá)上調(diào)？WesternblotanalyzethereleaseofcytochromecfromMitochondriainSW1353cellsinducedbyrhPDCD5proteinandcisplatinChenC,etalApoptosis,2021,15:805–813rhPDCD5proteinincreasescisplatin-inducedthereleaseofcytochromecinSW1353cellsrhPDCD5proteinincreasescisplatin-inducedpro-apoptosismoleculeexpression,decreasespro-survivalmoleculeexpressioninSW1353cells

ChenC,etalApoptosis,2021,15:805–813六其他死亡受體〔Fas，TNFR等〕凋亡抑制蛋白的檢測〔XIAP等〕信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的蛋白磷酸化或去磷酸化的檢測〔磷酸化抗體，如p38,ERK等的檢測〕細(xì)胞內(nèi)Ca流〔Fluo-3〕的檢測幾種相對定量的實(shí)驗(yàn)方法

MTT,CCK-8或H3摻入細(xì)胞生長曲線

克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成實(shí)驗(yàn)MockBAXCaspase非依賴的PCD

AautophagyParaptosisOncosisMitoticcatastropheOthers?

SectionⅡAutophagy

(Type-ⅡPragrammedCellDeath)〔一〕概述1962年，Ashford和Porten發(fā)現(xiàn)在饑餓或激素等因素的刺激下，細(xì)胞中存在“Self－eating〞現(xiàn)象，并將其命名為“Autophagy〞。目前至少鑒定了33種參與酵母autophagy的特異性自噬基因。其命名從最初稱的APG，AUT和CVT，統(tǒng)一命名為自噬基因ATG(AuTophaGy-specificgene,2003年).哺乳動物自噬基因至少鑒定了18種，其命名與酵母有個別差異酵母的ATG8在哺乳動物稱為LC3，酵母的ATG6在哺乳動物那么稱為Beclin-1。

全新的國際性雜志<<Autophagy>>已在2005年4月份出版。第一次國際性會議于同年在意大利召開。Autophagy的研究是生命科學(xué)領(lǐng)域的一個新的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞自噬是生命科學(xué)的前沿方向Medline檢索至2021年9月12日有6059篇文獻(xiàn)。ATGgenesinYeastMammalian

ATGautophagygnensATG17(FIP200)ATG18(WIPI-1)ATG101〔二〕Autophagyprocess〔三〕Autophagy的分類1大自噬〔Macroautophagy〕2微自噬〔Microautophagy〕3分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediatedautophagy，CMA)CMA降解途徑在去除蛋白質(zhì)時有選擇性。CMA的底物都是可溶性的蛋白分子，含有一個HSC70識別的5肽基序－KFERQ－〔四〕自噬體形成的主要蛋白分子1

哺乳動物細(xì)胞兩個泛素樣蛋白系統(tǒng)〔1〕ATG12-ATG5系統(tǒng)，由ATG3、ATG5、ATG7、ATG10和ATG12、ATG16L組成。〔2〕由ATG4、LC3〔Microtubule-associatedprotein1lightchain3,MAP1-LC3〕、ATG3、ATG7蛋白組成。2ClassⅢPI3K、Beclin-1、ATG14形成復(fù)合物參與自噬體的形成。3其它TMEM166,TMEM74，TM9SF1

LC3ATG4TMEM166TMEM74TM9SF1ATG9-ATG13-ATG101-ATG17ATG14〔五〕regulationofautophagy1mTOR〔MammalianTargetofRapamycin〕信號途徑TOR激酶在自噬的發(fā)生過程中起抑制作用，是自噬的負(fù)性調(diào)控分子，并發(fā)揮“門衛(wèi)〔gatekeeper〕〞作用。2ClassⅠPI3K/AKT(PKB)途徑ClassⅠPI3K酶是自噬的負(fù)性調(diào)節(jié)分子3ClassIIIPI3Kinase:是自噬的正調(diào)節(jié)分子4結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1〔TSC1〕和TSC2蛋白位于ClassⅠPI3K/PKB途徑的下游，抑制TOR激酶的活性，是自噬的正向調(diào)節(jié)分子。PTEN磷酸酶也是自噬的正向調(diào)節(jié)分子，可解除ClassⅠPI3K/PKB途徑對自噬的抑制。5RAS-RAF-1-MEK-ERK1/26Bcl-2:自噬的負(fù)性調(diào)節(jié)分子7P53：正或負(fù)調(diào)節(jié)自噬其它：胰島素可抑制自噬，而胰高血糖素促進(jìn)之

Autophagyregulation〔六〕RolesofAutophagy細(xì)胞的新陳代謝涉及蛋白質(zhì)的合成與降解以及細(xì)胞器的更新，而細(xì)胞對這種合成與降解的精細(xì)調(diào)節(jié)，對于維持細(xì)胞的自身穩(wěn)定有著重要意義。1自噬是細(xì)胞在營養(yǎng)缺陷情況下的一種適應(yīng)性反響，其降解產(chǎn)物氨基酸等為細(xì)胞的生物合成提供了原料。2自噬作為細(xì)胞保持穩(wěn)定狀態(tài)的管家機(jī)制，對長壽命蛋白的調(diào)控、過氧化物體和線粒體的更新以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大小的改變起重要作用。3自噬還與某些組織的特異性能有關(guān)，如它參與外表活性劑的生物合成，參與紅細(xì)胞成熟過程中線粒體等細(xì)胞器與核糖體的去除等。1Autophagyincellmetabolism2AutophagyandApoptosis1.自噬為凋亡所需,自噬通常先于凋亡，進(jìn)而啟動凋亡，對于凋亡而言，自噬通常是不可缺少的。TNF-可誘導(dǎo)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，且自噬早于核片段化的出現(xiàn)，并且在凋亡的任何形態(tài)學(xué)信號出現(xiàn)之前就能觀察到自噬體，說明自噬的發(fā)生早于凋亡。2.自噬抑制凋亡保護(hù)細(xì)胞各種因素能夠引起線粒體PTP開放，釋放細(xì)胞色素C等促凋亡因子。在此情況下，細(xì)胞可啟動自噬來消除受損的線粒體，從而限制了這些去極化了的線粒體釋放凋亡因子。但當(dāng)自噬能力缺乏或損傷嚴(yán)重時，線粒體釋放的促凋亡因子將激活凋亡程序。3.自噬與凋亡共同促進(jìn)細(xì)胞死亡細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡在一些環(huán)境下可能相互轉(zhuǎn)化自噬和凋亡存在很大局部的重疊，它們在同種組織中可同時發(fā)生，也可在相互誘導(dǎo)下先后出現(xiàn)。Aschematicmodelillustratingthecrosstalkbetweenapoptosis(red)andautophagy(green)inmammalsshowingthemajorplayersofeachpathwaythathavebeenshowntoalsodirectlyinfluencetheotherone.Someproteinsnegativelycontrollingoneorbothpathwaysarealsoincluded(Blue〕AutophagyandApoptosisTMEM166inducestypeIandtypeIIPCDinHeLacellspcDBBaxTMEM166TMEM166TMEM166TMEM1663AutophagyinCancer自噬對腫瘤的雙重作用1自噬對腫瘤增殖的抑制作用研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞系中自噬作用的水平低于正常細(xì)胞?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有些抗腫瘤藥物的作用機(jī)制之一，就是激發(fā)腫瘤細(xì)胞原本低水平的自噬效應(yīng)，尤其是凋亡缺陷的腫瘤細(xì)胞。如Rapamycin.腫瘤生長的早期階段自噬增強(qiáng)，抑制腫瘤。腫瘤進(jìn)入開展階段后基因變異積累，使包括Beclin在內(nèi)的眾多抑癌基因失活，自噬活力降低。2自噬對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用自噬具有保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用。腫瘤生長的后期，在腫瘤中央缺血區(qū)域癌細(xì)胞處于營養(yǎng)缺乏和低氧的環(huán)境，自噬增強(qiáng)。其可通過降解胞內(nèi)蛋白質(zhì)及細(xì)胞器為腫瘤細(xì)胞的生長提供營養(yǎng)及能量，以利于腫瘤細(xì)胞在低血管化的環(huán)境中生長。還可以保護(hù)癌細(xì)胞免受藥物的攻擊。

自噬在不同腫瘤或同一腫瘤的不同階段發(fā)揮不同的作用Yueetal.,PNAS,2003

ChemotherapeuticagentsthatinduceautophagyDrugsTargetidentifiedImatinibBcr-AblTemsirolimusmTORC1EverolimusmTORC1PerhexilinemTORC1NiclosamidemTORC1AmiodaronemTORC1RottlerinmTORC1CurcuminmTORC1EB1089(vitaminD)CamKKArsenictrioxideBNIP3/Beclin1AICARAMPKMetforminAMPKPerifosineAktGSK69O693AktTriciribineAktCurrentOpinioninCellBiology2021,22:246–2514Autophagyinneurodegenerativediseases帕金森病〔PD〕家族性的PD發(fā)生與患者synuclein蛋白發(fā)生突變有關(guān)。亨廷頓氏舞蹈病〔HD〕HD的病理變化與亨廷頓蛋白〔Huntingtin〕發(fā)生突變以及突變蛋白在細(xì)胞內(nèi)的過度蓄積有關(guān)。自噬好似一把雙刃劍，一方面，自噬作用參與異常蛋白質(zhì)的降解，防止神經(jīng)元內(nèi)異常蛋白質(zhì)的蓄積，另一方面，自噬作用過度會損傷細(xì)胞器，如造成線粒體功能障礙，從而引起細(xì)胞死亡，過度的自噬作用可能參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程。

細(xì)胞自噬參與維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能Komatsuetal.,Nature,20065AutophagyinImmunity

IRG,immunityrelatedGTPases;PAMP,pathogenassociatedmolecularpatterns;PRR,patternrecognitionreceptors;TLR,Toll-likereceptorsAutophagyinMHCclassIIantigenprocessingTh1andTh2cytokinesactivateandinhibitautophagyNedjicetal.,Nature,2021〔七〕AutophagyDetection一〕形態(tài)學(xué)方法1電子顯微鏡：檢測autophagosomes2Monodansylcadaverine(MDC)染色二〕Autophagy的特異標(biāo)志物檢測1LC3-II含量增多,LC3-II/LC3-I比例的升高:westernblot2內(nèi)源性斑點(diǎn)狀LC3增多：