組織DNA提取原理和步驟-詳細

組織DNA提取

TissueDNAExtraction1精選完整ppt課件[實驗目的]學習從生物組織中提取DNA，為研究DNA的理化性質(zhì)與結構功能打好基礎。精選完整ppt課件提取DNA總的原則：

1保證核酸一級結構的完整性；2其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；3核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；4其他核酸分子，如RNA，也應盡量去除。精選完整ppt課件粉碎組織DNP裂解液

裂解細胞膜、核膜DNP

苯酚、氯仿

DNA（RNA）RNA酶

ProtaseＫ苯酚、乙醇

純DNA紫外定量原理：精選完整ppt課件各種組織細胞破碎方法細胞破碎方法

應用

Ⅰ機械法1勻漿法機體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細菌、酵母

Ⅱ物理法1超聲法細胞混懸液2反復凍融法培養(yǎng)細胞3冷熱交替法細菌、病毒4低滲裂解紅細胞

Ⅲ化學法1有機溶劑細菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細胞3酶解法細菌、酵母精選完整ppt課件破裂細胞、釋放核酸精選完整ppt課件DNA酚抽提法示意圖精選完整ppt課件DNA鑒定(DNAidentification)

濃度鑒定(concentration)純度鑒定(purity)完整性鑒定(integrity)精選完整ppt課件濃度鑒定

(concentrationidentification)1）紫外分光光度法(ultravioletspectrophotometery)

測定DNA在A260nm的光吸收值。

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時，相當于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸）精選完整ppt課件各種堿基的紫外吸收光譜精選完整ppt課件2）熒光光度法熒光染料溴化乙錠（ethidiumbromide，EB），可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）精選完整ppt課件EB與DNA的結合精選完整ppt課件500

l全血提取的基因組DNA電泳動物組織提取基因組DNA精選完整ppt課件純度鑒定(purityidentification)紫外分光光度法：在260nm和280nm處測定DNA溶液的光吸收，純的DNA，A260與A280之比應在1.80；低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值表明有RNA的殘留量。純的RNAA260與A280之比應在2.0。

A260/A280比值是純度檢測的重要指標。精選完整ppt課件完整性鑒定(integrityidentification)凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；總RNA電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。精選完整ppt課件核酸的貯存——DNA保存(storage)1）短期貯存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。

TE緩沖液的pH與DNA貯存有關，pH為8時，可減少DNA脫氨反應，pH低于7.0時DNA容易變性。2）長期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。精選完整ppt課件每克組織+ml裂解液組織勻漿器，勻漿取2.0ml勻漿，加等體積苯酚-氯仿，搖勻5min，2,500rpm10min

取水相加等體積氯仿-異戊醇,搖勻5min,2,500rpm10min方法：精選完整ppt課件取水相加5MNaCl至終濃度0.3MNaCl,加2.5倍體積冰無水乙醇，搖勻見白色沉淀,玻棒挑起

DNA70%乙醇洗滌一次沉淀溶于1mlTE

適當稀釋紫外分光光度計測A260nm,A280nm精選完整ppt課件

吸取DNA原液μl，用ddH2O稀釋至μl，在紫外分光光度計上測定A260nm及A280nm，計算A260nm/A280nm比值及DNA濃度。一般以A260nm/280nm≈1.8為標準。A260nm/A280nm若＜1.6，提示有蛋白質(zhì)或酚污染，應進一步純化。定量精選完整ppt課件DNA濃度（μg/ml）=A260nm×50×稀釋倍數(shù)×1/光徑*1OD值相當于50μg/mldsDNA，40μg/mlssDNA或RNA，2Oμg/ml寡核苷酸。濃度計算精選完整ppt課件1.裂解液（Homogenizationbuffer）:10mmol/LpH8.0Tris-HCl1mmol/LEDTA0.1mol/LNaCl1%SDSEDTA:抑制DNA酶活性試劑及其作用精選完整ppt課件SDS是離子型表面活性劑，主要功能：①溶解細胞膜蛋白而破壞細胞膜；②解聚細胞中的核蛋白；③與蛋白形成復合物精選完整ppt課件2.苯酚-氯仿(Phenol-Chloroform):

苯酚：強蛋白變性劑氯仿：蛋白變性劑，與水不互溶，與苯酚互溶，可以帶走殘余的酚。精選完整ppt課件為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。精選完整ppt課件3.氯仿-異戊醇（Isoamyl-alcohol）：

能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生，同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白質(zhì)及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。精選完整ppt課件4.冰無水乙醇（Absoluteethonal）和70%乙醇(70%Ethonal):無水乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失去水而易于聚合；可除去殘余的氯仿。70%乙醇洗滌可去除殘余的鹽離子，鹽離子的存在會使之不易溶解，并可抑制酶反應。精選完整ppt課件5.TE緩沖液（TEBuffer）：10mmol/LpH8.0Tris-HCl1mmol/LEDTA?緩沖對Tris-HCl不存在金屬離子的干擾作用?EDTA能穩(wěn)定DNA的活性。精選完整ppt課件6.20%SDS（十二烷基磺酸鈉）：抑制Dnase活性

精選完整ppt課件7.10mg/ml蛋白酶K(ProtaseK)：

分解蛋白質(zhì)，破壞細胞膜

8.10mg/mlRNA酶(RNase)：分解RNA精選完整ppt課件9.5mol/LNaCl：

減少DNA分子間的同性電荷相斥力，使DNA易于相反聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。精選完整ppt課件DNA提取試驗中常遇到

的問題基因組DNA收率較低或無基因組DNA樣本材料太少細胞破裂不夠充分，DNA釋放不完全離心力偏小兩相分離不完全……精選完整ppt課件DNA降解的原因

樣本不夠新鮮，采集材料過陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因組DNA鹽濃度過高基因組DNA中乙醇未清除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時加入蔗糖的原因加入多糖，保護DNA長度精選完整ppt課件[注意事項]1.處死動物取出所用臟器后應盡快放入液氮中,以免DNase引起DNA降解。在純化過程中要加核酸酶抑制劑(eg.EDTA),以防DNA自身降解。2