農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物食用安全性檢驗(yàn)：非期望效應(yīng)

DB440300/T32.3農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物食用2非目標(biāo)農(nóng)藝性狀nontargetagr非目標(biāo)營養(yǎng)性狀nontargetdiet非目標(biāo)整體性狀non-targetintegr3非目標(biāo)營養(yǎng)成分non-targetnutrien非目標(biāo)營養(yǎng)功能non-targetnutr外源基因整合性狀featuresofintegratedexogenous目的基因轉(zhuǎn)錄性狀transcriptional目的基因表達(dá)性狀expressionfea基因組轉(zhuǎn)錄性狀genometranscriptio外源基因整合種類typeofexogenousgeneintegration目的基因整合拷貝數(shù)copynumber目的基因堿基對(duì)數(shù)目numberofbas目的基因核苷酸序列nucleotides目的基因表達(dá)特性expressionfeaturesoftargegene目的基因表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列aminoacidsequencesoftargetgeneex目的基因表達(dá)產(chǎn)物分子量molecularweightoftargetgen目的基因表達(dá)產(chǎn)物生物活性biologicalactivityoftargetPCRpolymerasechainreactionRT-PCRreversetranscriptionPCR根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)4.1.1.2農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物表型性狀檢驗(yàn)的項(xiàng)目包括農(nóng)藝性狀（目標(biāo)農(nóng)藝性狀、非目標(biāo)54.1.2.1農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的各項(xiàng)遺4.1.2.2農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物遺傳性狀檢驗(yàn)的項(xiàng)目包括外源基因的整合性狀、目的基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA序列的堿基對(duì)數(shù)和核苷酸排列順序；目的基因表達(dá)性狀4.1.3.1農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物抗生素抗性基因4.1.3.2農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移檢驗(yàn)的項(xiàng)目包括表達(dá)抗生素抗性產(chǎn)4.2.1農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物非期望效應(yīng)的檢驗(yàn)應(yīng)包括表型性狀檢驗(yàn)、遺傳性狀檢驗(yàn)和抗生4.2.3遺傳性狀檢驗(yàn)按整合性狀、目的基因轉(zhuǎn)錄性狀、目的基因表達(dá)性狀和基因組轉(zhuǎn)4.2.4抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移檢驗(yàn)按向環(huán)境中非靶生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、向動(dòng)物胃腸道5.1.2.2以轉(zhuǎn)基因生物為試驗(yàn)樣品，以受體生物為對(duì)照樣品，對(duì)待測(cè)的轉(zhuǎn)基因5.1.3.1試驗(yàn)樣品具有目標(biāo)整體性狀，對(duì)照樣品無此性狀，或者試驗(yàn)樣品中目5.1.3.2試驗(yàn)樣品的目標(biāo)整體性狀未發(fā)生偏離基因工程設(shè)計(jì)目標(biāo)的顯著改變，5.1.3.3農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的目標(biāo)農(nóng)藝性狀發(fā)生變異，根據(jù)變異的情況，分析該95.2.3.1試驗(yàn)樣品具有目標(biāo)細(xì)胞性狀，對(duì)照樣品無此性狀，或者試驗(yàn)樣品中目5.2.3.2試驗(yàn)樣品的目標(biāo)細(xì)胞性狀未發(fā)生偏離基因工程設(shè)計(jì)目標(biāo)的顯著改變，5.2.3.3農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的目標(biāo)農(nóng)藝性狀發(fā)生變異，根據(jù)變異的情況，分析該5.3.2.2以轉(zhuǎn)基因生物為試驗(yàn)樣品，以受體生物為對(duì)照樣品，選擇相應(yīng)的檢驗(yàn)5.3.3.1試驗(yàn)樣品未檢出相應(yīng)的危害成分，對(duì)照樣品檢出相應(yīng)的危害成分，或5.3.3.2試驗(yàn)樣品的目標(biāo)減害功能未發(fā)生偏離基因工程設(shè)計(jì)目標(biāo)的顯著改變，5.3.3.3農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的目標(biāo)農(nóng)藝性狀發(fā)生變異，根據(jù)變異的情況，分析該通過觀察農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物除目標(biāo)整體性狀以外的其他非目標(biāo)性狀，如形態(tài)特征和生育特性是否表7物為試驗(yàn)樣品，以受體生物為對(duì)照樣品，對(duì)待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物的各代轉(zhuǎn)基因生5.4.3.1試驗(yàn)樣品所檢驗(yàn)的非目標(biāo)整體性狀與對(duì)照樣品相同或者相近，可判定5.4.3.2農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的非目標(biāo)整體性狀未發(fā)生顯著改變，可判定農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基5.4.3.3對(duì)于非目標(biāo)農(nóng)藝性狀發(fā)生變異的轉(zhuǎn)基因生物，需要通過安全性毒理學(xué)5.5.3.1試驗(yàn)樣品所檢驗(yàn)的非目標(biāo)細(xì)胞性狀與對(duì)照樣品相同或者相近，可判定5.5.3.2農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的非目標(biāo)細(xì)胞性狀未發(fā)生顯著改變，可判定農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基5.5.3.3對(duì)于非目標(biāo)農(nóng)藝性狀發(fā)生變異的轉(zhuǎn)基因生物，需要通過安全性毒理學(xué)以發(fā)生非目標(biāo)農(nóng)藝性狀變異的轉(zhuǎn)基因生物為試驗(yàn)樣品，以受體生物為對(duì)照樣品，參照GB5.6.3.1試驗(yàn)樣品的LD50顯著小于對(duì)照樣品，可判定試驗(yàn)樣品發(fā)生的非目標(biāo)農(nóng)5.6.3.2在任何一項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)中，試驗(yàn)樣品表現(xiàn)的毒性顯著強(qiáng)于對(duì)照樣品，85.7.3.1試驗(yàn)樣品中目標(biāo)營養(yǎng)成分的含量或質(zhì)量與對(duì)照樣品無顯著差異，可判5.7.3.2試驗(yàn)樣品中目標(biāo)營養(yǎng)成分的含量或質(zhì)量顯著高于對(duì)照樣品，可判定轉(zhuǎn)5.7.3.3試驗(yàn)樣品無改善受體生物中目標(biāo)營養(yǎng)成分的作用，或者試驗(yàn)樣品無相5.8.3.1試驗(yàn)樣品中目標(biāo)功效成分及其含量與對(duì)照樣品無顯著差異，可判定轉(zhuǎn)5.8.3.2試驗(yàn)樣品中目標(biāo)功效成分及其含量顯著高于對(duì)照樣品，可判定轉(zhuǎn)基因5.8.3.3無新增或者提高受體生物中目標(biāo)功效成分的作用，或者試驗(yàn)樣品無相95.9.2.1.1蛋白質(zhì)的測(cè)定：參5.9.2.1.2氨基酸的測(cè)定：參照G5.9.2.1.6粗纖維的測(cè)定：參照5.9.2.1.9胡蘿卜素的測(cè)定：參照5.9.2.1.25鉀和鈉的測(cè)定：參5.9.2.1.26鐵、銅、錳、鎂、鋅的測(cè)定：參5.9.3.1試驗(yàn)樣品中所檢驗(yàn)的非目標(biāo)營養(yǎng)成分的含量與受體生物無顯著差異，目標(biāo)營養(yǎng)性狀保持穩(wěn)定；試驗(yàn)樣品所檢驗(yàn)的非目標(biāo)營養(yǎng)成分中一種或多種的5.9.3.2試驗(yàn)樣品組的試驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照樣品組無顯著差異，可判定轉(zhuǎn)基因生物提取制備轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞的總DNA，根據(jù)待檢和合成相應(yīng)的引物，以PCR在適當(dāng)?shù)臈l件下分別對(duì)各6.1.8.1試驗(yàn)樣品出現(xiàn)基因工程導(dǎo)入的各外源基因?qū)?yīng)的條帶，陽性對(duì)照6.1.8.2試驗(yàn)樣品不出現(xiàn)基因工程導(dǎo)入的各外源基因相應(yīng)的條帶，或者出6.1.8.3試驗(yàn)樣品丟失的外源基因?qū)儆跇?biāo)記基因或報(bào)告基因，可判定該變6.1.8.4試驗(yàn)樣品丟失的外源基因?qū)儆谀康幕蚧蛘{(diào)控元件，可判定該變酶切片段形成環(huán)狀DNA。采用根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，），6.2.8.2試驗(yàn)樣品呈現(xiàn)的條帶數(shù)目與待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物的拷貝數(shù)不同，可6.2.8.3試驗(yàn)樣品中目的基因整合拷貝數(shù)發(fā)生變異，可判定該變異對(duì)轉(zhuǎn)基6.3.9.1試驗(yàn)樣品凝膠電泳目標(biāo)條帶的序列與待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物的目的基6.3.9.2試驗(yàn)樣品凝膠電泳目標(biāo)條帶的序列與待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物的目的基6.3.9.3試驗(yàn)樣品中目的基因整合位點(diǎn)發(fā)生變異，可判定該變異對(duì)轉(zhuǎn)基因提取制備轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞的總DNA，根據(jù)待檢成相應(yīng)的引物，以PCR在適當(dāng)?shù)臈l件下對(duì)目的基因全6.4.8.1試驗(yàn)樣品中目的基因相應(yīng)條帶的堿基對(duì)數(shù)與待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物的6.4.8.2試驗(yàn)樣品中目的基因相應(yīng)條帶的堿基對(duì)數(shù)大于待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物6.4.8.3試驗(yàn)樣品中目的基因相應(yīng)條帶的堿基對(duì)數(shù)小于待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物6.4.8.4試驗(yàn)樣品中目的基因分子發(fā)生斷裂變異或者截短變異，可判定該合成相應(yīng)的引物，以PCR在適當(dāng)?shù)臈l件下分別對(duì)目的樣品，以受體生物靶器官組織和轉(zhuǎn)基因生物非靶器官組織為參照樣品，分別提取制備總蛋白質(zhì)，采用6.6.7.1試驗(yàn)樣品出現(xiàn)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的條帶，條帶的分子量與待測(cè)的對(duì)照樣品均出現(xiàn)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的條帶，條帶的分子量與待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物的表6.6.7.3試驗(yàn)樣品不出現(xiàn)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的條帶，或者條帶的分子量與6.6.7.4試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品均出現(xiàn)目的基因表達(dá)根據(jù)待檢轉(zhuǎn)基因生物目的基因表達(dá)產(chǎn)物的分子特性，以轉(zhuǎn)基因生物組織或細(xì)胞為試驗(yàn)樣品，制備目的基因表達(dá)產(chǎn)物樣品，用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的分子量。6.7.7.1測(cè)定的表達(dá)產(chǎn)物分子量與待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物的表達(dá)產(chǎn)物理論分子6.7.7.3試驗(yàn)樣品中目的基因表達(dá)產(chǎn)物分子量發(fā)生變異，可判定該變異對(duì)）；6.8.7.1測(cè)定的目的基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列與待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物的表6.8.7.2測(cè)定的目的基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列與待測(cè)的轉(zhuǎn)基因生物的表6.8.7.3試驗(yàn)樣品中目的基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列發(fā)生變異，可判定該TaqDNA聚合酶（5U/μLUNG酶（1U/μL礦物油；溴化乙錠（EB10mg/mL）或其他的染6.9.8.1試驗(yàn)樣品出現(xiàn)相應(yīng)的DNA條帶，且堿基6.9.8.2試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品均不呈現(xiàn)相應(yīng)的6.9.8.4轉(zhuǎn)基因生物目的基因的轉(zhuǎn)錄特性或者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物堿基對(duì)數(shù)目發(fā)生變cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，對(duì)待測(cè)樣品與對(duì)照樣品的電泳條帶進(jìn)行比對(duì)，找出新增的條帶和消失的條帶?；厥詹顒e的條帶，通過PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化，分離差別條帶的cDNA。對(duì)差別條帶的cDNA進(jìn)行測(cè)序和檢索，確認(rèn)對(duì)應(yīng)的表達(dá)差異的基因。通過對(duì)差異基因的功cDNA6.10.10.1從聚丙烯酰胺凝膠上切6.10.10.312000r/min離心2min，上清液轉(zhuǎn)至另一新的），6.10.15.1除外源基因的條帶外，試驗(yàn)樣品與對(duì)照樣品的條帶無差異，可6.10.15.2差異基因轉(zhuǎn)錄性狀的改變不增加轉(zhuǎn)基因生物毒害成分的含量和6.10.15.3差異基因轉(zhuǎn)錄性狀的改變?cè)黾愚D(zhuǎn)基因生物毒害成分的含量或降養(yǎng)36h，檢查菌落數(shù)，并挑選各種不同形態(tài)的菌落革蘭氏染色后，和0.6倍體積的異丙醇,–20℃,沉淀20min。 量列12NOS34NPTⅡ56789NOSNPTⅡ37℃,3min94℃,10min94℃,30s60℃,1