遺傳育種學課件：轉(zhuǎn)基因與生物安全性

轉(zhuǎn)基因與生物安全性轉(zhuǎn)基因與生物安全性第一節(jié) 概述第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理與方法第三節(jié)

外源基因整合、表達與遺傳第四節(jié) 轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動物的安全性第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展1982年，美Richard

D.

Palmiter等首次將大鼠生長激素（GH）基因?qū)胄∈笫芫阎?，獲得了個體比大鼠大1倍的轉(zhuǎn)基因“超級鼠”，此后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得以飛速發(fā)展。第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因通常是指在DNA操作過程中整合到動、植物受體細胞染色體上的外源基因。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為了能夠使外源基因在動、植物體內(nèi)穩(wěn)定展現(xiàn)出相應的生物學表型，必須采用轉(zhuǎn)基因的重組子構(gòu)建技術(shù)、重組分子導入動植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化技術(shù)、轉(zhuǎn)基因在受體細胞染色體上的穩(wěn)定整合及可控表達技術(shù)，這些技術(shù)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水產(chǎn)動物育種上的應用1984年朱作言等將小鼠重金屬螯合蛋白基因啟動子與調(diào)控序列和人生長激素基因的重組DNA注射到魚受精卵原核內(nèi)，培育出生長速度快的轉(zhuǎn)基因魚，證明了外源基因可在受體魚內(nèi)整合、表達、促生長，并通過性腺傳遞給子代，建立了世界上首例轉(zhuǎn)基因魚模型。第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水產(chǎn)動物育種上的應用快速育種傳統(tǒng)的品種選育需經(jīng)過多代反復選種交配才能育成優(yōu)良品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可能在很短時間內(nèi)超越自然界億萬年生物進化歷程，創(chuàng)造自然界原來沒有的品種或品系；改良養(yǎng)殖性能加快受體生長、提高餌料利用率及抗逆性等。轉(zhuǎn)基因魚生長速度可提高11%～30%，即

“超級魚”

。第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水產(chǎn)動物育種上的應用生產(chǎn)醫(yī)藥生物制品利用海水養(yǎng)殖生物生產(chǎn)基因工程口服藥物和疫苗，既能利用海洋生物量大、生產(chǎn)成本低的特點，又能避免表達后提取、純化的復雜性（攜帶人胰島素的轉(zhuǎn)基因魚以提供胰島素）；轉(zhuǎn)基因魚的育性控制不育的轉(zhuǎn)基因魚或雌核發(fā)育轉(zhuǎn)基因魚，是解決轉(zhuǎn)基因魚進入天然水域后對同類或可交配的近親種類的遺傳背景產(chǎn)生影響和干擾的好辦法第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理與方法外源基因的表達和檢測外源基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞轉(zhuǎn)基因的主要技術(shù)外源基因的構(gòu)建第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理與方法一、外源基因的構(gòu)建外源基因啟動子目的基因轉(zhuǎn)錄終止信號(一)、啟動子病毒基因啟動子: 猴空泡病毒啟動子（SV40）和禽肉瘤病毒啟動子（RSV）高等動物啟動子和增強子：如小鼠金屬硫蛋白基因啟動子（mMT）魚類基因啟動子：

如β肌動蛋白（β-actin）基因啟動子、抗凍蛋白啟動子（AFP）、鯉金屬硫蛋白基因啟動子(二)、目的基因目的基因生長激素(GH)基因增加抗逆性的基因抗凍蛋白(AFP)基因抗病性基因珠蛋白基因報告基因(二)、目的基因生長激素（GH）基因魚類轉(zhuǎn)基因研究的第一個熱點：①

獲得生長快、產(chǎn)量高的“超級魚”；②

對各種動物和人的生長激素及其基因序列都已研究清楚，并且用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了許多含mMT啟動子和生長激素基因的質(zhì)粒，為各種動物轉(zhuǎn)基因研究和實踐準備了現(xiàn)成的材料；③

很多實驗都證明哺乳類和魚類的生長激素注射到魚體后，不僅能產(chǎn)生明顯的促生長作用，而且還能提高某些魚類對水體鹽度的適應力和飼料轉(zhuǎn)換系數(shù)。(二)、目的基因生長激素（GH）基因第一代轉(zhuǎn)基因魚：哺乳類或家畜的生長激素基因遠源基因存在著在受體魚細胞中的表達調(diào)控與生物學效應以及轉(zhuǎn)基因魚消費安全等問題第二代轉(zhuǎn)基因魚：“全魚”基因、“自源基因”

(autotransgenic)除安全性外，“全魚”結(jié)構(gòu)還可提高轉(zhuǎn)移基因的表達水平(二)、目的基因轉(zhuǎn)生長激素（GH）基因?qū)嵗鼶u（1992

）用美洲大綿鳚啟動子opAFP和大鱗大麻哈魚GH基因構(gòu)成的融合基因轉(zhuǎn)移到大西洋鮭受精卵中，獲得轉(zhuǎn)基因魚個體的體重比對照組平均要大3.8倍，標志著第二代轉(zhuǎn)基因魚的誕生；最戲劇性的轉(zhuǎn)生長激素基因“超魚”來自Devlin

等(1994,Nature

371)

的報道,結(jié)果表明轉(zhuǎn)生長激素基因魚平均體重比對照平均體重高11

倍,

最大個體體重比對照最大個體體重大37

倍。(二)、目的基因轉(zhuǎn)生長激素（GH）基因?qū)嵗琪V:

Robert

H.Devlin,

2001,Nature(二)、目的基因抗凍蛋白(AFP)基因魚類轉(zhuǎn)基因研究的第二個熱點：抗凍蛋白（anti-freeze

proteins,

AFP）具有降低胞內(nèi)溶液凝固點的作用，存在于美洲黃蓋鰈等寒冷水域的魚體內(nèi)；把AFP基因轉(zhuǎn)移到缺乏該基因的魚（各種熱帶經(jīng)濟魚類如羅非魚等）中，以提高這些魚類的抗寒能力，從而擴大這些魚類的養(yǎng)殖地域及節(jié)省越冬期間的能量消耗，為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供新的品質(zhì)優(yōu)良的品種。(二)、目的基因抗凍蛋白(AFP)基因目前已從美洲擬鰈、黃蓋鰈、瓦氏雅羅魚等魚類中分離并克隆出AFP基因。轉(zhuǎn)抗凍蛋白基因金魚：紐芬蘭大洋條鱈AFP基因注入金魚受精卵中；轉(zhuǎn)抗凍蛋白基因鯽魚：美洲大綿鳚AFP基因轉(zhuǎn)入鯽魚(二)、目的基因抗病性基因抗微生物成分基因如轉(zhuǎn)昆蟲抗菌肽、溶菌酶等用于轉(zhuǎn)基因研究；轉(zhuǎn)抗菌肽Cecropin

B基因的斑點叉尾鮰、斑馬魚與對照魚相比均顯示具有較強的抗病原菌的能力；轉(zhuǎn)雞溶菌酶基因的斑馬魚F2的溶菌活力是對照魚的1.75倍(二)、目的基因報告基因（reporter

gene）所謂報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因CAT，熒光素酶基因luc

，綠色熒光蛋白GFP基因(二)、目的基因報告基因（reporter

gene）因為報告基因的表達易于量化和定位，主要用來研究外源基因在受體水產(chǎn)動物，尤其是在模式水產(chǎn)動物中的整合和表達，對外源基因在轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動物中的行為并進行理論上的探討。某些報告基因不但可以用于監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達，還可用于新型觀賞魚的開發(fā)

。(二)、目的基因報告基因（reporter

gene）轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚作為觀賞魚已于2004年初在美國（除加洲外）市場上銷售，轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚成為第一種上市的轉(zhuǎn)基因動物二、

外源基因的導入顯微注射法電穿孔法精子載體法脂質(zhì)體法逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染基因槍法I. 顯微注射法借助于顯微鏡的放大技術(shù)，直接把外源基因注射到動物的卵母細胞、受精卵、早期胚胎、胚胎干細胞或體細胞中，然后生產(chǎn)動物個體的方法。優(yōu)點：整合率高缺點：設(shè)備昂貴、操作技術(shù)難度大，每次注射有限細胞I. 顯微注射法II. 電穿孔法在瞬間高壓下，細胞膜形成可逆的細胞膜孔，DNA經(jīng)由細胞膜孔而進入細胞中，當電場消逝后細胞膜可在回復，使DNA保留在細胞內(nèi)優(yōu)點：可一次處理大量樣品缺點：高壓易使受精卵受到傷害；導入是隨機的、無定向性，而且轉(zhuǎn)移率較低。III. 精子載體法spermmediatedgene

transfer將目的基因利用電穿孔方式送入精子，而后再利用體外受精的方式使精子與卵結(jié)合，通過重組作用使遺傳物質(zhì)繁衍至下一代III. 精子載體法spermmediatedgene

transfer利用精子攜帶電脈沖法對大珠母貝和合浦珠母貝進行了轉(zhuǎn)基因研究，陽性率達50%；聚乙烯亞胺(PEI)與精子載體法相結(jié)合在將外源基因轉(zhuǎn)入皺紋盤鮑；Tsai等用電脈沖介導的精子載體法將外源基因(opAFP2000CAT)

導入雜色鮑中，陽性率達65%IV. 脂質(zhì)體法

lipofection脂質(zhì)體:

人造脂質(zhì)小泡，在水中磷脂分子親水頭部插入水中，疏水尾部伸向空氣，攪動后形成雙層脂分子的球形脂質(zhì)體，可將外源DNA包裝在內(nèi)部，通過雙層膜同受體細胞膜間的融合作用，使外源DNA進入細胞質(zhì)，再進入細胞核，完成基因轉(zhuǎn)移IV. 脂質(zhì)體法

lipofection優(yōu)點：操作簡單方便缺點：要多次重復測試才能找到最適宜轉(zhuǎn)染條件V. 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染Virusmediatedgene

transfer病毒具感染宿主細胞能力，可將目的基因嵌入適當病毒載體中；此載體在感染細胞或胚胎時，將外源基因帶入基因組中優(yōu)點：操作簡單，一次可處理眾多樣品缺點：外源基因在生殖細胞系中的遺傳率低于顯微注射VI.

基因槍Gunpowder將包裹DNA的金?；蜴u粒，通過基因槍（火藥爆炸或高壓氣體加速）、氦氣或電擊等技術(shù)來獲得足夠的加速度，射入完整的植株、組織外植體、愈傷組織或細胞懸液高效，但是整合率非常低VI.

基因槍Gunpowder劉志毅等（2001）:含猿猴空泡病毒啟動子、綠色熒光蛋白基因(GFP)和核酶基因的質(zhì)粒pGTR導入蝦卵，通過顯微熒光觀察和RT-PCR檢測，得到了轉(zhuǎn)GFP基因的中國對蝦幼體第三節(jié) 外源基因整合、表達與遺傳一、外源基因整合（一）外源基因的命運一般在胚胎發(fā)育早期受體細胞內(nèi)進行大量的復制，復制以后經(jīng)歷部分降解、變構(gòu)、多聚化和逐漸與基因組整合的過程。整合：有效整合，無效整合或沉默表達，毒性整合第三節(jié) 外源基因整合、表達與遺傳一、外源基因整合（二）隨機整合外源DNA引入細胞基因組，絕大多數(shù)情況下發(fā)生DNA隨機整合，是一種非常規(guī)重組；一、外源基因整合（二）隨機整合

外源DNA整合的構(gòu)型“循環(huán)排列線狀”分子模型：DNA分子的環(huán)化；環(huán)化分子的隨機切開；形成一系列循環(huán)排列的線狀分子；同源交換，形成串聯(lián)結(jié)構(gòu)一、外源基因整合（二）隨機整合整合效率外源基因注入受精卵后可與受體基因組整合，整合率與受體魚種類、注入方式、注入DNA的構(gòu)型以及劑量有關(guān)。整合特點通常插入染色體的一個位點，少數(shù)情況插入幾個位點；形成轉(zhuǎn)基因嵌合體（占65%）；整合的隨機性和拷貝數(shù)的變異性。一、外源基因整合（三）同源重組（基因打靶）通過外源DNA與靶位點上相同核苷酸序列的同源重組，使外源基因穩(wěn)定地插入預定的位點。GeneknockinGeneknock

out通過基因打靶技術(shù)，在胚胎干細胞上進行基因轉(zhuǎn)移、篩選，克隆穩(wěn)定整合的細胞，以此細胞再作核移植，有望獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因魚，從根本上解決轉(zhuǎn)基因的定點整合與可控表達。二、外源基因的表達整合位置不同,

轉(zhuǎn)入基因有不同的表達：如整合在封閉的染色質(zhì)區(qū)很少或幾乎不表達；若整合在活化的染色質(zhì)區(qū)域，可能會高效表達；整合的轉(zhuǎn)入基因拷貝數(shù)的不同也能使轉(zhuǎn)基因表達水平不同導入基因的不確定性與遺傳的不可預見性：受體中整合的量及部位不同，又缺少調(diào)控手段，外源基因在受體中的表達也是不確定的；產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因魚畸形多，在其后代中具有的外源基因拷貝數(shù)目也不一樣，發(fā)生分離，優(yōu)良性狀不能穩(wěn)定遺傳，轉(zhuǎn)基因表達具有不可預見性第三節(jié) 外源基因整合、表達與遺傳目前，國內(nèi)外已克隆出20多種魚的GH基因，構(gòu)建出10多個“全魚”重組基因模型；轉(zhuǎn)基因遺傳不穩(wěn)定問題: 基因打靶+克隆+核移植，獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因魚；定點整合、穩(wěn)定遺傳、穩(wěn)定與可控表達以及安全性問題，仍是今后相當長一段時間內(nèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的重點、難點和熱點問題轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相同本質(zhì)都是通過獲得優(yōu)良基因進行遺傳改良區(qū)別在生物種內(nèi)個體間的基因轉(zhuǎn)移不受生物體間親緣關(guān)系的限制整個基因組的操作和轉(zhuǎn)移明確定義的基因的轉(zhuǎn)移第四節(jié)

轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動物的安全性一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展1、在全球1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物—一種含有抗生素藥類抗體的煙草在美國成功培植；1993年世界上第一種轉(zhuǎn)基因食品—轉(zhuǎn)基因晚熟西紅柿正式投放美國市場；2009

年，25

個國家的1400

萬農(nóng)民種植了1.34

億公頃（3.3億英畝）轉(zhuǎn)基因作物，相比2008

年1330

萬農(nóng)民種植1.25

億公頃有所上升（7%）。一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應用國際服務(wù)組織（ISAAA）執(zhí)行綱要簡報一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展1996-2009年，種植轉(zhuǎn)基因作物的國家由6個增加到25個。一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展2、在中國2009年，種植面積突破370萬公頃，成為繼美國、阿根廷、巴西、印度、加拿大之后的轉(zhuǎn)基因作物種植大國。正在研究的轉(zhuǎn)基因生物有130多種，涉及的基因種類超過100種。1993年，發(fā)布了基因工程安全管理相關(guān)法規(guī)。2001年，國務(wù)院發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展2、在中國2009

年11

月：中國為轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻（華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室）和植酸酶玉米（中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所）頒發(fā)了生物安全證書。二、轉(zhuǎn)基因生物是柄“雙刃劍”？對轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭論，國際上有幾個典型的事件。Pusztai事件；斑蝶事件；1995加拿大“轉(zhuǎn)基因油菜超級雜草”事件；2001墨西哥玉米基因污染《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，2001年5月9日實施?！掇r(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評估管理辦法》，2002年3月20日起實施，第一次將轉(zhuǎn)基因從低到高分為4個等級?！掇r(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》，2002年3月20日起實施?！掇r(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，2002年3月20日起實施，規(guī)定對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實施標識制度。第一批標識管理的轉(zhuǎn)基因生物目錄是：大豆種子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕、玉米種子、玉米、玉米油、玉米粉、油菜種子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕、棉花種子、番茄種子、鮮番茄、番茄醬。《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》，2002年4月8日頒布，7月1日起實施。《進出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗檢疫管理辦法》，2004年6月12日頒布。三、轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)生物尚待解決的問題1、外源基因轉(zhuǎn)移可控性和穩(wěn)定的遺傳性2、轉(zhuǎn)基因魚的安全評價受體魚的安全性調(diào)查基因操作過程的安全性轉(zhuǎn)基因動物的生態(tài)安全性遺傳安全性食用安全性遺傳和生態(tài)安全問題1）

轉(zhuǎn)基因動物逃逸或釋放到外界環(huán)境后，與野生物種進行交配，導致外源基因的擴散，改變物種原有的基因組成，造