高通量技術(shù)在腸道微生物課件

高通量技術(shù)在腸道微生物

宏基因組學研究中的應(yīng)用諾貝爾獎獲得者JoshuaLederberg認為，人是一種由自身細胞和腸道菌群組成的"超級生物體"。人體腸道菌群編碼的基因組可被視為“人的第2基因組”，它們參與人體的營養(yǎng)、代謝和免疫過程，是影響人體健康最重要的因素之一。

由此對腸道微生物宏基因組學的研究成為當今的熱點。高通量測序技術(shù)具有諸多優(yōu)越性，使研究者不僅能夠深入分析腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，還能結(jié)合其它“組學”技術(shù)進一步了解腸道微生物的基因功能和代謝途徑。概述人體腸道為微生物提供了良好的棲息環(huán)境，共生微生物多達1000多種，成人腸道內(nèi)微生物的數(shù)量大約是1012~1014個，不僅遠遠大于體表其它微生物的數(shù)量，而且是人體自身細胞數(shù)的10倍。從基因?qū)用嫔峡矗梭w自身的基因組大約攜帶了2.5萬個基因，而人體腸道微生物編碼的基因總數(shù)約是人自身基因總數(shù)的150倍,人的基因組與人體腸道微生物宏基因組相互協(xié)調(diào)，和諧一致，共同作用于人體的免疫、營養(yǎng)和代謝過程.概述保證了人體的健康很多研究表明腸道菌群與宿主的健康狀況息息相關(guān)，腸道菌群影響宿主的代謝顯型，營養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生和吸收以及調(diào)整和改善宿主的免疫系統(tǒng)。人的健康狀況發(fā)生變化，腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)就會發(fā)生變化；腸道微生物的組成變化同樣也會導致人體的健康狀況的改變。腸道菌群結(jié)構(gòu)的紊亂與各種疾病，特別是飲食不當導致的肥胖、糖尿病、冠心病、結(jié)腸癌等的發(fā)生具有密切的關(guān)系。此外，不同的人具有不同的腸道菌群結(jié)構(gòu)，飲食、藥物以及環(huán)境因素也影響人體腸道菌群的組成。由此，腸道菌群結(jié)構(gòu)可以精確反映人體的健康狀況。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，科學家們對腸道微生物宏基因組進行全面地測序分析，并對腸道微生物的生理功能進行深入解析，這為以腸道菌群為靶點，通過改變膳食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)攝入來預防和治療各類慢性疾病帶來了全新的思路和方法。本文結(jié)合最新研究成果，重點介紹高通量測序技術(shù)在腸道微生物宏基因組學研究中的優(yōu)越性，并討論今后的研究重點1987年，以雙脫氧核苷酸末端終止法（Sanger法）為代表的第1代測序技術(shù)誕生[13]，Sanger法以其高準確度（99.999%）以及較長的讀長（1000bp）在人類基因組計劃（Humangenomeprogram，HGP）中發(fā)揮了巨大作用。然而制約于成本高，通量低以及測序速度慢的缺點Sanger法已不能滿足于宏基因組測序分析。

隨后，高通量測序技術(shù)登上基因組學研究的舞臺。高通量測序技術(shù)特點及用于宏基因研究優(yōu)越性高通量測序技術(shù)是目前基因組學研究中應(yīng)用最廣泛的測序技術(shù)，它有效避免了Sanger法繁瑣的克隆過程，具有通量高，速度快，成本低等優(yōu)點。目前，主流的高通量測序技術(shù)主要包括454公司的GSFLX測序平臺、Illumina公司的Hiseq和Miseq測序平臺以及LifeTechnologies公司的IontorrentPGM和Ionproton測序平臺，3大公司測序平臺的比較結(jié)果如表1所示。高通量測序技術(shù)特點及用于宏基因研究優(yōu)越性以往人們對腸道微生物的研究主要依賴于傳統(tǒng)微生物分離純培養(yǎng)技術(shù)，然而實驗室復原微生物區(qū)系時，對厭氧微生物獲得的信息量是有限的；研究者在腸道微生物群落多樣性研究中，主要采用熒光原位雜交、末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)、變性梯度凝膠電泳以及生物芯片等分子生物學方法，然而這些方法都存在一定的缺陷。例如，變性梯度凝膠電泳只能檢測到腸道中優(yōu)勢菌，對痕量微生物卻束手無策，靈敏度較低；熒光原位雜交技術(shù)必須依賴寡核苷酸探針的特異性，只能檢出已知菌而不能用于鑒定未知微生物；生物芯片則通過固定在芯片上的探針來獲得微生物多樣性的信息，“只能驗證已知，卻無法探索未知”，并且在判斷微生物的豐度方面也存在缺陷。高通量測序技術(shù)以其數(shù)據(jù)量大，成本低，速度快的特點，使腸道微生物宏基因組學研究產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍，它能夠更加準確、深入地分析腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的微生物結(jié)構(gòu)組成、基因功能、代謝途徑以及膳食和營養(yǎng)對腸道微生物的影響作用。早期，細菌的16SrRNA被稱為“分子鐘”，這歸功于它的通用性、細胞活性、高度保守的核苷酸序列結(jié)構(gòu)以及長度適中易于快速測序的特點，這些使16SrRNA成為細菌分類學上的“金標準”。另外，根據(jù)進化速率的不同，16SrRNA中包含8個高度保守的核苷酸區(qū)域和9個高度可變區(qū)。根據(jù)這些區(qū)域的比對差異可以反映物種不同的進化關(guān)系，一般兩條16SrRNA基因差異小于1%的認為是同一個種，小于5%的認為是同一個屬，小于10%的認為是同一個科；此外，研究者還可以根據(jù)序列差異（根據(jù)研究需要劃分閾值一般為1%，3%，5%）將16SrRNA聚類成分類操作（Operationaltaxonomicunit，OTU），利用OTU的數(shù)目、各個OTU的序列數(shù)來分析估計物種多樣性和豐度。高通量測序技術(shù)在腸道微生物宏基因組學中的應(yīng)用技術(shù)基于16SrRNA的腸道群落結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用在基于16SrRNA基因的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析中，由于高通量測序讀長較短不能覆蓋16SrRNA的全長基因，所以研究者對16SrRNA基因的一個或多個高可變區(qū)進行測序，而且有研究顯示這些高可變區(qū)可以高度精確地反映微生物群落中系統(tǒng)進化關(guān)系，與16SrRNA全長基因反映的進化關(guān)系基本一致。查閱文獻，總結(jié)了國內(nèi)外研究者在腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析中常用的測序區(qū)域，結(jié)果如表2所示。高通量測序技術(shù)在腸道微生物宏基因組學中的應(yīng)用由于在腸道微生物宏基因組學領(lǐng)域的諸多研究表明，只分析腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)信息遠不能實現(xiàn)對飲食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)攝入是如何通過腸道微生物影響機體健康的深入探究，因此通過高通量測序技術(shù)分析腸道微生物宏基因組的功能基因顯得非常必要。2010年，深圳華大基因研究院對124個歐洲人的腸道菌群進行了研究，并對測序的序列進行了拼接、注釋、功能基因的分類以及多態(tài)性分析等研究。結(jié)果表明，這些基因中有一部分基因存在于所有細菌中，主要參與碳循環(huán)、氨基酸代謝以及核酸和ATP的合成；還有一部分基因主要與細菌在腸道內(nèi)的功能有關(guān)，如對宿主細胞和蛋白質(zhì)的附著作用、腸上皮細胞糖脂代謝等。這些基因中的大部分具有我們未知的功能，并且通過對菌群結(jié)構(gòu)分析表明人體腸道內(nèi)包含約1150種常見菌群，其中大部分被人類腸道所共有，并且在每個個體的腸道中至少有160種這類菌群。高通量測序技術(shù)在腸道微生物宏基因組學中的應(yīng)用技術(shù)基于腸道微生物宏基因組的功能基因分析中的應(yīng)用2012年，華大基因又研究了人體腸道微生物與II型糖尿病之間的關(guān)系，該研究通過Illumina測序平臺對345個中國人的腸道微生物樣本進行了深度測序，并以全宏基因組相關(guān)聯(lián)研究（Metagenomewideassociationstudies，MGWAS）的方法對II型糖尿病與腸道微生物失調(diào)之間的關(guān)系進行了深入研究，結(jié)果表明II型糖尿病患者腸道菌群發(fā)生失調(diào)，丁酸鹽產(chǎn)生菌豐度下降，多種條件致病菌增多。另外，上海交通大學趙立平教授實驗室利用Illumina測序平臺對一個肥胖患者糞便菌群進行宏基因組測序分析，通過構(gòu)建脂多糖（Lipopolysaccharides，PS）合成基因數(shù)據(jù)庫并將測序數(shù)據(jù)與該數(shù)據(jù)庫比對而篩選出一株導致肥胖的陰溝腸桿菌B29；進一步研究發(fā)現(xiàn)該菌株能使無菌小鼠在高脂飲食條件下表現(xiàn)出明顯的肥胖和胰島素抵抗的表型，說明腸道內(nèi)毒素產(chǎn)生菌具有誘發(fā)無菌小鼠發(fā)生肥胖和胰島素抵抗的作用，提示腸道內(nèi)高水平的內(nèi)毒素產(chǎn)生菌是導致該個體極端肥胖發(fā)生的原因而不是結(jié)果。高通量測序技術(shù)在腸道微生物宏基因組學中的應(yīng)用技術(shù)基于腸道微生物宏基因組的功能基因分析中的應(yīng)用科學合理的飲食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)干預可以通過調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)達到改善機體健康狀況的目的，而基于高通量測序技術(shù)的腸道微生物宏基因組學為研究腸道微生物與人體健康的關(guān)系提供了全新的思路和方法。我們可以綜