基因工程課件

D基因工程的支撐技術(shù)

基因工程的基本原理C基因工程的基本原理B基因的分子生物學(xué)A重組DNA技術(shù)的理論基礎(chǔ)A重組DNA技術(shù)的理論基礎(chǔ)2基因工程的基本原理19世紀(jì)中孟德爾

豌豆雜交試驗(yàn)

遺傳因數(shù)

經(jīng)典遺傳學(xué)20世紀(jì)初摩爾根

果蠅雜交實(shí)驗(yàn)

基因

基因?qū)W1944年艾弗瑞

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

遺傳物質(zhì)DNA1973年伯格-傑克森-考恩-鮑耶

DNA分子體外拼接分子遺傳學(xué)1953年沃森-克瑞克

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

分子生物學(xué)基因工程B基因的分子生物學(xué)2基因工程的基本原理C基因工程的基本原理2基因工程的基本原理提高外源基因的劑量——分子遺傳學(xué)原理篩選修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如：?jiǎn)?dòng)子、

增強(qiáng)子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等——分子生物學(xué)原理

修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件，如：SD序

基因工程菌（微型生物反應(yīng)器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)——生化工程學(xué)原理

——分子生物學(xué)原理

D基因工程的支撐技術(shù)2基因工程的基本原理核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點(diǎn)突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)

基因工程的基本條件C用於基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞B用於基因克隆的載體A用於核酸操作的工具酶A用於核酸操作的工具酶3基因工程的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，並切割DNA雙鏈主要存在於原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵細(xì)菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因數(shù)ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識(shí)別序列TGAN8TGCT旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處識(shí)別序列內(nèi)或附近距識(shí)別序列下游隨機(jī)性切割特異性切割24-26bp處限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可採(cǎi)取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然後補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然後更換緩衝液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、乾燥限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩衝液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象

EcoRI在正常條件下識(shí)別並切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過(guò)5%（v/v）時(shí)，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量DNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬於分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬於分子間的連接，因此後者反應(yīng)速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大於粘性末端的連接）

加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl），最終濃度150-200mMDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）缺口前移標(biāo)記法大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Nicktranslation製備32P標(biāo)記的探針DNaseIDNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙去氧末端終止法測(cè)定DNA序列DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3‘-OH端外切在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘DNA聚合酶依賴於RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為範(fàn)本聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNADNA聚合酶依賴於RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’

DNA3’核酸酶單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’核酸酶雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘端外切核酸酶雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特異性地從5‘端外切3’5’3’5’核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來(lái)自稻穀麯黴菌（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最適pH範(fàn)圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA雜交S1EcoRI核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶S1核酸酶的基本特性：來(lái)自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA突變EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化AC核酸修飾酶末端去氧核苷醯轉(zhuǎn)移酶（TdT）TdT的基本特性：來(lái)自小牛胸腺不需要範(fàn)本的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘TdT的基本特性：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3‘

p5‘

5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

AAAAAAAAAAA核酸修飾酶鹼性磷酸單酯酶來(lái)自小牛胸腺的鹼性磷酸單酯酶（CIP）來(lái)自大腸桿菌的鹼性磷酸單酯酶（BAP）5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON核酸修飾酶T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘用於探針的末端同位素標(biāo)記：B用於基因克隆的載體3基因工程的基本條件質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特徵載體的功能及特徵載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供複製能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體的功能及特徵載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的複製位點(diǎn)或整合位點(diǎn)質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特徵質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立於寄主染色體而自主複製、並被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見於原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒DNA的分子量範(fàn)圍：1-300kb質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特徵質(zhì)粒的自主複製性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA複製系統(tǒng)進(jìn)行自主複製質(zhì)粒DNA上的複製子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)係根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱笱}製類型：嚴(yán)緊型複製控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid鬆弛型複製控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特徵質(zhì)粒的自主複製性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA複製啟動(dòng)控制控制複製引物與範(fàn)本的結(jié)合oriE.coliColE1

plasmid複製方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特徵質(zhì)粒的自主複製性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA複製啟動(dòng)控制控制複製起始因數(shù)與複製起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特徵質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似複製子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在於一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的複製子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的複製子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的複製子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特徵質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似複製子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在複製時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同複製子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在複製時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干複製週期和細(xì)胞分裂週期後仍能共處?kù)锻患?xì)胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以後的細(xì)胞分裂週期中更具優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特徵質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類：接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其他成員非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由bom和mob基因決定質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特徵攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由於分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青黴素抗性標(biāo)記基因Apr質(zhì)粒質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來(lái)自pSC101拷貝數(shù)小於10

表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測(cè)序質(zhì)粒含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便於外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對(duì)兩種不同受體的複製子便於基因克隆表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報(bào)告基因便於啟動(dòng)子等元件的克隆篩選質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體鬆弛型複製pBR322：氯黴素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用於基因克隆質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用於基因克隆和測(cè)序裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’用於外源基因的高效表達(dá)注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法製備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質(zhì)粒DNA純度高、週期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便沸水浴法

質(zhì)粒DNA純度、操作週期介於氯化銫法和堿溶法之間質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法：

用含有EDTA的緩衝液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過(guò)夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉澱cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化堿溶法：

用含有EDTA的緩衝液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

加高濃度的醋酸鉀溶液，沉澱染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉澱水相質(zhì)粒DNA用無(wú)DNase的RNase去除殘餘的RNA

cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的緩衝液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁沸水浴40秒鐘離心，用無(wú)菌牙籤挑去沉澱物乙醇或異丙醇沉澱質(zhì)粒DNA噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然後或自主複製繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主複製繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因l噬菌體生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

感染週期E.coli吸附LamB受體注入複製包裝裂解噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

感染週期體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝包裝範(fàn)圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌後，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，並不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所啟動(dòng)，而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決於宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處?kù)度芫鸂顟B(tài)，或處?kù)度芫鸂顟B(tài)DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大於2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是複製和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長(zhǎng)度10kb（51–26）載體長(zhǎng)度26kb插入片段最大裝載長(zhǎng)度25kb（36–26）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：刪除重複的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利於重組操作，必須刪除至1-2個(gè)同時(shí)，為了便於各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要採(cǎi)用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌迴圈的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞後，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌迴圈，形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株後，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長(zhǎng)抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，並形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用於體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合後，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染後，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基於安全而設(shè)計(jì)的噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)

用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒

密度已達(dá)1013-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解

超速離心，沉澱噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉澱l(shuí)-DNA

噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大於質(zhì)粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便

l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)

外源基因噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)

噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

感染週期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的構(gòu)建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡(jiǎn)便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易於辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb噬菌體或病毒DNA與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病

毒基因組DNA。動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類：?jiǎn)捂淒NA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我複製時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，

考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長(zhǎng)度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由於考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒?？妓官|(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒複製子的特殊類型的載體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載範(fàn)圍為31-45kb考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，並高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小範(fàn)圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主複製重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、複製子以及質(zhì)粒複製子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，並高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主複製重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易通過(guò)克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pUC118/119pUC118pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119pUC19+M13間隔區(qū)IG500個(gè)拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13輔助噬菌體DNA考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pBluescript體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動(dòng)子PT3和PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄提取出來(lái)的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄人造染色體載體

人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。將細(xì)菌接合因數(shù)或酵母菌染色體上的複製區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上後，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的複製並遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）人造染色體載體細(xì)菌人造染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因數(shù)F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量範(fàn)圍在50-300

kb之間各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝pBACs主要適用於：克隆大型基因簇（genecluster）結(jié)構(gòu)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù)人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件：

酵母染色體的端粒序列

酵母人造染色體的構(gòu)建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的複製子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的複製子

大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC載體的裝載量為350-400kb人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）酵母人造染色體的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉(zhuǎn)化酵母菌重組酵母染色體C用於基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞3基因工程的基本條件各種基因工程受體的特性實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件限制性缺陷型外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重組整合缺陷型用於基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA-）具有較高的轉(zhuǎn)化效率具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型感染寄生缺陷型防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生化武器除外

各種基因工程受體的特性大腸桿菌遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，重組子穩(wěn)定適用於外源DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的構(gòu)建，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌產(chǎn)結(jié)構(gòu)複雜、種類繁多的內(nèi)毒素各種基因工程受體的特性枯草桿菌遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，不產(chǎn)內(nèi)毒素適用於原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備各種基因工程受體的特性鏈黴菌抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對(duì)操作簡(jiǎn)便，不產(chǎn)內(nèi)毒素主要用於抗生素生產(chǎn)菌株的改良遺傳不穩(wěn)定，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢各種基因工程受體的特性酵母菌具有真核生物的特徵，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定適用於外源DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高各種基因工程受體的特性昆蟲細(xì)胞（家蠶）具有真核生物的特徵，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對(duì)較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定適用於真核生物基因的高效表達(dá)

DNA重組操作系統(tǒng)欠完善各種基因工程受體的特性哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO）

與人的親緣關(guān)係近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)適用於哺乳類動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢各種基因工程受體的特性植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉）

農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易於分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單且成本低廉，具有光合作用適用於高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良遺傳操作繁瑣實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體大腸桿菌用於接受質(zhì)粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms）

用於接受l-DNA：LE392、ED8654

酵母菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO畢赤酵母啤酒酵母

基因工程的操作過(guò)程C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）ADNA的體外重組（切、接）4基因工程的操作過(guò)程切接轉(zhuǎn)增檢ADNA的體外重組（切與接）4基因工程的操作過(guò)程同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接不同粘性末端的連接粘性末端的更換人工粘性末端的連接重組率同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT不同粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC人工粘性末端的連接5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火B(yǎng)amHIBamHIEcoRIBamHI人工粘性末端的連接3‘突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI人工粘性末端的連接平頭末端C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加熱GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT粘性末端的更換BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow補(bǔ)平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRIGGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker重組率重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡(jiǎn)化DNA重組的後續(xù)操作。重組率提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO鹼性磷酸單酯酶鹼性磷酸單酯酶重組率提高重組率的方法加裝同聚尾末端：

CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowB重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）4基因工程的操作過(guò)程轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用於革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，後者經(jīng)熱脈衝發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的製備：100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體

用10ml冰冷的10mM

CaCl2溶液懸浮菌體，離心用1ml冰冷的75mM

CaCl2溶液懸浮菌體冰浴放置12-24小時(shí)，備用收集菌體轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100ml感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)於50ng載體的重組冰浴放置半小時(shí)在42℃保溫2分鐘（熱脈衝）快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘DNA連接液，混勻加入1ml新鮮培養(yǎng)基，於37℃培養(yǎng)1小時(shí)（擴(kuò)增）塗在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈黴菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常採(cǎi)用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁後的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子

酵母菌、黴菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈黴菌為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)