植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

PAGEPAGE60植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

目錄TOC\o"1-1"\h\z\u植物材料的采集、處理與保存 3實(shí)驗(yàn)一擬南芥種植和形態(tài)觀察 8實(shí)驗(yàn)二植物細(xì)胞的活體染色和死活的鑒定 11實(shí)驗(yàn)三植物原生質(zhì)體的分離和融合 13實(shí)驗(yàn)四植物葉面積測(cè)定原理、方法和步驟 16實(shí)驗(yàn)五植物細(xì)胞滲透勢(shì)的測(cè)定（質(zhì)壁分離法） 17實(shí)驗(yàn)六植物組織水勢(shì)的測(cè)定（小液流法） 20實(shí)驗(yàn)七植物根系活力的測(cè)定（TTC法） 22實(shí)驗(yàn)八根系總吸收面積和活躍吸收面積的測(cè)定 24實(shí)驗(yàn)九離體葉綠體的制備以及完整度的測(cè)定 27實(shí)驗(yàn)十葉綠體色素的提取、分離和理化性質(zhì) 32實(shí)驗(yàn)十一植物葉片光合速率的測(cè)定（改良半葉法） 36實(shí)驗(yàn)十二氧電極法測(cè)定植物組織的光合與呼吸速率 39實(shí)驗(yàn)十三小籃子法（廣口瓶法）測(cè)定植物的呼吸速率 43實(shí)驗(yàn)十四谷物淀粉含量的測(cè)定（旋光法） 45實(shí)驗(yàn)十五類(lèi)似生長(zhǎng)素對(duì)種子萌發(fā)的影響 47實(shí)驗(yàn)十六赤霉素對(duì)α-淀粉酶的誘導(dǎo)形成 48實(shí)驗(yàn)十七植物種子生活力快速測(cè)定 50實(shí)驗(yàn)十八植物光周期現(xiàn)象的觀察 54實(shí)驗(yàn)十九植物抗逆性的測(cè)定（電導(dǎo)儀法） 55實(shí)驗(yàn)二十脯氨酸含量的測(cè)定 57實(shí)驗(yàn)二一丙二醛(MDA)含量的測(cè)定 59實(shí)驗(yàn)二二GUS活性檢測(cè) 61附錄 64主要參考文獻(xiàn) 67

植物材料的采集、處理與保存植物生理實(shí)驗(yàn)使用的材料非常廣泛，根據(jù)來(lái)源可劃分為天然的植物材料（如植物幼苗、根、莖、葉、花等器官或組織等）和人工培養(yǎng)、選育的植物材料（如雜交種、誘導(dǎo)突變種、植物組織培養(yǎng)突變型細(xì)胞、愈傷組織、酵母等）兩大類(lèi)；按其水分狀況、生理狀態(tài)可劃分為新鮮植物材料（如蘋(píng)果、梨、桃果肉，蔬菜葉片，綠豆、豌豆芽下胚軸，麥芽、谷芽，鱗莖、花椰菜等）和干材料（小麥面粉，玉米粉，大豆粉，根、莖、葉干粉，干酵母等）兩大類(lèi)，因?qū)嶒?yàn)?zāi)康暮蜅l件不同，而加以選擇。植物材料的采集和處理，是植物生理研究測(cè)定中的重要環(huán)節(jié)。在實(shí)際工作中，往往容易把注意力集中在具體的儀器測(cè)定上，而對(duì)于如何正確地采集和處理樣品卻不夠注意，結(jié)果導(dǎo)致了較大的實(shí)驗(yàn)誤差，甚至造成整個(gè)測(cè)定結(jié)果的失敗。因此，必須對(duì)樣品的采集、處理與保存給予足夠的重視。一、原始樣品及平均樣品的采取、處理植物生理研究測(cè)定結(jié)果的可靠性（或準(zhǔn)確性），首先取決于試材對(duì)總體的代表性，如果采樣缺乏代表性，那么測(cè)定所得數(shù)據(jù)再精確也沒(méi)有意義。所以，樣品的采集除必須遵循田間試驗(yàn)抽樣技術(shù)的一般原則外，還要根據(jù)不同測(cè)定項(xiàng)目的具體要求，正確采集所需試材。目前，隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)該不斷提高采樣技術(shù)的水平。在作物苗期的許多生理測(cè)定項(xiàng)目中都需要采集整株的試材樣品，在作物中后期的一些生理測(cè)定項(xiàng)目中，如作物群體物質(zhì)生產(chǎn)的研究，也需要采集整株的試材樣品，有時(shí)雖然是測(cè)定植株的部分器官，但為了維持器官的正常生理狀態(tài)，也需要進(jìn)行整株采樣。除研究作物群體物質(zhì)生產(chǎn)外，對(duì)于作物生理過(guò)程的研究來(lái)說(shuō)，許多生理指標(biāo)測(cè)定中的整株采樣，也只是對(duì)地上部分的采樣，沒(méi)有必要連根采樣，當(dāng)然對(duì)根系的研究測(cè)定例外。采樣時(shí)間因研究目的而不同，如按生育時(shí)期或某一特殊需要的時(shí)間進(jìn)行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株應(yīng)是能代表試驗(yàn)小區(qū)正常生育無(wú)損傷的健康植株。為了保證植物材料的代表性，必須運(yùn)用科學(xué)方法采取材料。從大田或?qū)嶒?yàn)地、實(shí)驗(yàn)器皿中采取的植物材料，稱(chēng)為“原始樣品”，再按原始樣品的種類(lèi)（如植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等）分別選出“平均樣品”，然后根據(jù)分析的目的、要求和樣品種類(lèi)的特征，采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑥摹捌骄鶚悠贰敝羞x出供分析用的“分析樣品”。（一）原始樣品的取樣法1.隨機(jī)取樣在試驗(yàn)區(qū)（或大田）中選擇有代表性的取樣點(diǎn)，取樣點(diǎn)的數(shù)目視田塊的大小而定。選好點(diǎn)后，隨機(jī)采取一定數(shù)量的樣株，或在每一個(gè)取樣點(diǎn)上按規(guī)定的面積從中采取樣株。2.對(duì)角線取樣在試驗(yàn)區(qū)（或大田）可按對(duì)角線選定五個(gè)取樣點(diǎn)，然后在每個(gè)點(diǎn)上隨機(jī)取一定數(shù)量的樣株，或在每個(gè)取樣點(diǎn)上按規(guī)定的面積從中采取樣株。（二）平均樣品的取樣法1.混合取樣法一般顆粒狀（如種子等）或已碾磨成粉末狀的樣品可以采取混合取樣法進(jìn)行。具體的做法為：將供采取樣品的材料鋪在木板（或玻璃板、牛皮紙）上成為均勻的一層，按照對(duì)角線劃分為四等分。取對(duì)角的兩份為進(jìn)一步取樣的材料，而將其余的對(duì)角兩份淘汰。再將已取中的兩份樣品充分混合后重復(fù)上述方法取樣。反復(fù)操作，每次均淘汰50％的樣品，直至所取樣品達(dá)到所要求的數(shù)量為止。這種取樣的方法叫做“四分法”。一般禾谷類(lèi)、豆類(lèi)及油料作物的種子均可采用這個(gè)方法采取平均樣品，但注意樣品中不要混有不成熟的種子及其他混雜物。2.按比例取樣法有些作物、果品等材料，在生長(zhǎng)不均等的情況下，應(yīng)將原始樣品按不同類(lèi)型的比例選取平均樣品。例如對(duì)甘薯、甜菜、馬鈴薯等塊根、塊莖材料選取平均樣品時(shí)，應(yīng)按大、中、小不同類(lèi)型的樣品的比例取樣，然后再將每一單個(gè)樣品縱切剖開(kāi)，每個(gè)切取1/4、1/8或1/16，混在一起組成平均樣品。在采取果實(shí)的平均樣品時(shí)，如桃、梨、蘋(píng)果、柑橘等果實(shí)，即使是從同一株果樹(shù)上取樣，也應(yīng)考慮到果枝在樹(shù)冠上的各個(gè)不同方位和部位以及果實(shí)體積的大、中、小和成熟度上的差異，按各自相關(guān)的比例取樣，再混合成平均樣品。（三）取樣注意事項(xiàng)1.取樣的地點(diǎn)，一般在距田埂或地邊一定距離的株行取樣，或在特定的取樣區(qū)內(nèi)取樣。取樣點(diǎn)的四周不應(yīng)該有缺株的現(xiàn)象。2.取樣后，按分析的目的分成各部分（如根、莖、葉、果等），然后捆齊，并附上標(biāo)簽，裝入紙袋。有些多汁果實(shí)取樣時(shí)，應(yīng)用鋒利的不銹鋼刀剖切，并注意勿使果汁流失。3.對(duì)于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等樣品，因含水分較多，容易變質(zhì)或霉?fàn)€，可以在冰箱中冷藏，或進(jìn)行滅菌處理或烘干以供分析之用。4.選取平均樣品的數(shù)量應(yīng)當(dāng)不少于供分析用樣品的兩倍。5.為了動(dòng)態(tài)地了解供試驗(yàn)用的植物在不同生育期的生理狀況，常按植物不同的生育期采取樣品進(jìn)行分析。取樣方法系在植物的不同生育時(shí)期先調(diào)查植株的生育狀況并區(qū)分為若干類(lèi)型，計(jì)算出各種類(lèi)型植株所占的百分比，再按此比例采取相應(yīng)數(shù)目的樣株作為平均樣品。二、分析樣品的處理和保存1．從田間采取的植株樣品，或是從植株上采取的器官組織樣品，在正式測(cè)定之前的一段時(shí)間里，如何正確妥善的保存和處理是很重要的，它也關(guān)系到測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般測(cè)定中，所取植株樣品應(yīng)該是生育正常無(wú)損傷的健康材料。取下的植株樣品或器官組織樣品，必須放入事先準(zhǔn)備好的保濕容器中，以維持試樣的水分狀況和未取下之前基本一致。否則，由于取樣后的失水，特別是在田間取樣帶回室內(nèi)的過(guò)程中，由于強(qiáng)烈失水，使離體材料的許多生理過(guò)程發(fā)生明顯的變化，用這樣的試材進(jìn)行測(cè)定，就不可能得到正確可靠的結(jié)果。為了保持正常的水分狀況，在剪取植株樣品后，應(yīng)立即插入有水的桶中，對(duì)于枝條，還應(yīng)該立即在水中進(jìn)行第二次剪切，即將第一次切口上方的一段在水中剪去，以防輸導(dǎo)組織中水柱被拉斷，影響正常的水分運(yùn)輸。對(duì)于器官組織樣品，如葉片或葉組織，在取樣后就應(yīng)立即放入已鋪有濕紗布帶蓋的瓷盤(pán)中，或鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中。對(duì)于干旱研究的有關(guān)試材，應(yīng)盡可能維持其原來(lái)的水分狀況。采回的新鮮樣品（平均樣品）在做分析之前，一般先要經(jīng)過(guò)凈化、殺青、烘干（或風(fēng)干）等一系列處理。（1）凈化：新鮮樣品從田間或試驗(yàn)地取回時(shí)，常沾有泥土等雜質(zhì)，應(yīng)用柔軟濕布擦凈，不應(yīng)用水沖洗。（2）殺青：為了保持樣品化學(xué)成分不發(fā)生轉(zhuǎn)變和損耗，應(yīng)將樣品置于105℃的烘箱中烘15min以終止樣品中酶的活動(dòng)。（3）烘干：樣品經(jīng)過(guò)殺青之后，應(yīng)立即降低烘箱的溫度，維持在70-80℃，直到烘至恒重。烘干所需的時(shí)間因樣品數(shù)量和含水量、烘箱的容積和通風(fēng)性能而定。在無(wú)烘箱的條件下，也可將樣品置蒸籠中以蒸汽殺青，而后于陰涼通風(fēng)處風(fēng)干。但在蒸汽殺青過(guò)程中，常有可溶性物質(zhì)的外滲損失，因此，此法僅可作為測(cè)量大量樣品干重時(shí)的變通方法，在進(jìn)行成分分析時(shí)應(yīng)盡量避免。烘干時(shí)應(yīng)注意溫度不可過(guò)高，否則會(huì)把樣品烤焦，特別是含糖較多的樣品，在高溫下更易焦化。為了更精密地分析，避免某些成分的損失（如蛋白質(zhì)、維生素、糖等），在條件許可的情況下最好采用真空干燥法。此外，在測(cè)定植物材料中酶的活性或某些成分（如維生素C、DNA、RNA等）的含量時(shí)，需要用新鮮樣品。取樣時(shí)注意保鮮，取樣后應(yīng)立即進(jìn)行待測(cè)組分提??；也可采用液氮中冷凍保存或冰凍真空干燥法得到干燥的制品。放在0-4℃冰箱中保存即可。在鮮樣已進(jìn)行了勻漿，尚未完成提取、純化，不能進(jìn)行分析測(cè)定等特殊情況下，也可加入防腐劑（甲苯、苯甲酸），以液態(tài)保存在緩沖液中，置于0-4℃冰箱即可。但保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。2．已經(jīng)烘干（或風(fēng)干）的樣品，可根據(jù)樣品的種類(lèi)、特點(diǎn)進(jìn)行以下處理：（1）種子樣品的處理：一般種子（如禾谷類(lèi)種子）的平均樣品清除雜質(zhì)后要進(jìn)行磨碎，在磨碎樣品前后都應(yīng)徹底清除磨粉機(jī)（或其他碾磨用具）內(nèi)部的殘留物，以免不同樣品之間的機(jī)械混雜，也可將最初磨出的少量樣品棄去，然后正式磨碎，最后使樣品全部無(wú)損地通過(guò)1mm篩孔的篩子，混合均勻作為分析樣品貯存于具有磨口玻塞的廣口瓶中，貼上標(biāo)簽，注明樣品的采取地點(diǎn)、試驗(yàn)處理、采樣日期和采樣人姓名等。長(zhǎng)期保存的樣品，貯存瓶上的標(biāo)簽還需要涂蠟。為防止樣品在貯存期間生蟲(chóng)，可在瓶中放置一點(diǎn)樟腦或?qū)ξ欢燃妆?。?duì)于油料作物種子（如芝麻、亞麻、花生、蓖麻等）需要測(cè)定其含油量時(shí)，不應(yīng)當(dāng)用磨粉機(jī)磨碎，否則樣品中所含的油分會(huì)吸附在磨粉機(jī)上將明顯地影響分析的準(zhǔn)確性。所以，對(duì)于油料種子應(yīng)將少量樣品放在研缽內(nèi)研碎或用切片機(jī)切成薄片作為分析樣品。（2）莖稈樣品的處理：烘干（或風(fēng)干）的莖稈樣品，均要進(jìn)行磨碎，磨莖稈用的電磨與磨種子的磨粉機(jī)結(jié)構(gòu)不同，不宜用磨種子的電磨來(lái)磨碎莖稈。如果莖稈樣品的含水量偏高而不利于磨碎時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步烘干后再進(jìn)行磨碎。（3）多汁樣品的處理：柔嫩多汁樣品（如漿果、瓜、菜、塊根、塊莖、球莖等）的成分（如蛋白質(zhì)、可溶性糖、維生素、色素等）很容易發(fā)生代謝變化和損失，因此常用其新鮮樣品直接進(jìn)行各項(xiàng)測(cè)定及分析。一般應(yīng)將新鮮的平均樣品切成小塊，置于電動(dòng)搗碎機(jī)的玻璃缸內(nèi)進(jìn)行搗碎。若樣品含水量不夠（如甜菜、甘薯等）可以根據(jù)樣品重加入0.1-1倍的蒸餾水。充分搗碎后的樣品應(yīng)成漿狀，從中取出混合均勻的樣品進(jìn)行分析。如果不能及時(shí)分析，最好不要急于將其搗碎，以免其中化學(xué)成分發(fā)生變化而難以準(zhǔn)確測(cè)定。有些蔬菜（如含水分不太多的葉菜類(lèi)、豆類(lèi)、干菜等）的平均樣品可以經(jīng)過(guò)干燥磨碎，也可以直接用新鮮樣品進(jìn)行分析。若采用新鮮樣品，可采用上述方法在電動(dòng)搗碎機(jī)內(nèi)搗碎，也可用研缽（必要時(shí)加少許干凈的石英砂）充分研磨成勻漿，再進(jìn)行分析。在進(jìn)行新鮮材料的活性成分（如酶活性）測(cè)定時(shí)，樣品的勻漿、研磨一定要在冰浴上或低溫室內(nèi)操作。新鮮樣品采后來(lái)不及測(cè)定的，可放入液氮中速凍，再放入﹣70℃冰箱中保存。供試樣品一般應(yīng)該在暗處保存，但是，對(duì)于供光合、蒸騰、氣孔阻力等的測(cè)定樣品，在光下保存更為合理。一般可將這些供試樣品保存在室內(nèi)光強(qiáng)下，但從測(cè)定前的0.5-1.0小時(shí)開(kāi)始，應(yīng)對(duì)這些材料進(jìn)行測(cè)定前的光照預(yù)處理，也叫光照前處理。這不僅是為了使氣孔能正常開(kāi)放，也是為了使一些光合酶類(lèi)能預(yù)先被激活，以便在測(cè)定時(shí)能獲得正常水平的值，而且還能縮短測(cè)定時(shí)間。光照前處理的光強(qiáng)，一般應(yīng)和測(cè)定時(shí)的光照條件一致。測(cè)定材料在取樣后，一般應(yīng)在當(dāng)天測(cè)定使用，不應(yīng)該過(guò)夜保存。需要過(guò)夜時(shí)，也應(yīng)在較低溫度下保存，但在測(cè)定前應(yīng)使材料溫度恢復(fù)到測(cè)定條件的溫度。對(duì)于采集的籽粒樣品，在剔除雜質(zhì)和破損籽粒后，一般可用風(fēng)干法進(jìn)行干燥。但有時(shí)根據(jù)研究的要求，也可立即烘干。對(duì)葉片等組織樣品，在取樣后則應(yīng)立即烘干。為了加速烘干，對(duì)于莖稈、果穗等器官組織應(yīng)事先切成細(xì)條或碎塊。實(shí)驗(yàn)一擬南芥種植和形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)原理擬南芥屬(Arabidopsisthaliana）十字花科，被子植物門(mén)，雙子葉植物綱。二年生草本，高7-40厘米。基生葉有柄呈蓮座狀，葉片倒卵形或匙形；莖生葉無(wú)柄，披針形或線形?？偁罨ㄐ蝽斏?，花瓣4片，白色，匙形。長(zhǎng)角果線形，長(zhǎng)1-1.5厘米?；ㄆ?-5月。我國(guó)內(nèi)蒙、新疆、陜西、甘肅、西藏、山東、江蘇、安徽、湖北、四川、云南等省區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。擬南芥的優(yōu)點(diǎn)是植株?。?個(gè)茶杯可種植好幾棵）、每代時(shí)間短（從發(fā)芽到開(kāi)花不超過(guò)6周）、結(jié)籽多（每棵植物可產(chǎn)很多粒種子）、生活力強(qiáng)（用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)）。擬南芥的基因組是目前已知植物基因組的1/80，這就使克隆它的的有關(guān)基因相對(duì)說(shuō)來(lái)比較容易。擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。例如用含殺草劑的培養(yǎng)基來(lái)篩選，一般獲得抗殺草劑的突變率是1/100000。由于上述這些優(yōu)點(diǎn)，所以，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究，已成為一種典型的模式植物。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料：擬南芥種子（二）試劑：PNS營(yíng)養(yǎng)液（1L）母液毫升母液15母液22母液32母液42.5母液52.5母液61PNS營(yíng)養(yǎng)液母液配方母液1：1MKNO3101.1g母液2：1MCa(NO3)2˙4H2O236.15g母液3：1MMgSO4˙7H2O246.48g母液4：20mMFe.EDTA：FeSO45.57gEDTA7.45g注意先各自配成溶液，再混合。母液5：1M磷酸緩沖液（pH5.5）：磷酸二氫鉀130.4g磷酸氫二鉀9.12g母液6：MS微量元素硼酸0.434g硫酸錳（MnSO4H2O）1.7626gCuSO4˙H2O0.0798gZnSO4˙7H2O0.172gNaMoO4˙2H2O0.0432gNaCl0.585gCoCl˙6H2O0.00129g以上母液均配至1L，配制時(shí)使用滅菌的雙蒸水。配制后4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。人工土?份蛭石，1份珍珠巖和1份黑土混合。（三）儀器設(shè)備：培養(yǎng)皿，鑷子，托盤(pán)，保鮮膜，花盆，人工氣候箱。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.將春化過(guò)的擬南芥種子種于澆過(guò)飽和PNS營(yíng)養(yǎng)液的人工土中，并用保鮮膜罩上。兩天后光照，三天后揭膜。2.人工培養(yǎng)室條件：相對(duì)濕度80%，恒溫20-24℃，光照強(qiáng)度80-200umol/M2/S，光照周期為8h黑暗﹑16h光照培養(yǎng)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果每隔三天觀察生長(zhǎng)情況，并適時(shí)澆水。按照下表記錄擬南芥的生長(zhǎng)情況。株高（cm）葉片花果莢收獲第1天第4天第7天第10天第13天第16天第19天第22天第25天第28天第31天第34天第37天第40天第43天第47天第50天第53天第56天第60天五、思考題1.繪制擬南芥的株高的生長(zhǎng)曲線。2.為什么說(shuō)擬南芥是模式植物？3.擬南芥的特點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)二植物細(xì)胞的活體染色和死活的鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理用某種對(duì)植物無(wú)害的染料稀溶液對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色稱(chēng)活體染色。中性紅（2-甲基-3-氨基-6-二甲氨基二氮雜蒽鹽酸鹽,3-氨基-6-二甲氨基-2-甲基吩嗪鹽酸鹽，Neutralred,Neutralredchloride,Toluylenered,Aminodimethylaminotoluaminozine,3-Amino-6-dimethylamino-2-methylphenazinehydrochloride。分子式：C15H17ClN4；分子量：288.78。）是常用的活體染料之一。深綠色、棕色或淺黑色結(jié)晶粉末。溶解度為水4.0％，無(wú)水乙醇1.8％，乙二醇乙醚3.75％，乙二醇3.0％。幾乎不溶于二甲苯，其水溶液或乙醇溶液呈紅色。中性紅是一種弱堿性染色劑，變色范圍在pH6.4-8.0之間（由紅變成黃）。在中性或微堿性環(huán)境下，植物的活細(xì)胞原生質(zhì)能大量吸收中性紅并向液泡排泄，液泡一般呈酸性，中性紅解離出大量陽(yáng)離子而呈櫻桃紅色，而原生質(zhì)及壁不染色；死細(xì)胞的液泡已消失因而不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象，中性紅陽(yáng)離子卻與帶一定負(fù)電荷的原生質(zhì)及細(xì)胞核結(jié)合而使原生質(zhì)及細(xì)胞核染色。成長(zhǎng)的細(xì)胞是一個(gè)滲透系統(tǒng)，活的原生質(zhì)具有選擇透性，原生質(zhì)內(nèi)部包含著一個(gè)大液泡，具有一定的溶質(zhì)勢(shì)。當(dāng)細(xì)胞與外界低水勢(shì)溶液接觸時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的水分外滲，原生質(zhì)隨著液泡一起收縮而發(fā)生質(zhì)壁分離；其后，當(dāng)與清水（或高水勢(shì)溶液）接觸，細(xì)胞又因液泡的吸水膨脹而發(fā)生質(zhì)壁分離復(fù)原。死細(xì)胞因其原生質(zhì)的選擇透性已遭破壞，故與低水勢(shì)溶液接觸時(shí)不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。二、材料、儀器設(shè)備及試劑1.材料：洋蔥；2.儀器設(shè)備：不銹鋼單面刀片；鑷子；吸水紙；酒精燈；載玻片；蓋玻片；膠頭滴管；顯微鏡；3.試劑：0.8mol·L－1蔗糖液；0.1％中性紅溶液母液。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.制片染色選擇一片比較幼嫩的洋蔥鱗片，用單面刀片在鱗片內(nèi)側(cè)割劃成0.5cm2左右的小塊，用尖頭鑷子輕輕地撕取洋蔥（玉蔥）鱗片內(nèi)表皮薄片，浸到0.03％中性紅溶液中10-15min進(jìn)行染色。2.觀察2.1將染色后的植物材料放到載玻片上，用弱堿性水略加清洗后，蓋好蓋玻片，在蓋玻片的一側(cè)滴加去離子水（或pH略高于7.0的自來(lái)水），然后在顯微鏡下觀察，可以看出液泡染成櫻桃紅色；原生質(zhì)層（細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞）則無(wú)色透明緊貼細(xì)胞壁（注意：在細(xì)胞的角隅上可以看見(jiàn)）。2.2在第1項(xiàng)觀察后，接著從蓋玻片的一邊滴2滴0.8mol·L－1蔗糖液,在蓋玻片的另一邊用吸水紙吸蓋玻片下的水，將蔗糖液引入蓋玻片下浸漬植物材料，并立即鏡檢，可以看到細(xì)胞很快發(fā)生質(zhì)壁分離。先是凹形質(zhì)壁分離，而后變?yōu)橥剐钨|(zhì)壁分離。2.3在第2項(xiàng)觀察后，接著在蓋玻片的一邊加入2-3滴去離子水，在另一邊用吸水紙吸去糖液，將去離子水引入蓋玻片底，立即鏡檢可以看到帶有液泡的原生質(zhì)體重新吸水膨大，最后充滿整個(gè)細(xì)胞腔，即質(zhì)壁分離復(fù)原（復(fù)原緩慢進(jìn)行時(shí)，細(xì)胞仍可正常存活；如果進(jìn)行很快，則會(huì)因原生質(zhì)機(jī)械破壞而死亡，注意觀察機(jī)械損傷的細(xì)胞的特點(diǎn)）。2.4將一片經(jīng)中性紅染色的植物材料放在載玻片上，加一滴去離子水后加蓋玻片，在酒精燈火焰上微微加熱，然后在顯微鏡下觀察，可以看到細(xì)胞質(zhì)凝結(jié)成不均勻的凝膠狀，與細(xì)胞核一起染成紅色。然后按(2.2)法加0.8mol·L－1蔗糖液也不發(fā)生質(zhì)壁分離。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果收集照片。五、思考題1.活體細(xì)胞觀察應(yīng)該注意什么？2.機(jī)械損傷后的細(xì)胞有什么特點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)三植物原生質(zhì)體的分離和融合實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握原生質(zhì)體分離的方法；2、了解并掌握利用PEG原生質(zhì)體融合的原理和方法。一、實(shí)驗(yàn)原理：植物原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)在理論和實(shí)踐上都有很大的意義，在植物遺傳工程和育種研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。它是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一，它不僅能克服遠(yuǎn)源雜交有性不親和障礙，也可克服傳統(tǒng)的通過(guò)有性雜交誘導(dǎo)多倍體植株的麻煩，最終將野生種的遠(yuǎn)源基因?qū)朐耘喾N中，原生質(zhì)體融合技術(shù)可望成為作物改良的有力工具之一。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)方法起源于植物單細(xì)胞的培養(yǎng)方法。1954年，植物單細(xì)胞培養(yǎng)才獲得成功。Mllir培養(yǎng)的萬(wàn)壽菊及煙草懸浮細(xì)胞植入到長(zhǎng)有愈傷組織的培養(yǎng)基上得到了它們的單細(xì)胞克隆，并建立了看護(hù)培養(yǎng)的方法；1960年，Jone等建立了微室培養(yǎng)法。同年，Cocking應(yīng)用酶法分離原生質(zhì)獲得成功，從而在實(shí)驗(yàn)條件下很容易獲得大量的原生質(zhì)體。隨著多種適用原生質(zhì)體分離的商品酶的出現(xiàn)，原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法也得到了不斷地改進(jìn)，現(xiàn)在常用的原生質(zhì)體培養(yǎng)方法有：液體淺層培養(yǎng)法、雙層培養(yǎng)法、瓊脂糖包埋法、瓊脂島培養(yǎng)法以及使用條件培養(yǎng)基或飼喂培養(yǎng)等。植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁后為原生質(zhì)所包圍的“裸露細(xì)胞”，是開(kāi)展基礎(chǔ)研究的理想材料。其中酶解法分離原生質(zhì)體是一個(gè)常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，除去細(xì)胞壁，即可得到原生質(zhì)體。由于原生質(zhì)體內(nèi)部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜,必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,還應(yīng)當(dāng)考慮取材、酶的種類(lèi)和純度、酶液的滲透壓、酶解時(shí)間及溫度等因素對(duì)分離原生質(zhì)體的影響。測(cè)定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法,FAD本身無(wú)熒光,無(wú)極性,可透過(guò)完整的原生質(zhì)膜。一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原生質(zhì)膜,因此有活力的細(xì)胞能產(chǎn)生熒光,無(wú)活力的原生質(zhì)體不能分解FAD無(wú)熒光產(chǎn)生。許多化學(xué)、物理學(xué)和生物學(xué)方法可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，現(xiàn)在被廣泛采用并證明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高鈣高pH法和電融合法；聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，20-50％的濃度能對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進(jìn)行清洗，使原生質(zhì)體融合得以完成。聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)的機(jī)理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚鍵而具有負(fù)極性，與水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等一些正極化基團(tuán)能形成氫鍵，當(dāng)聚乙二醇（PEG）分子足夠長(zhǎng)時(shí)，可作為臨近原生質(zhì)表面之間的分子橋而使之粘連、聚乙二醇（PEG）也能連接鈣等陽(yáng)離子，鈣可在一些負(fù)極化基團(tuán)和聚乙二醇（PEG）之間形成橋，因而促進(jìn)粘連。從而引起原生質(zhì)體融合：高鈣高pH由于增加了質(zhì)膜的流動(dòng)性，因而也大大提高了融合頻率，洗滌時(shí)滲透壓沖擊也可能起作用。原生質(zhì)體分離純化后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上應(yīng)用合適的培養(yǎng)方法，能夠再生細(xì)胞壁，并啟動(dòng)細(xì)胞持續(xù)分裂，直至形成細(xì)胞團(tuán)，長(zhǎng)成愈傷組織或胚狀體，再分化發(fā)育成苗。其中，選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法時(shí)原生質(zhì)體培養(yǎng)中最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。PEG為一種高分子化合物，能與水、蛋白質(zhì)、和碳水化合物等一些基團(tuán)能形成氫鍵。普遍認(rèn)為聚乙二醇分子能改變各類(lèi)細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類(lèi)分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：用法簡(jiǎn)單，容易獲得融合體，融合效果好。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備：（一）實(shí)驗(yàn)材料：（1）韭菜或大蒜葉；（2）紅辣椒（二）試劑：（1）20%蔗糖；（2）13%CPW洗液：27.2mg/L磷酸二氫鉀（KH2PO4）101.0mg/L硝酸鉀（KNO3）1480.0mg/L兩個(gè)結(jié)晶水的氯化鈣（CaCl2?2H2O）246.0mg/L硫酸鎂（MgSO4）0.16mg/L碘化鉀（KI）0.025mg/L硫酸銅（CuSO4）13%W/V甘露醇pH6.0（3）酶液：1%纖維素酶1%果膠酶0.7M甘露醇0.7mM磷酸二氫鉀（KH2PO4）10mM兩個(gè)結(jié)晶水的氯化鈣（CaCl2?2H2O）pH6.8-7.0（4）40%PEG液：40%PEG液（MW1500-6000）0.3M葡萄糖3.5mM兩個(gè)結(jié)晶水的氯化鈣（CaCl2?2H2O）0.7mM磷酸二氫鉀（KH2PO4）。（三）儀器設(shè)備：350目網(wǎng)，離心機(jī)，試管，離心管，吸管，顯微鏡，恒溫水浴鍋。三、實(shí)驗(yàn)步驟：植物原生質(zhì)體的分離與純化1、將撕去表皮的植物葉片或花瓣置于酶液（pH6.9,去表皮面接觸酶液），在25℃黑暗條件下，酶解1-2小時(shí)。2、用350目網(wǎng)過(guò)濾除去未完全消化的葉片等殘?jiān)?、在1000rpm條件下離心5分鐘，棄上清液。紅辣椒800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。加入3-4ml13%CPW洗液，相同條件下離心，棄上清液。加1ml13%CPW洗液懸浮。4、蔗糖漂浮法去除碎片。蔗糖漂浮方法：（1）用細(xì)口吸管吸20%蔗糖溶液約3ml，小心插入盛有原生質(zhì)體懸液的離心管底部，緩緩將蔗糖溶液擠出，由于比重不同，蔗糖溶液與原生質(zhì)體懸液中間有一明顯界面(注意要有明顯界面).(2)離心5分鐘（韭菜1000轉(zhuǎn)/分，辣椒800轉(zhuǎn)/分），此時(shí)死細(xì)胞及碎片降至蔗糖溶液內(nèi)，聚集在離心管底部，而活細(xì)胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面處，(3)用細(xì)管吸取漂浮在上下界面處的健康原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加入3-4ml13%CPW洗液離心（鏡檢決定是否需要離心），離心5分鐘（韭菜1000轉(zhuǎn)/分，辣椒800轉(zhuǎn)/分），收集沉淀，最終原生質(zhì)體體積控制在0.5ML左右。細(xì)胞融合1.不同的原生質(zhì)體各300μl與帶蓋離心管中，另加入300μl40%PEG液，30℃水浴中溫浴15min；2.融合液一滴于載玻片上(注意保持一定濕度，不能太干)，輕輕蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用光學(xué)顯微鏡或倒置顯微鏡(高倍)觀察2-3個(gè)細(xì)胞靠近或融合的過(guò)程。（觀察時(shí)注意不同程度的融合現(xiàn)象。通常分為五個(gè)階段。①兩細(xì)胞膜接觸，粘連；②細(xì)胞膜形成穿孔；③兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通；④通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體；⑤細(xì)胞完全合并，形成一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。）五、思考題1.繪制原生質(zhì)體融合的基本過(guò)程；2.簡(jiǎn)述細(xì)胞融合的原理3.做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)注意哪些問(wèn)題？實(shí)驗(yàn)四植物葉面積測(cè)定原理、方法和步驟植物的生長(zhǎng)與葉面積密切相關(guān)，一方面葉面積的大小影響了植物的光合物質(zhì)積累，另一方面掌握的生長(zhǎng)又通過(guò)葉面積的變化得到體現(xiàn)，因此測(cè)定植物的葉面積對(duì)于植物的生長(zhǎng)生理、光合生理和逆境生理具有重要的意義。一、實(shí)驗(yàn)原理植物的生長(zhǎng)與葉面積密切相關(guān)，一方面葉面積的大小影響了植物的光合物質(zhì)積累，另一方面掌握的生長(zhǎng)又通過(guò)葉面積的變化得到體現(xiàn)，因此測(cè)定植物的葉面積對(duì)于植物的生長(zhǎng)生理、光合生理和逆境生理具有重要的意義。可以用葉面積儀直接測(cè)定，沒(méi)有條件的試驗(yàn)室也可以通過(guò)測(cè)量、稱(chēng)重的方法測(cè)得。二、材料與用品校園里各種植物葉片直尺、剪刀、復(fù)印紙、電子天平等三、方法與步驟1、從葉片基部用剪刀小心剪取10片葉片。2、用直尺量取每一片葉的最長(zhǎng)處為葉長(zhǎng)、最寬處為葉寬，記錄下來(lái)。3、將葉片固定在復(fù)印紙上，用鉛筆沿葉緣將葉片形狀描下來(lái)，用剪刀剪下來(lái)。4、將剪下的紙葉子在電子天平上稱(chēng)重，記錄。5、稱(chēng)出一張復(fù)印紙的質(zhì)量，測(cè)量出長(zhǎng)和寬，計(jì)算出紙的面積，然后換算出每克重量所對(duì)應(yīng)的紙面積。6、將剪下來(lái)的紙葉子的質(zhì)量換算成面積，是為每片葉的面積。7、用每片葉的面積除以其長(zhǎng)度與寬度的乘積，可以得到一個(gè)小于1的系數(shù)，該系數(shù)與葉片的形狀有關(guān)，稱(chēng)為形狀系數(shù)或校正因子，計(jì)算10片葉子的形狀系數(shù)，算出其平均值。在以后的測(cè)量中，可以只用直尺測(cè)量該種植物葉片的長(zhǎng)和寬，二者的乘積乘以形狀系數(shù)，即為葉面積。8、測(cè)定形狀不規(guī)則葉片的葉面積可按照上述1，2，3，4，5，6步操作。四、結(jié)果與分析測(cè)量出葉片的長(zhǎng)和寬，計(jì)算出葉面積和形狀系數(shù)。實(shí)驗(yàn)五植物細(xì)胞滲透勢(shì)的測(cè)定（質(zhì)壁分離法）一、實(shí)驗(yàn)原理植物細(xì)胞的滲透勢(shì)主要取決于液泡的溶質(zhì)濃度，因此又稱(chēng)溶質(zhì)勢(shì)。滲透勢(shì)與植物水分代謝、生長(zhǎng)及抗逆性等有密切關(guān)系。已知在干旱、鹽漬等條件下，一些植物常在細(xì)胞內(nèi)主動(dòng)積累溶質(zhì)，以降低其滲透勢(shì)，增加吸水能力，而在一定程度上維持細(xì)胞膨壓，保障細(xì)胞的生長(zhǎng)和氣孔的開(kāi)放，這種現(xiàn)象叫做滲透調(diào)節(jié)作用。滲透調(diào)節(jié)能力的大小可以用逆境條件下細(xì)胞的滲透勢(shì)的降低值來(lái)表示，在水分生理與抗逆性生理研究中經(jīng)常需要測(cè)定植物細(xì)胞的滲透勢(shì)。將植物組織放入一系列不同濃度的蔗糖溶液中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，植物細(xì)胞與蔗糖溶液間將達(dá)到滲透平衡狀態(tài)。如果在某一溶液中細(xì)胞脫水達(dá)到平衡時(shí)剛好處于臨界質(zhì)壁分離狀態(tài)，則細(xì)胞的壓力勢(shì)（Ψp）將下降為零。此時(shí)細(xì)胞液的滲透勢(shì)（Ψs）等于外液的滲透勢(shì)Ψs0。此溶液稱(chēng)為該組織的等滲溶液，其濃度稱(chēng)為該組織的等滲濃度，即可計(jì)算出細(xì)胞液的滲透勢(shì)（Ψs）。實(shí)際測(cè)定時(shí)，因?yàn)榕R界質(zhì)壁分離狀態(tài)難以在顯微鏡下直接觀察到，所以一般均以初始質(zhì)壁分離作為判斷等滲濃度的標(biāo)準(zhǔn)。處于初始質(zhì)壁分離狀態(tài)的細(xì)胞體積，比吸水飽和時(shí)略小，故細(xì)胞液濃縮而滲透勢(shì)略低于吸水飽和狀態(tài)時(shí)的滲透勢(shì)稱(chēng)基態(tài)滲透勢(shì)。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料紫皮洋蔥鱗莖（二）試劑1．1mol/L蔗糖水溶液：稱(chēng)取預(yù)先在60-80℃下烘干的蔗糖34.2g溶于60ml蒸餾水中，定容到100ml。2．0.03％中性紅溶液。3．蔗糖系列標(biāo)準(zhǔn)液：取干燥潔凈的小試劑瓶7支編號(hào)，用1mol/L蔗糖水溶液依據(jù)C1×V1=C2×V2公式配制0.35mol/L、0.40mol/L、0.45mol/L、0.50mol/L、0.55mol/L、0.60mol/L、0.65mol/L等一系列不同濃度的蔗糖水溶液（具體范圍可根據(jù)材料不同而加以調(diào)整），貯于試劑瓶中，瓶口加塞以防蒸發(fā)濃縮。取不同濃度的蔗糖溶液10ml稱(chēng)重，計(jì)算其密度。（三）儀器設(shè)備顯微鏡，載玻片，蓋玻片，溫度計(jì)，尖頭鑷子，刀片，直徑6cm小培養(yǎng)皿，試劑瓶若干，燒杯，容量瓶，量筒，吸管，吸水紙適量。三、實(shí)驗(yàn)步驟1．取干燥、潔凈的培養(yǎng)皿7套編號(hào)，將配制好的不同濃度的蔗糖溶液約5ml按順序加入各培養(yǎng)皿，使之成一薄層，蓋好皿蓋備用。2．用鑷子撕?。ɑ蛴玫镀稳。┕┰嚥牧系谋砥?，大小約0.5cm2，迅速分別投入各種濃度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，每一濃度4-5片。同時(shí)記錄室溫。為了便于觀察，可先將切片于0.03%中性紅內(nèi)染色5min左右，吸去水分，再浸入蔗糖溶液中，但如不染色即能區(qū)別質(zhì)壁分離時(shí)，仍以不染色為宜。3．5-10min后，取出表皮薄片放在滴有同樣溶液的載玻片上，蓋上蓋玻片，于低倍顯微鏡下觀察，如果所有細(xì)胞都產(chǎn)生質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，則取低濃度溶液中的制片作同樣觀察，并記錄質(zhì)壁分離的相對(duì)程度。如果在兩個(gè)相鄰濃度的切片中，一個(gè)沒(méi)有發(fā)生質(zhì)壁分離或質(zhì)壁分離的細(xì)胞不足50%，另一個(gè)發(fā)生質(zhì)壁分離的細(xì)胞數(shù)超過(guò)50%，則可粗略地將這兩個(gè)濃度的平均值作為其等滲濃度，也可用插值法更準(zhǔn)確地確定等滲濃度。每一制片觀察的細(xì)胞不應(yīng)少于100個(gè)。檢查時(shí)可先從中間濃度開(kāi)始。在找到上述濃度極限時(shí)，用新的溶液和新鮮的葉片重復(fù)進(jìn)行幾次，直至有把握確定為止。在此條件下，細(xì)胞的滲透勢(shì)與兩個(gè)極限溶液濃度之平均值的滲透勢(shì)相等。4．也可用CaCl2或NaCl代替蔗糖，但須改變式中等滲系數(shù)。CaCl2的i值可用2.6，NaCl一般為1.8。將結(jié)果記錄于下表中。植物細(xì)胞滲透勢(shì)測(cè)定記載表實(shí)驗(yàn)人日期材料名稱(chēng)實(shí)驗(yàn)室溫度蔗糖濃度（mol/kg）滲透勢(shì)（Mpa）質(zhì)壁分離細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)*100%0.350.400.450.500.550.600.65四、結(jié)果計(jì)算由所得到的等滲濃度和測(cè)定的室溫，用下式計(jì)算供試溶液的滲透勢(shì)（Ψs0），即為細(xì)胞的滲透勢(shì)（Ψs）。Ψs（MPa）=Ψs0=-iCRT式中，Ψs0——供試溶液的滲透勢(shì)，MPa。i——解離系數(shù)，蔗糖=1。C——供試溶液的濃度，mol/L（以水作溶劑）。R——?dú)怏w常數(shù)，0.008314[L·MPa／（mol·K）]。T——絕對(duì)溫度，（273+t℃），K。五、思考題1、某種植物葉片吸水飽和時(shí)的滲透勢(shì)經(jīng)測(cè)定為﹣0.8MPa，現(xiàn)用質(zhì)壁分離法測(cè)出其滲透勢(shì)為﹣0.9MPa，請(qǐng)計(jì)算質(zhì)壁分離狀態(tài)的細(xì)胞液體積相當(dāng)于飽和時(shí)的百分?jǐn)?shù)。2、試問(wèn)不同植物材料得滲透勢(shì)是否相同？

實(shí)驗(yàn)六植物組織水勢(shì)的測(cè)定（小液流法）一、實(shí)驗(yàn)原理水勢(shì)（waterpotential）表示水分的化學(xué)勢(shì),象電流之由高電位處流向低電位處一樣，水從水勢(shì)高處流向低處(代表水的能量水平)。植物體組織之間，細(xì)胞之間以及植物體及環(huán)境間的水分移動(dòng)方向都由水勢(shì)差決定。當(dāng)植物細(xì)胞或組織放在溶液中時(shí)，如果植物的水勢(shì)小于溶液的滲透勢(shì)(溶質(zhì)勢(shì))，則組織吸水而使溶液濃度變大；反之,則植物細(xì)胞內(nèi)水分外流而使溶液濃度變小；若植物組織的水勢(shì)與溶液的滲透勢(shì)相等，則二者水分保持動(dòng)態(tài)平衡，外部溶液濃度不變，此溶液的滲透勢(shì)即等于所測(cè)植物的水勢(shì)。可以利用溶液的濃度不同其比重也不同的原理來(lái)測(cè)定試驗(yàn)前后溶液濃度的變化。然后根據(jù)公式計(jì)算其滲透勢(shì)。因溶液的濃度是已知的，可以根據(jù)公式算出其滲透壓，取其負(fù)值，為溶液的滲透勢(shì)（ψπ），即代表植物的水勢(shì)（ψw）。ψw＝ψπ＝－iCRT（大氣壓）二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：小白菜葉片（二）儀器設(shè)備：具塞小瓶12個(gè)、帶有橡皮管的注射針頭、鑷子、打孔器培養(yǎng)皿。（三）試劑：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/L蔗糖溶液；甲烯藍(lán)粉末。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）取干燥潔凈的具塞小瓶6個(gè)為甲組，各瓶中分別加入0.05-0.30mol/L蔗糖溶液約4ml（約為小瓶的2／3處），另取6個(gè)干燥潔凈的小瓶為乙組，各瓶中分別加入0.05-0.30mol/L蔗糖溶液1ml和微量甲烯藍(lán)粉末著色，上述各瓶加標(biāo)簽注明濃度。（二）取待測(cè)樣品的功能葉數(shù)片，用打孔器打取小圓片約50片，放至培養(yǎng)皿中，混合均勻。用鑷子分別夾入5-8個(gè)小圓片到盛有不同濃度的甲烯藍(lán)蔗糖溶液的小瓶中（乙組）。蓋上瓶塞，并使葉圓片全部浸沒(méi)于溶液中。放置約30-60min，為加速水分平衡，應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)小瓶。（三）經(jīng)一定時(shí)間后，用注射針頭吸取乙組各瓶藍(lán)色糖液少許，將針頭插入對(duì)應(yīng)濃度甲組小瓶溶液中部，小心地放出少量液流，觀察藍(lán)色液流的升降動(dòng)向。（每次測(cè)定均要用待測(cè)濃度的甲烯藍(lán)蔗糖溶液清洗幾次注射針頭）。如此方法檢查各瓶中液流的升降動(dòng)向。若液流上升，說(shuō)明浸過(guò)小圓片的蔗糖溶液濃度變?。粗参锝M織失水）；表明葉片組織的水勢(shì)高于該濃度糖溶液的滲透勢(shì)；如果藍(lán)色液流下降則說(shuō)明葉片組織的水勢(shì)低于該糖溶液的滲透勢(shì)，若藍(lán)色液流靜止不動(dòng)，則說(shuō)明葉片組織的水勢(shì)等于該糖溶液的滲透勢(shì)，此糖溶液的濃度即為葉片組織的等滲濃度。四、結(jié)果計(jì)算將求得的等滲濃度值代入如下公式：ψw＝ψπ＝－iCRT式中：ψw＝植物組織的水勢(shì)（單位：MPa）；ψπ＝溶液的滲透勢(shì)；C＝等滲濃度（mol/L）；R＝氣體常數(shù)[L·MPa／（mol·K）]；T＝絕對(duì)溫度；i＝解離系數(shù)（蔗糖＝1，CaCl2＝2.60）五、思考題1、測(cè)定同一植物上部及下部葉片的水勢(shì)有何差別？2、用小液流法測(cè)定植物組織水勢(shì)與用質(zhì)壁分離法測(cè)定植物細(xì)胞滲透勢(shì)都是以外界溶液的濃度算出的溶質(zhì)勢(shì)為根據(jù)，它們之間的區(qū)別何在？

實(shí)驗(yàn)七植物根系活力的測(cè)定（TTC法）植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響地上部的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。本實(shí)驗(yàn)練習(xí)測(cè)定根系活力的方法，為植物營(yíng)養(yǎng)研究提供依據(jù)。一、實(shí)驗(yàn)原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無(wú)色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲瓚，生成的三苯甲瓚比較穩(wěn)定，不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋(píng)果酸得到增強(qiáng)，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。(TTC)(TTF)二、材料、設(shè)備儀器及試劑（一）材料：水培小麥根系。（二）儀器設(shè)備：1.分光光度計(jì)；2.分析天平（感量0.1mg）；3.電子頂載天平（感量0.1g）；4.溫箱；5.研缽；6.三角瓶50ml；7.漏斗；8.量筒100ml；9.吸量管10ml；10.刻度試管10ml；11.試管架；12.容量瓶10ml；13.藥勺；14.石英砂適量；15.燒杯10ml、1000ml。（三）試劑：1、乙酸乙酯（分析純）。2、次硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末。3、1％TTC溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取TTC1.0g，溶于少量水中，定容到100ml。用時(shí)稀釋至各需要的濃度。4、磷酸緩沖液（1／15mol/L，pH7）。5、1mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。6、0.4mol/L琥珀酸：稱(chēng)取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、定性測(cè)定（1）配制反應(yīng)液把1％TTC溶液、0.4mol／L的琥珀酸和磷酸緩沖液按1:5:4比例混合。（2）把根仔細(xì)洗凈，把地上部分從莖基部切除。將根放入三角瓶中，倒入反應(yīng)液，以浸沒(méi)根為度，置37℃左右暗處放1-3h，以觀察著色情況，新根尖端幾毫米以及細(xì)側(cè)根都明顯地變成紅色，表明該處有脫氫酶存在。2、定量測(cè)定（1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少許Na2S2O4粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲攢。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲攢25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）稱(chēng)取根尖樣品0.5g，放入10ml燒杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，把根充分浸沒(méi)在溶液內(nèi)，在37℃下暗保溫1-3h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反應(yīng)。（與此同時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸與根樣品，10分鐘以后（完全殺死根系）再加其他藥品，操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯3-4ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出甲攢。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈於?、三次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量?0ml，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485nm下比色，以空白試驗(yàn)作參比測(cè)出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮唑還原量。四、結(jié)果計(jì)算四氮唑還原強(qiáng)度（mg/g(根鮮重)/h）＝四氮唑還原量（mg）/[根重（g）×?xí)r間(h)]五、思考題1、為什么要測(cè)定根系活力?植物的根與地上部分有何關(guān)系?2、植物根系活力的測(cè)定為什么要以殺死根系作為空白對(duì)照？實(shí)驗(yàn)八根系總吸收面積和活躍吸收面積的測(cè)定植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響地上部的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)測(cè)定根系吸收面積和活力的方法。一、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)植物礦質(zhì)吸收的理論，植物對(duì)溶質(zhì)的最初吸收具有吸附的特性，并假定這時(shí)在根系表面均勻地覆蓋了一層被吸附物質(zhì)的單分子層，因此可以根據(jù)根系對(duì)某種物質(zhì)的吸附量來(lái)測(cè)定根的吸收面積。常用甲烯藍(lán)作為被吸附物質(zhì)，它的被吸附量可以根據(jù)供試液濃度的變化用比色法準(zhǔn)確地測(cè)出。已知1mg甲烯藍(lán)成單分子層時(shí)所占面積為1.1m2二、儀器與試劑分光光度計(jì)1臺(tái)、50ml燒杯3只、20或50ml量筒1個(gè)（依根系大小而定）、移液管1ml1支，10ml1支、試管（15×150mm）10支、容量瓶1000ml1個(gè)、100ml1個(gè)、吸水紙適量、試管架1個(gè)。0.0002mol/L甲烯藍(lán)溶液：精確稱(chēng)取74.8mg甲烯藍(lán)（C16H18N3SCl·3H2O），加水溶解，定容至1000ml。此溶液每ml含甲烯藍(lán)0.0748mg。0.010mg/ml的甲烯藍(lán)溶液：用刻度吸管吸取0.0002mol/L甲烯藍(lán)13.37ml定容至100ml，搖勻即成。三、實(shí)驗(yàn)方法1．植物材料的準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)最好采用水培玉米，以獲得完整而無(wú)損傷的根系。玉米根系發(fā)達(dá)，是較好的材料。田間栽培的材料因不可能無(wú)損地挖出全部根系，最好避免在正式試驗(yàn)中使用。2．甲烯藍(lán)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取試管7支編號(hào)，按表1次序加入各溶液，即成甲烯藍(lán)系列標(biāo)準(zhǔn)液。表1各試劑加入順序試管號(hào)12345670.01mg/ml甲烯藍(lán)溶液(ml)蒸餾水(ml)甲烯藍(lán)濃度mg/ml0100190.001280.002460.004640.006820.0081000.01以第1管（水）為參比在分光光度計(jì)下比色，取波長(zhǎng)660nm，讀出光密度，以甲烯藍(lán)濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。3．取待測(cè)植物根系用濾紙將水吸干再用排水法在量杯或量筒中測(cè)定其根系體積。把0.0002mol/L甲烯藍(lán)溶液分別倒在三個(gè)編號(hào)的小燒杯里，每杯中溶液量約10倍于根的體積，準(zhǔn)確記下每杯的溶液用量。4．取根系，用吸水紙小心吸干數(shù)次，慎勿傷根，然后順次浸入盛有甲烯藍(lán)溶液的燒杯中，每杯中浸1.5min。注意每次取出時(shí)都要使甲烯藍(lán)溶液能從根上流回到原燒杯中。5．從三個(gè)燒杯中各取1ml溶液加入試管，均稀釋10倍，測(cè)得其光密度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出每杯浸入根系后溶液中剩下的甲烯藍(lán)毫克數(shù)。測(cè)定根系吸收面積記載表植物名稱(chēng)杯中甲烯藍(lán)溶液量(ml)開(kāi)始時(shí)甲烯藍(lán)濃度(mg/ml)浸根后溶液濃度(mg/ml)燒杯1燒杯2燒杯3被吸收的甲烯藍(lán)量(mg)燒杯1燒杯2燒杯1＋2燒杯3根體積(ml)根吸收面積m2總的活躍的活躍/總的(%)比表面總的活躍的四、結(jié)果計(jì)算把結(jié)果記入上表，并以下式求出根的吸收面積：總吸收面積（m2）=｛[(C1－C1ˊ)×V1]＋[(C2－C2ˊ)×V2]｝×1.1活躍吸收面積（m2）=[(C3－C3ˊ)×V3]×1.1活躍吸收面積（%）=活躍吸收面積/總吸收面積×100比表面＝根的總吸收面積/根的體積式中C—溶液原來(lái)的濃度mg/ml；Cˊ—浸提后的濃度mg/ml；1,2,3—燒杯編號(hào)

實(shí)驗(yàn)九離體葉綠體的制備以及完整度的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)原理葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，分布在葉肉細(xì)胞內(nèi)（組成氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞也含有葉綠體）。葉綠體是由被膜、間質(zhì)和類(lèi)囊體三部分組成。依據(jù)分離所得葉綠體的結(jié)構(gòu)完整程度，大致將葉綠體分成兩類(lèi)：一類(lèi)為被膜已破碎的葉綠體，稱(chēng)之為破碎葉綠體，它具有光合電子傳遞、光合放氧和光合磷酸化的功能；另一類(lèi)為被膜完整的葉綠體，它具有同化二氧化碳的完全的光合作用功能。分離和制備有活性的離題葉綠體是研究葉綠體的結(jié)構(gòu)功能、光合作用原理及遺傳控制機(jī)理的前提。要分離有活性、較純的完整葉綠體相當(dāng)困難，有些植物葉片細(xì)胞的細(xì)胞比較厚，葉綠體不易從細(xì)胞中分離出來(lái)；有些植物葉綠體外膜極易破損，有些植物葉片細(xì)胞中含有某些內(nèi)源性抑制物質(zhì)。例如：水解酶、氧化酶等，在制備過(guò)程中極易釋放出來(lái)，破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)和活性。因此，不是所有的高等植物都適合用來(lái)分離和制備葉綠體，最常用的植物材料有菠菜、豌豆、玉米、甜菜、大麥等。此外，低等植物如衣藻、小球藻等也是常用的材料。葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)作為一項(xiàng)新技術(shù)近年來(lái)為植物基因工程提供了一條新途徑。但葉綠體一旦離體，其翻譯活性在15-30min后就可能完全喪失。葉綠體是綠色植物細(xì)胞中典型的細(xì)胞器，可通過(guò)研磨葉片并勻漿后，根據(jù)其顆粒大小經(jīng)過(guò)濾、差速離心加以分離。分離葉綠體應(yīng)在等滲溶液中制備，以減少滲透壓對(duì)葉綠體的傷害。整個(gè)分離過(guò)程應(yīng)在0-4℃下進(jìn)行，所有提取物、溶液和材料，也應(yīng)保存在該溫度下備用。葉綠體活力會(huì)隨著離體時(shí)間延長(zhǎng)而不斷下降，因此，分離工作應(yīng)盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成。下面分別介紹這兩類(lèi)葉綠體的制備以及被膜完整度的測(cè)定。分離和制備葉綠體的方法很多，目前最常用且較方便的是分步差速離心的方法。一般葉綠體的直徑約為幾個(gè)微米，因此細(xì)胞破碎后在一定的離心力范圍內(nèi)即能分離獲得葉綠體。

二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備1.器材與試劑(1)器材普通離心機(jī)(最好帶有水平離心頭)、研缽或電動(dòng)搗碎器、分光光度計(jì)、冰箱、扭力天平、pH計(jì)、量筒、移液管、離心管、脫脂紗布等。(2)試劑①提取液O.4mol/L蔗糖，O.O5mol/LTris-HCl(pH7.6)，0.01mol/LNaCl(簡(jiǎn)稱(chēng)STN溶液，STN液(蔗糖0.4mol·L-1，Tricine20mmol·L-1pH7.8，NaCl10mmol·L-1)。將137g蔗糖、3.58gTricine(三羥甲基甘氨酸)、0.58gNaCl溶于800ml左右水中，用NaOH溶液調(diào)至pH7.8，加水至1000ml。STN液置0-4℃冰箱中備用。)②80%的丙酮

三、實(shí)驗(yàn)步驟(1)葉綠體制備取菠菜、豌豆或小麥苗等新鮮葉片，洗凈后去除中脈，置于研缽或搗碎器中，加人冰冷的提取液，每10g葉片約加20m1冰冷的STN溶液。用手工研磨或用電動(dòng)搗碎器搗碎，使葉片搗碎至碎米粒樣大小，經(jīng)過(guò)4層紗布過(guò)濾，濾液先以200×g離心1min，4℃，去除粗粒沉淀，上層液再以1000×g離心3min，4℃，倒掉上層液，沉淀為葉綠體。用少量STN溶液懸浮葉綠體，懸浮時(shí)可用棉球分散沉淀，并通過(guò)棉球吸取，以過(guò)濾葉綠體結(jié)塊，葉綠體懸浮液置于冰浴中備用。(2)葉綠素濃度測(cè)定取葉綠體懸浮液0.1m1，加4.9m180%的丙酮，搖勻后于1000×g離心2min，上清液置于lcm光徑的比色杯，在波長(zhǎng)為652nm處的分光光度計(jì)上比色。再按下列公式計(jì)算：652nm光密度讀數(shù)(OD值)×50/34.5＝葉綠素mg/ml葉綠體懸浮液。注意事項(xiàng)(1)提取葉綠體操作都在低溫下進(jìn)行，所用器皿都需預(yù)冷。(2)葉綠體活力會(huì)隨著離體時(shí)間延長(zhǎng)而不斷下降，因此，操作盡可能迅速，分離工作盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成。(3)破碎的葉綠體制劑儲(chǔ)存在液氮中，其Hill反應(yīng)活性可保持較長(zhǎng)時(shí)間，儲(chǔ)存時(shí)葉綠體的濃度宜濃些(約3-4mg葉綠素/m1)，并加25%體積的甘油。完整葉綠體的制備分離方法一般有兩種，一是酶消化方法，把葉片表皮撕去后，用纖維素酶和果膠酶消化細(xì)胞壁，得到原生質(zhì)體，再把原生質(zhì)體通過(guò)尼龍網(wǎng)小孔(孔徑20μm)，使原生質(zhì)體破裂而釋放出完整葉綠體，但此方法分離得到的葉綠體數(shù)量有限。另一種是用機(jī)械方法，先用搗碎機(jī)破碎葉片，再分步離心，可以大量制備葉綠體。這里主要介紹離心法分離完整葉綠體。1.器材與試劑(1)器材普通離心機(jī)(需帶有水平離心頭)，或低溫離心機(jī)、電動(dòng)搗碎器、照光裝置、氧電極測(cè)氧裝置等。(2)試劑①提取液：含0.33mol/L山梨醇，0.05mol/LMES(pH6.1)，0.01mol/LNaCl，2mmol/LMgC12，2mmol/LEDTA-Na2，0.5mmol/LKH2P04，2mmol/L抗壞血酸鈉(抗壞血酸鈉宜在使用前現(xiàn)配現(xiàn)加)②漲破葉綠體的Hill反應(yīng)速率測(cè)定液：0.05mol/LTris-HCl(pH7.6)，5mmol/LMgCl2，10mmol/LNaCl，10mmol/LK3Fe(CN)6。10mmol/LNH4C1③0.66mol/L山梨醇④Percoll(一種具有高密度和低滲透勢(shì)的二氧化硅溶膠)percoll本身是低滲透壓的，要用高滲透壓溶液配成生理等滲透壓溶液，然后使用，不然，細(xì)胞容易破裂。一般是先用9份Percoll與1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15MPBS)稀釋到所需濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時(shí)溶液為100％Percoll，比重是1.127，毫克分子滲透壓濃度為290mOsmol/kgPercoll濃度(％)706050403020比重g／ml1.0901.0771.0671.0561.0431.0312.操作方法(1)采摘新鮮菠菜或豌豆葉片菠菜要選擇嫩而厚，無(wú)顯著皺紋的葉片，最好在早晨摘取，以免日照后在葉綠體內(nèi)積累淀粉，不利于完整葉綠體的分離。豌豆也要選擇嫩而厚的葉片，摘取后應(yīng)盡快使用。葉片先在強(qiáng)光下照射15-20min，用以激活葉綠體，尤其用在完整葉綠體的以二氧化碳為底物放氧活性測(cè)定時(shí)，能使其縮短光合作用誘導(dǎo)期。為了防止強(qiáng)光照射下的溫度上升，可把葉片鋪放在冰塊上，并在光源與葉片之間放隔水層。(2)葉綠體制備葉片去除葉柄及中脈后，以每10g葉片約加20-30ml冰冷的提取液。在電動(dòng)搗碎器上高速搗碎，約2s/次，間隔搗碎3-4次，使葉片碎成綠豆粒樣大小，然后經(jīng)4層紗布過(guò)濾，去除殘?jiān)Ｗ⒁膺^(guò)濾時(shí)不可用力擠壓，以免葉綠體被膜破碎。濾液以1000×g離心，4℃，將離心管放人離心機(jī)后，使離心機(jī)的加速很快上升到預(yù)定值，經(jīng)約30s后再很快使其下降停止，整個(gè)離心程序大約用2-3min左右完成。小心地倒出上清液，先用少許提取介質(zhì)漂洗去沉淀表面的浮物，再加入懸浮介質(zhì)：即把提取介質(zhì)中的MES換成HEPES(pH7.6)，懸浮葉綠體，在分散葉綠體沉淀時(shí)宜使用毛筆輕輕刷之，或者用手握住離心管，在冰塊之間攪動(dòng)，使葉綠體由于振動(dòng)而分散開(kāi)來(lái)，不要用棉球吸濾，以防被膜壓破。葉綠體懸浮時(shí)要濃一些(含葉綠素2mg/ml以上)，這樣有利于其活性的保持。(3)葉綠體被膜完整率的進(jìn)一步提高上述方法所得葉綠體被膜完整率一般約在60%左右，好的時(shí)候也可達(dá)到70%以上。如果需要進(jìn)一步提純，一種簡(jiǎn)單的方法是再次用懸浮介質(zhì)洗滌葉綠體，并用同樣離心方法沉淀葉綠體，把破碎的葉綠體漂洗去，起著浮選作用，但用此方法提高被膜完整率的程度有限，而且葉綠體損失也多。另一種方法是用Percoll作為密度梯度介質(zhì)，方法是將3m1含有80%Percoll(以原液為100%濃度，用水稀釋)，鋪在10ml體積的離心管下層，再把3m140%Percoll鋪在離心管的中層，然后將lml葉綠體懸浮液輕輕地鋪在離心管的上層，用水平離心頭的離心機(jī)在1500×g下離心2-3min，注意此時(shí)離心機(jī)的加速一定要緩慢上升，而下降時(shí)也要緩慢停下，否則會(huì)破壞Percoll的濃度梯度層的形成，取出離心管可以看到有3層綠色帶，最上層的為破碎葉綠體，沉在底層的為粗顆粒，而40%-80%Percoll之間的界面上有一綠色層，是完整葉綠體，小心地將它吸取出來(lái)，轉(zhuǎn)移到葉綠體懸浮介質(zhì)里。此部分葉綠體的被膜完整率可達(dá)95%以上，有時(shí)甚至100%。Percoll介質(zhì)可以重復(fù)使用，把密度梯度離心用過(guò)以后的40%和80%Percoll，分別吸取出來(lái)，存儲(chǔ)于冰箱中以備下次使用。如果制備完整葉綠體的目的只是為了供葉綠體DNA的分離所用，則主要獲得被膜完整率高的葉綠體制劑即可，不必考慮葉綠體同化二氧化碳的活性，因此提取介質(zhì)可改用簡(jiǎn)單的STN溶液，但是操作順序需按照制備完整葉綠體的方法，再用Percoll作密度梯度離心提純。葉綠體被膜完整率的測(cè)定：由于鐵氰化鉀不能透過(guò)葉綠體被膜，故完整葉綠體在等滲條件下不能進(jìn)行鐵氰化鉀光還原的反應(yīng)，而被膜破碎的葉綠體，鐵氰化鉀可進(jìn)入葉綠體進(jìn)行反應(yīng)，利用此原理來(lái)比較被膜破碎與未破碎葉綠體的Hill反應(yīng)速率的差別，就可測(cè)出葉綠體中被膜的完整率。被膜未破的葉綠體的Hill反應(yīng)速率測(cè)定，是將上述被膜漲破葉綠體的Hill反應(yīng)速率測(cè)定液，先以1：1體積與0.66mol/L山梨醇混合，使之保持0.33mol/L山梨醇濃度，再加入葉綠體(每毫升反應(yīng)液約含葉綠素50μg)，用氧電極方法測(cè)定Hill反應(yīng)速率(參閱氧電極測(cè)氧方法)。被膜破碎的葉綠體Hill反應(yīng)速率測(cè)定，是先與不含山梨醇的Hill反應(yīng)液混合，使被膜在低滲介質(zhì)下脹破，再以1：1體積與0.66mol/L山梨醇混合，使測(cè)定時(shí)也保持0.33mol/L山梨醇濃度，在相同條件下測(cè)定Hill反應(yīng)速率。被膜完整率的計(jì)算如下：被膜完整率(%)＝[（被膜漲破葉綠體的Hill反應(yīng)速率－完整葉綠體的Hill反應(yīng)速率）/被膜漲破葉綠體的Hill反應(yīng)速率]×100測(cè)定計(jì)算實(shí)例見(jiàn)下圖：圖8用鐵氰化鉀作Hill氧化劑檢測(cè)葉綠體完整度記錄圖被膜完整率(%)＝(150－8)/150＝94.7%四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照上述的圖表記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并計(jì)算。五、思考題1.被膜完整的葉綠體與破碎的葉綠體在功能上有什么區(qū)別？2.在本實(shí)驗(yàn)中山梨醇的作用？3.本實(shí)驗(yàn)中鐵氰化鉀的作用？實(shí)驗(yàn)十葉綠體色素的提取、分離和理化性質(zhì)=1\*ROMANI葉綠體色素的提取與分離一、實(shí)驗(yàn)原理葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素和葉黃素）兩大類(lèi)。它們與類(lèi)囊體膜相結(jié)合成為色素蛋白復(fù)合體。這兩類(lèi)色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提取。提取液可用色譜分析的原理加以分離。因吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿?dòng)時(shí)，混合物中各種成分在兩相（固定相和流動(dòng)相）間具有不同的分配系數(shù)，所以移動(dòng)速度不同，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間層析后，可將各種色素分開(kāi)。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：菠菜葉片（二）儀器設(shè)備：研缽、漏斗、100ml三角瓶、剪刀、滴管、培養(yǎng)皿（直徑11cm）、康維皿或平底短玻管、圓形濾紙（直徑11cm）、濾紙條（5cm×1.5cm）。（三）試劑：95％乙醇、石英砂、碳酸鈣粉、推動(dòng)劑：按石油醚：丙酮：苯（10:2:1）比例配制（V／V）。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、葉綠體色素的提?。?）取新鮮菠菜葉片4-5片（2g左右），洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放入研缽中。（2）研缽中加2-3ml95％乙醇，加入少許石英砂、碳酸鈣粉末，研磨至糊狀，再加10-15ml95％乙醇，提取35min，上清液過(guò)濾于三角瓶中，殘?jiān)?0ml95％乙醇沖洗，一同濾于三角瓶中。（3）如無(wú)新鮮葉片，也可用事先制好的葉干粉提取。取新鮮葉片（以菠菜葉最好），先用105℃殺青，再在80℃下烘干，研成粉末，密閉貯存。用時(shí)稱(chēng)葉粉2g放入小燒杯中，加95％乙醇20-30ml浸提，并隨時(shí)攪動(dòng)。待乙醇呈深綠色時(shí)，濾出浸提液備用。2、葉綠體色素的分離（1）取圓形定性濾紙一張（直徑11cm），在其中心戳一圓形小孔（直徑約2mm）另取一張濾紙條（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇葉綠體色素提取液沿紙條的長(zhǎng)度方向涂在紙條的一邊，使色素?cái)U(kuò)散的寬度限制在0.5cm以內(nèi)，風(fēng)干后，再重復(fù)操作數(shù)次，然后沿長(zhǎng)度方向卷成紙捻，使浸過(guò)葉綠體色素溶液的一側(cè)恰在紙捻的一端。（2）將紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿突出）。（3）在培養(yǎng)皿內(nèi)放一康維皿，在康維皿中央小室中加入適量的推動(dòng)劑，把帶有紙捻的圓形濾紙平放在康維皿上，使紙捻下端浸入推動(dòng)劑中。迅速蓋好培養(yǎng)皿。此時(shí)，推動(dòng)劑借助毛細(xì)管引力順紙捻擴(kuò)散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動(dòng)，不久即可看到各種色素的同心圓環(huán)。如無(wú)康維皿，也可在培養(yǎng)皿中放入一平底短玻管或塑料藥瓶蓋，以盛裝推動(dòng)劑。所用培養(yǎng)皿底、蓋直徑應(yīng)相同，且應(yīng)略小于濾紙直徑，以便將濾紙架在培養(yǎng)皿邊緣上。分離葉綠體色素的圓形紙層析裝置1、培養(yǎng)皿2、圓形層析濾紙3、康維皿4、紙捻（上有色素樣品）5、推動(dòng)劑分離葉綠體色素的圓形紙層析裝置1、培養(yǎng)皿2、圓形層析濾紙3、康維皿4、紙捻（上有色素樣品）5、推動(dòng)劑41235=2\*ROMANII葉綠體色素的理化性質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)原理葉綠素是一種二羧酸—葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素分開(kāi)；葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素都具有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計(jì)精確測(cè)定；葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回到基態(tài)時(shí)可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類(lèi)胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅則成為綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標(biāo)本。二、儀器與用具20ml刻度試管、10ml小試管、試管架、分光鏡、石棉網(wǎng)、藥匙、燒杯（100ml）、酒精燈、玻棒、鐵三角架、刻度吸量管2ml、5ml各1支、火柴。三、試劑95%乙醇；苯；醋酸銅粉末；5%的稀鹽酸；醋酸-醋酸銅溶液：6g醋酸酮溶于100ml50%的醋酸中，再加蒸餾水4倍稀釋而成；KOH-甲醇溶液：20gKOH溶于100ml甲醇中，過(guò)濾后盛于塞有橡皮塞的試劑瓶中。四、實(shí)驗(yàn)步驟用本實(shí)驗(yàn)第一項(xiàng)中提取的葉綠體色素乙醇溶液和水研磨勻漿，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。1、光對(duì)葉綠素的破壞作用（1）取4支小試管，其中兩支各加入5ml用水研磨的葉片勻漿。另外兩支各加入2.5ml葉綠體色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀釋1倍。（2）取1支裝有葉綠素乙醇提取液的試管和1支裝有水研磨葉片均漿的試管，放在直射光下，另外兩支放到暗處，40min后對(duì)比觀察顏色有何變化，解釋其原因。2、熒光現(xiàn)象的觀察取1支20ml刻度試管加入5ml濃的葉綠體色素乙醇提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同？解釋原因。3、皂化作用（綠色素與黃色素的分離）（1）在做過(guò)熒光現(xiàn)象觀察的葉綠體色素乙醇提取液試管中加入1.5ml20%KOH-甲醇溶液，充分搖勻。（2）片刻后，加入5ml苯，搖勻，再沿試管壁慢慢加入1-1.5ml蒸餾水，輕輕混勻（勿激烈搖蕩），于試管架上靜置分層。若溶液不分層，則用滴管吸取蒸餾水，沿管壁滴加，邊滴加邊搖動(dòng)，直到溶液開(kāi)始分層時(shí)，靜置?？梢钥吹饺芤褐饾u分為兩層，下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b（以及少量的葉黃素）；上層是苯溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。4、吸收光譜的觀察將上述已分層的試管溶液，用分光鏡觀察兩類(lèi)色素的吸收光譜，首先讓下層綠色素部分對(duì)準(zhǔn)進(jìn)光孔，看光譜有何變化；然后再將上層黃色素溶液對(duì)準(zhǔn)進(jìn)光孔，看光譜又有何變化。把觀察的結(jié)果用簡(jiǎn)單的圖表示出來(lái)。5、H+和Cu2+對(duì)葉綠素分子中Mg2+的取代作用方法一：（1）取兩支試管，第一支試管加葉綠體色素提取液2ml，作為對(duì)照。第二支試管中加葉綠體色素提取液5ml，再加入一滴5%HCl溶液，搖勻，觀察溶液顏色變化。（2）當(dāng)溶液變褐后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記載溶液顏色變化情況，并與對(duì)照試管相比較。解釋其顏色變化原因。方法二：另取醋酸－醋酸銅溶液20ml，以燒杯盛之。取新鮮植物葉片兩片，放入燒杯中，用酒精燈慢慢加熱，隨時(shí)觀察并記錄葉片顏色的變化，直至顏色不再變化為止。解釋原因。五、注意事項(xiàng)1．在低溫下發(fā)生皂化反應(yīng)的葉綠體色素溶液，易乳化而出現(xiàn)白絮狀物，溶液渾濁，且不分層?？杉ち覔u勻，放在30-40℃的水浴中加熱，溶液很快分層，絮狀物消失，溶液變得清澈透明。2．分離色素用的圓形濾紙，在中心打的小圓孔，周?chē)仨氄R，否則分離的色素不是一個(gè)同心圓。六、思考題1．用不含水的有機(jī)溶劑如無(wú)水乙醇、無(wú)水丙酮等提取植物材料特別是干材料的葉綠體色素往往效果不佳，原因何在？2．研磨提取葉綠素時(shí)加入CaCO3有什么作用？3．從葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素的吸收光譜討論其生理意義。

實(shí)驗(yàn)十一植物葉片光合速率的測(cè)定（改良半葉法）一、實(shí)驗(yàn)原理光合速率測(cè)定是植物生理學(xué)的基本研究方法之一，在作物豐產(chǎn)生理、作物生態(tài)、新品種選育、以及光合作用基本理論研究等方面都有著廣泛的用途。根據(jù)光合作用的總反應(yīng)式CO2+2H2O→(CH2O)+O2+H2O光合強(qiáng)度原則上可以用任何一反應(yīng)物消耗速度或生成物的產(chǎn)生速度來(lái)表示。由于植物體內(nèi)水分含量很高，而且植物隨時(shí)都在不斷地吸水和失水，水參與的生化反應(yīng)又特多，即體內(nèi)水分含量經(jīng)常變動(dòng)，所以實(shí)際上不可能用水的含量變化來(lái)測(cè)定光合速率。目前最常用的方法有：改良半葉法，紅外線CO2分析法，和氧電極法。以下介紹改良半葉法測(cè)定植物光合強(qiáng)度。

同一葉片的中脈兩側(cè)，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，生理功能基本一致。將葉片一側(cè)遮光或一部分取下置于暗處，另一側(cè)留在光下進(jìn)行光合作用，過(guò)一定時(shí)間后，在這葉片兩側(cè)的對(duì)應(yīng)部位取同等面積，分別烘干稱(chēng)重。根據(jù)照光部分干重的增量便可計(jì)算光合速率。為了防止光合產(chǎn)物從葉中輸出，可對(duì)雙子葉植物的葉柄采用環(huán)割，對(duì)單子葉植物的葉片基部用開(kāi)水燙，或用三氯醋酸(蛋白質(zhì)沉淀劑)處理等方法來(lái)?yè)p傷韌皮部活細(xì)胞，而這些處理幾乎不影響水和無(wú)機(jī)鹽分向葉片的輸送。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料生長(zhǎng)于田間的植株。（二）儀器與用品剪刀，分析天平，稱(chēng)量皿（或鋁盒），烘箱，刀片，金屬（有機(jī)玻璃也可）模板（或打孔器），紗布，夾子，有蓋搪瓷盤(pán)，錫紙等。（三）試劑三氯乙酸、石蠟。三、實(shí)驗(yàn)步驟1．選擇測(cè)定樣品：實(shí)驗(yàn)可在晴天上午8-9點(diǎn)鐘開(kāi)始，預(yù)先在田間選定有代表性的葉片（如葉片在植株上的部位、年齡、受光條件等）10張，掛牌編號(hào)。2．葉子基部處理，目的是將葉子輸導(dǎo)系統(tǒng)的韌皮部破壞：(1)棉花等雙子葉植物，可用刀片將葉柄的外皮環(huán)割約0.5cm寬，切斷韌皮部運(yùn)輸。(2)小麥、水稻等單子葉植物，由于韌皮部和木質(zhì)部難以分開(kāi)處理，可用剛在開(kāi)水中浸過(guò)的紗布或棉花包裹的夾子將葉片基部燙傷一小段（一般用90℃以上的開(kāi)水燙20秒）以傷害韌皮部。也可用110-120℃的石蠟燙傷韌皮部。為了使?fàn)C后或環(huán)割等處理的葉片不致下垂影響葉片的自然生長(zhǎng)角度，可用錫紙、橡皮管或塑料管包繞，使葉片保持原來(lái)的著生角度。3．剪取樣品：葉片基部處理完畢后，即可剪取樣品，記錄時(shí)間，開(kāi)始光合速率測(cè)定。一般按編號(hào)次序分別剪下對(duì)稱(chēng)葉片的一半（中脈不剪下），并按編號(hào)順序?qū)⑷~片夾于濕潤(rùn)的紗布中，將葉置于暗處。4-5小時(shí)后（光照好、葉片大的樣品，可縮短處理時(shí)間），再依次剪下另一半葉，同樣按編號(hào)夾于濕潤(rùn)紗布中。兩次剪葉的次序與所花時(shí)間應(yīng)盡量保持一致，使各葉片經(jīng)歷相同的光照時(shí)數(shù)。4．稱(chēng)重比較：將各同號(hào)葉片之兩半按對(duì)應(yīng)部位疊在一起，在無(wú)粗葉脈處放上已知面積（如棉花可用1.5×2cm）的金屬模板（或用打孔器），用刀片沿邊切下兩個(gè)葉塊，置于兩個(gè)分別標(biāo)記為照光及暗中的稱(chēng)量皿中，80-90℃下烘至恒重（約5小時(shí)），在分析天平上稱(chēng)重比較。按表1填入測(cè)定數(shù)據(jù)，并計(jì)算。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果光合作用強(qiáng)度計(jì)算：按照如下公式計(jì)算光合作用強(qiáng)度：光合作用強(qiáng)度=干重增加總數(shù)（mg）/切取葉面積總和(dm2)·照光時(shí)數(shù)（h）光合作用強(qiáng)度單位為mg干物質(zhì)/dm2·h。由于葉內(nèi)貯存的光合產(chǎn)物一般為蔗糖和淀粉等，可將干物質(zhì)重量乘系數(shù)1.5，即得二氧化碳同化量，單位為mgCO2/dm2·h。表1用改良半葉法測(cè)定植物光合速率的記載表

實(shí)驗(yàn)人日期材料名稱(chēng)光照時(shí)間葉面積

編號(hào)黑暗組光照組葉片干重增量（g）稱(chēng)量皿重

（g）稱(chēng)量皿+葉片干重（g）稱(chēng)量皿重

（g）稱(chēng)量皿+葉片干重（g）12345678910五、思考題1.選擇同一植株不同葉位葉片，試問(wèn)它們的光合作用強(qiáng)度是否相同，為什么？2.如果選擇不同生境（如陰生、陽(yáng)生或出于逆境脅迫下）下生長(zhǎng)的、同一生長(zhǎng)階段、相同葉位的同種植物，它們的光合速率會(huì)有什么不同？為什么？3.還有哪些方法可以簡(jiǎn)便地測(cè)定植物光合作用強(qiáng)度？請(qǐng)簡(jiǎn)述它們的原理。實(shí)驗(yàn)十二氧電極法測(cè)定植物組織的光合與呼吸速率一、實(shí)驗(yàn)原理氧電極是為測(cè)定水中溶解氧含量而設(shè)計(jì)的一種極譜電極。目前通用的是薄膜氧電極，又稱(chēng)Clark電極，由鑲嵌在絕緣材料上的銀極（陽(yáng)極）和鉑極（陰極）構(gòu)成，電極表面覆蓋一層厚約20-25μm的聚四氟乙烯或聚已烯薄膜，電極和薄膜之間充以KCl溶液作為支持電解質(zhì)。由于水中溶解氧能透過(guò)薄膜而電解質(zhì)不能透過(guò)，因而排除了被測(cè)溶液中各種離子電極反應(yīng)的干擾，成為測(cè)定溶解氧的專(zhuān)用電極。氧電極具有靈敏度高，反應(yīng)快、可連續(xù)測(cè)量記錄，能夠追蹤反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程等特點(diǎn)，因而在葉綠體及線粒體懸浮液的光合放氧和呼吸耗氧，某些耗氧或放氧的酶促反應(yīng)，以及葉碎塊或游離葉細(xì)胞的光合放氧等的研究上，都得到了廣泛的應(yīng)用。氧電極法測(cè)定水中溶解氧屬于極譜分析的一種類(lèi)型。當(dāng)兩極間外加的極化電壓超過(guò)氧分子的分解電壓時(shí)，透過(guò)薄膜進(jìn)入KCl溶液的溶解氧便在鉑極上還原：O2+2H2O+4e-=4OH-銀極上則發(fā)生銀的氧化反應(yīng)：4Ag+4Cl-=4AgCl+4e-此時(shí)電極間產(chǎn)生電解電流。由于電極反應(yīng)的速度極快，陰極表面的氧濃度很快降低，溶液主體中的氧便向陽(yáng)極擴(kuò)散補(bǔ)充，使還原過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行，但氧在水中的擴(kuò)散速度則相對(duì)較慢，所以電極電流的大小受氧的擴(kuò)散速度的限制，這種電極電流又稱(chēng)擴(kuò)散電流。在溶液靜止、溫度恒定的情況下，擴(kuò)散電流受溶液主體與電極表面氧的濃度差控制。隨著外加電壓的加大，電極表面氧的濃度必然減小，溶液主體與電極表面氧的濃度差加大，擴(kuò)散電流也隨之加大。但當(dāng)外加的極化電壓達(dá)到一定值時(shí)，陰極表面氧的濃度趨近于零，于是擴(kuò)散電流的大小完全取決于溶液主體中的氧的濃度。此時(shí)再增加極化電壓，擴(kuò)散電流基本不再增加，使極譜波（即電流-電壓曲線）產(chǎn)生一個(gè)平頂。將極化電壓選定在平頂?shù)闹胁浚梢允箶U(kuò)散電流的大小基本不受電壓微小波動(dòng)的影響。因此，在極化電壓及溫度恒定的條件下，擴(kuò)散電流的大小即可作為溶解氧定量測(cè)定的基礎(chǔ)。電極間產(chǎn)生的擴(kuò)散電流信號(hào)可通過(guò)電極控制器的電路轉(zhuǎn)換成電壓輸出，用自動(dòng)記錄儀進(jìn)行記錄。二、儀器設(shè)備用氧電極法測(cè)定溶解氧的專(zhuān)用儀器國(guó)內(nèi)外均有定型產(chǎn)品。國(guó)內(nèi)有上海植物生理研究所生產(chǎn)的簡(jiǎn)易測(cè)氧裝置；新華儀表廠生產(chǎn)的CY-Ⅱ型測(cè)氧儀等。國(guó)外產(chǎn)品有英國(guó)Hansatech科學(xué)儀器公司生產(chǎn)的CHOROLAB1、CHOROLAB2液態(tài)氧電極等型號(hào)，美國(guó)YellowSprings儀器有限公司生產(chǎn)的YSI-53型生物氧監(jiān)測(cè)儀等?，F(xiàn)將YSI-53型生物氧監(jiān)測(cè)儀的主要部件及其所需其它部件介紹如下：電極控制器：其主要作用是給電極提供極化電壓；給電磁攪拌器提供工作電壓；將電極電流轉(zhuǎn)