實驗三、小鼠骨髓染色體制備與觀察課件

實驗三、

小鼠骨髓染色體標(biāo)本的

制備及觀察李孝敬基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)樓A412生科院辦公室電話：156907998991可編輯課件PPT一、實驗?zāi)康某醪秸莆眨ㄐ∈螅┕撬杓毎旧w標(biāo)本的制備原理和方法鞏固顯微鏡的操作技術(shù)了解小鼠的染色體形態(tài)特征2可編輯課件PPT二、實驗原理染色體是組成細胞核的基本物質(zhì)，是基因的載體。染色體異常也稱染色體發(fā)育不全。目前已確認(rèn)染色體病綜合征100余種，智力低下和生長發(fā)育遲滯是染色體病的共同特征。21三體綜合征；18三體綜合征、貓叫綜合征3可編輯課件PPT18三體綜合征4可編輯課件PPT二、實驗原理染色體標(biāo)本的觀察廣泛應(yīng)用于一些疾病的臨床診斷中。例如白血病、惡性血液病等的診斷。染色體是染色質(zhì)在細胞分裂期的存在形式。細胞分裂的中期，染色體在赤道板上排列清晰，是染色體觀察的最佳時期。

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骨髓細胞數(shù)量多且分裂旺盛，可直接進行染色體標(biāo)本的制備。取材方便，操作簡單和無需無菌培養(yǎng)，是研究小型哺乳動物等染色體的常用方法。人骨髓染色體抽取6可編輯課件PPT

怎樣才能制備一個好的染色體標(biāo)本？獲得大量處于有絲分裂中期的細胞。使細胞膜破裂，且染色體能夠完整并較分散的釋放出來。7可編輯課件PPT秋水仙素處理：秋水仙素溶液可抑制紡錘體的形成，使正在分裂的骨髓細胞停止在細胞分裂中期，積累大量中期分裂相細胞。低滲作用:使細胞充分膨脹，減少染色體間的相互纏繞和重疊。預(yù)固定：終止低滲作用，使細胞離心時不易破裂，固定維持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。高距離滴片：使細胞膜易于破裂，獲得中期染色體標(biāo)本，在顯微鏡下觀察染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量。8可編輯課件PPT三、實驗器材和試劑1.器材

蠟盤、手術(shù)剪、小鑷子、平皿、注射器、10ml離心管、吸管、量筒、預(yù)冷載玻片、試管架、離心機、恒溫水浴鍋、顯微鏡、乙醚酒精、擦鏡紙2、試劑

100ug秋水仙素液、0.075mol/LKCl低滲液、Giemsa染液9可編輯課件PPT1.秋水仙素處理：選擇體重20g左右的小白鼠，按2~4ug/g(小鼠)秋水仙素，與處死前4h，對其進行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。四、實驗步驟

注意：剪去少量骨質(zhì)，避免骨髓細胞丟失；擦凈血跡和肌肉細胞以免影響觀察；用0.075mol/LKCl收集足量細胞，反復(fù)沖洗直到股骨發(fā)白。2.取材：頸椎脫臼法處死

取兩后肢股骨紗布擦凈肌肉剪去股骨兩頭，暴露骨髓腔低滲液(5ml)沖洗至離心管內(nèi)收集骨髓細胞10可編輯課件PPT頸椎脫臼法處死小鼠11可編輯課件PPT3.低滲：用吸管吹打骨髓細胞使其分散，加入預(yù)溫37℃的低滲液至8ml,將離心管至37℃水浴鍋中，保溫至少30min后取出，使細胞充分吸水膨脹。

低滲不足，則細胞膨脹不夠，滴片時細胞不破裂。

低滲過度，則細胞提前破裂，染色體觀察不全?？諝獯荡蚍ǎ河梦芟鹉z頭內(nèi)的空氣混勻液體。12可編輯課件PPT4.預(yù)固定：加1ml新配制固定液混勻1500r/min，5min棄上清液。

固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需現(xiàn)配；離心需要配平。作用：終止低滲；維持細胞的膨脹狀態(tài)；防止離心破裂5.固定、制細胞懸液：加固定液5ml吹打混勻

固定15min離心1500r/min，5min

棄上清，加固定液0.2~0.4ml

吹打成細胞懸液，準(zhǔn)備制片使用。制備細胞懸液時，根據(jù)具體情況加固定液，以懸液呈現(xiàn)乳白色為宜。

13可編輯課件PPT6.滴片：冰片傾斜30°,細胞懸液距離玻片30cm高，在不重疊位置滴1～2滴，用口吹散細胞，過火焰干燥。

注意：載玻片預(yù)冷、高度、吹散、不可使載玻片燙手。7.染色：在玻片上滴幾滴Giemsa染液并鋪勻，8～10min，倒去染液，晾干。（染色盤中進行）8.小鼠染色體觀察：低倍鏡、高倍鏡下尋找染色體分散的中期分裂相.14可編輯課件PPT小鼠骨髓染色體10×1015可編輯課件PPT小鼠骨髓染色體10×4016可編輯課件PPT17可編輯課件PPT18可編輯課件PPT數(shù)目觀察：小鼠2倍體細胞染色體，數(shù)目2n=40條。其中19對為常染色體，一對為性染色體，染色體的核型分為4組。雄性XY,雌性XX,Y染色體最小。形態(tài)特征觀察：端著絲粒染色體“U”“V”。19可編輯課件PPT五、注意事項1．掌握好秋水仙素的濃度和處理時間；2．離心前需要配平；3.小鼠骨髓要沖洗干凈，以收集足夠的骨髓細胞；3．低滲處理是實驗成敗的關(guān)鍵，注意低滲時間；4．固定液要現(xiàn)配現(xiàn)用，固定要充分；5．載玻片要潔凈并預(yù)冷，滴片要有一定的高度；6.細胞懸液不能太稀，要呈乳白色；7.烤片時溫度不能太高。8.沖洗染液時水流要緩慢，以免細胞流失過多。20可編輯課件PPT六、作