《RNA干涉及其應(yīng)用》課件

RNAi及其應(yīng)用實(shí)例

1精選課件ppt2006NobelPrize

生理學(xué)（醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))RNAinterference“沉默”是金2精選課件ppt后基因組研究焦點(diǎn)：基因功能研究抑制基因表達(dá)觀察功能變化KnockOut法Antisense法Ribozyme法RNAi法3精選課件ppt概念：RNAinterference（RNAi）與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。4精選課件pptRNAi發(fā)現(xiàn)歷程：1990年，曾有科學(xué)家給矮牽?；ú迦胍环N催生紅色素的基因，希望能夠讓花朵更鮮艷。但意想不到的事發(fā)生了：矮牽?；ㄍ耆噬?，花瓣變成了白色！??5精選課件ppt1995年

康奈爾大學(xué)Guo等在對(duì)線蟲(chóng)C.elegans的研究中，應(yīng)用正義鏈RNA作為對(duì)照，研究par-1基因的表達(dá)，意外的發(fā)現(xiàn)，正義鏈RNA與反義鏈RNA同樣能夠抑制目的基因的表達(dá)。

6精選課件ppt1998年，AndrewFire等首次將正義鏈反義鏈RNA混合注入線蟲(chóng)C.elegans中，觀察到更強(qiáng)的基因表達(dá)抑制。首次提出了RNAinterference的概念。Acontrol:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNAMex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization7精選課件pptRNAi機(jī)制DicerRISC堿基互補(bǔ)酶解8精選課件pptshort-interferingRNA加工長(zhǎng)鏈dsRNA形成21-23nt小片段3427212016Tuschl,20019精選課件ppt

DicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNA10精選課件pptRISC:RNA-InducedSilencingComplexExonucleaseHomologysearchactivityEndonucleaseHelicase5’3’TargetmRNAOH3’5’P形成RISC復(fù)合物，降解目的mRNA11精選課件pptRNAi的生物學(xué)意義：一種古老、保守而又及其重要的遺傳學(xué)行為。生物體在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中對(duì)異?；蚧顒?dòng)的監(jiān)控和防御,有學(xué)者稱之為“基因組水平的免疫系統(tǒng)”。一種抗病毒感染機(jī)制。12精選課件ppt與其他反基因技術(shù)的比較：優(yōu)點(diǎn)：1、特異性好；2、抑制效率高；3、操作相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短；缺點(diǎn)：1、靶點(diǎn)選擇的不確定性；2、核酸的不穩(wěn)定性，dsRNA引入細(xì)胞的常見(jiàn)問(wèn)題；3、脫靶效應(yīng)；4、生物安全性（質(zhì)粒，病毒等）。13精選課件pptRNAi的應(yīng)用：

功能基因組學(xué)藥物靶篩選和驗(yàn)證細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析基因治療的新策略14精選課件ppt基因治療方面的應(yīng)用抗腫瘤策略——應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制腫瘤細(xì)胞（如肝癌細(xì)胞、膽管癌細(xì)胞等）中血管生長(zhǎng)因子如血管生成素如angi1、angi2、angi3及VEGF等或其受體的表達(dá)，以及抑制腫瘤細(xì)胞中如癌基因bcl2、RAS、Tp53等突變基因及其蛋白的表達(dá)而不影響非突變基因的表達(dá)，可達(dá)到很好的抗腫瘤生長(zhǎng)及抗腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。15精選課件ppt抗器官移植排斥反應(yīng)——細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介導(dǎo)細(xì)胞粘附和T細(xì)胞激活的分子，應(yīng)用與ICAM-1基因序列特異的siRNA阻斷ICAM-1mRNA和蛋白的表達(dá)，可以明顯降低大鼠同種移植心的移植物血管病的發(fā)生的程度和缺血再灌注損傷。16精選課件ppt抗病毒策略：

最早用于HIV研究，被Science評(píng)為2002年年度突破。

斯坦福醫(yī)學(xué)院的研究群，把dsRNA放進(jìn)小老鼠的肝細(xì)胞，dsRNA被小老鼠體內(nèi)的核酸酶分解成許多siRNA。研究發(fā)現(xiàn)siRNA具有高度專一性，會(huì)與小老鼠體內(nèi)的丙型肝炎病毒的mRNA相結(jié)合，使mRNA分解并失去轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)的功能。斯坦福醫(yī)學(xué)院運(yùn)用此技術(shù)來(lái)治療丙型肝炎的研究，已從體外試管實(shí)驗(yàn)階段推進(jìn)至體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。且在小老鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻斷的明顯效果。17精選課件ppt2004年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)經(jīng)過(guò)修飾的第一個(gè)RNAi藥物Bevasiranib

進(jìn)行臨床新藥試驗(yàn)，用于治療與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變。

RNAi臨床治療的前景有賴于疾病的發(fā)生發(fā)展與特定基因的關(guān)系研究

功能基因組學(xué)18精選課件ppt利用siRNA治療疾病需要解決幾個(gè)問(wèn)題：（1）導(dǎo)入問(wèn)題，使用高效載體傳遞siRNA；（2）和給藥方式，因?yàn)镽NA容易被降解，如何提高siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性；（3）高選擇性。如何靶向特定細(xì)胞而不影響其他細(xì)胞。19精選課件pptRNAi方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用得益于RNAi機(jī)制的研究，小分子干擾RNA（shortinterferingRNA，siRNA)概念的引入。

20精選課件ppt哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的RNAi現(xiàn)象長(zhǎng)鏈dsRNA所有基因表達(dá)下降RNAi現(xiàn)象PKR,RNaseL

活性化X干擾素21精選課件pptRNAi過(guò)程的功能單元：siRNA19ntduplex2nt3’overhangs22精選課件pptRNAi方法的核心步驟——siRNA的設(shè)計(jì)：

1、從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼下游75bp開(kāi)始，尋找“AA”二連序列，并記下其后面的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—60%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。靶點(diǎn)的選擇往往是試驗(yàn)性的。

23精選課件ppt2、將候選的靶點(diǎn)序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行BLAST比較。3、選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。24精選課件ppt提供RNAi在線技術(shù)支持的公司（網(wǎng)站）25精選課件pptsiRNA制備常用的五種方法：1、化學(xué)合成；2、體外轉(zhuǎn)錄；3、長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解(e.g.Dicer,E.coli,RNaseIII)；4、siRNA表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)形成shRNAs；5、PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)。26精選課件ppt一、化學(xué)合成：1、高質(zhì)量，高純度。2、高成本適用于已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)抑制效率的靶點(diǎn)序列不適于篩選靶點(diǎn)序列27精選課件ppt二、體外轉(zhuǎn)錄：1、成本適中2、省時(shí)適用于篩選靶點(diǎn)序列不適用于長(zhǎng)期的研究或者針對(duì)某個(gè)特定靶點(diǎn)序列的大量研究應(yīng)用T7RNApolymerase體外轉(zhuǎn)錄方法常需要RNA的起始兩個(gè)核苷酸是GGorGA，這樣合成效率才有保障。(Milligan1987）28精選課件ppt三、長(zhǎng)片斷dsRNA酶解法：200-1000nt的dsRNA體外被RnaseⅢ家族成員切割成siRNA不需要驗(yàn)證篩選多個(gè)靶點(diǎn)序列適用于LOF表型分析不適用于長(zhǎng)期研究或者特定siRNA序列的研究29精選課件ppt四、siRNA表達(dá)質(zhì)?；蛘卟《据d體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAsRNApolymeraseIII(polIII):humanU6promotersmouseU6promotersthehumanH1promoter30精選課件ppt商品化載體的siRNA策略示意圖31精選課件ppt載體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA方法的特點(diǎn)1、操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好;2、siRNA表達(dá)載體一旦構(gòu)建成功，可以無(wú)限制的應(yīng)用于研究;3、可能建立可以調(diào)節(jié)表達(dá)的系統(tǒng);4、受轉(zhuǎn)染等因素的影響比較大。適用于長(zhǎng)期的對(duì)于某個(gè)基因的研究，尤其是帶有篩選標(biāo)記的載體，能夠用于構(gòu)建特定基因缺陷（knockdown）的細(xì)胞株32精選課件ppt五、siRNAExpressionCassettes(SECs)方法快速、不需要克隆測(cè)序等步驟適用于篩選多個(gè)候選靶點(diǎn)序列的抑制效率33精選課件pptRNAi實(shí)例：

Targetgene：c-myc

查找靶基因mRNA利用網(wǎng)絡(luò)在線支持，尋找siRNA序列根據(jù)目的選擇實(shí)現(xiàn)RNAi的策略：推薦載體法。根據(jù)查找的siRNA序列，合成長(zhǎng)鏈oligo構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染檢測(cè)效應(yīng)（包括干擾效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)）34精選課件ppt2、/

3、or

1、檢索文獻(xiàn)獲取有實(shí)驗(yàn)證明有效的靶點(diǎn)序列（核對(duì)）目的基因mRNA獲?。?5精選課件ppt36精選課件ppt37精選課件ppt38精選課件ppt39精選課件ppt40精選課件ppt41精選課件ppt42精選課件ppt43精選課件ppt44精選課件ppt45精選課件ppt尋找siRNA序列/ssl-bin/app/rnai

支持accessionnumber或者序列直接輸入?yún)?shù)設(shè)計(jì)全面輸出經(jīng)過(guò)篩選的candidatetarget（BLAST）推薦★★★★★/techlib/misc/siRNA_finder.html

最全面的RNA實(shí)驗(yàn)相關(guān)網(wǎng)站有商品化的各類載體獲得siRNAtarget需要手工BLAST輸出直接可遞交公司合成的長(zhǎng)鏈oligo推薦★★★★46精選課件ppt利用生物學(xué)軟件組配長(zhǎng)鏈oligo，（合成單鏈DNA（直接帶有4個(gè)bp的酶切位點(diǎn)粘性末端)；

載體構(gòu)建：