生物多聚酶鏈式反應擴增DNA片段課件新人教版選修1

多聚酶鏈式反響擴增DNA片斷一、根底知識〔一〕DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、根本單位3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）一個核苷酸上的磷酸基團上的“－OH〞和另一個核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二脂鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二脂鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’、5’、磷酸二脂鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH〞末端稱為3’端，而磷酸基團的末端稱為5’端4、多脫氧核苷酸鏈得形成脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)①DNA分子是由兩條反向平行的〔即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’〕脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)那么雙螺旋結(jié)構(gòu)②脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成根本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè)③兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對6、利用堿基互補配對規(guī)律的計算規(guī)律一：DNA雙鏈中的兩條互補鏈的堿基相等，任意兩個互補的堿基之和相等即A=T，G=C。任意兩個不互補的堿基之和恒等，占堿基總數(shù)的50%。即：A+G＝T+C＝A+C＝T+G＝50%，〔A+G〕/(T+C)＝(A+C)/(G+T)＝(T+C)/(A+G)＝1規(guī)律二：在DNA雙鏈中的一條單鏈(A+G)/(T+C)的值與另一條互補鏈的(A+G)/(T+C)的值互為倒數(shù)關系規(guī)律三：DNA雙鏈中，一條單鏈的(A+T)/(G+C)的值與另一條互補鏈的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也與整個DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等〔二〕DNA分子的特性1、穩(wěn)定性在DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)，通過氫鍵形成的堿基對，使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并聯(lián)起來例題：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25％，A和T占75%，哪一個穩(wěn)定？答：甲DNA分子比乙DNA分子穩(wěn)定。因為A與T之間形成兩個氫鍵，在G和C之間形成三個氫鍵，三個氫鍵比兩個氫鍵穩(wěn)定，所以在DNA分子中含有較多的G－C堿基比照含有較多的A－T堿基穩(wěn)定2、多樣性構(gòu)成DNA分子的堿基對的數(shù)量不同，堿基對的排列順序千變?nèi)f化例題：如果有4000個堿基對，堿基對有多少種排列方式？答：堿基對排列方式有44000種3、特異性不同的DNA分子由于堿基對的排列順序存在差異，因此每一個DNA分子的堿基對都有其特定的排列順序，這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的〔三〕DNA的復制2、時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所細胞核〔主〕、線粒體、葉綠體4、模板DNA母鏈1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程5、原材料脫氧核苷酸6、根本條件酶、ATP、原料、模板7、復制過程①DNA的解旋親代DNA分子利用細胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，局部雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷⑤DNA片斷的連接在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNA邊解旋邊復制(過程〕8、復制特點半保存復制〔結(jié)果〕9、遵循原那么堿基互補配對原那么10、精確復制的原因11、復制的意義DNA分子通過復制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性①規(guī)那么的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復制提供了精確的模板②堿基互補配對能力保證了復制準確無誤的進行①一條雙鏈DNA分子，復制N次，形成的子代DNA分子中，含親代DNA母鏈的有兩個DNA分子，占子代DNA總數(shù)的2/2N；親代DNA分子母鏈兩條，占子代DNA中脫氧核苷酸鏈總數(shù)的2/2N+1=1/2N②設一條DNA分子中有胸腺嘧啶為m個，那么該DNA復制n次后，形成子代DNA分子需游離的胸腺嘧啶為T=(2N-1)m12、DNA復制過程中的等量關系〔四〕PCR(多聚酶鏈式反響〕1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物2、DNA聚合酶作用過程當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸3、PCR原理①在80－100°C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性②當溫度緩慢降低后，兩條彼此別離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器4、TaqDNA聚合酶的應用5、緩沖液需要為PCR反響提供的物質(zhì)DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行7、細胞內(nèi)和細胞外DNA復制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)DNA的復制體外的模擬模板（母鏈）細胞內(nèi)源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP細胞內(nèi)源外源加入聚合酶細胞內(nèi)源外源加入反應環(huán)境細胞內(nèi)環(huán)境緩沖液①PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20－30個脫氧核苷酸8、細胞內(nèi)復制和PCR不同點②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反響溫度的控制來實現(xiàn)的〔五〕PCR的反響過程1、PCR的反響步驟PCR一般經(jīng)歷三十屢次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個根本步驟──變性、復性和延伸①變性〔模板DNA解旋〕模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反響作準備2、循環(huán)過程靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火③延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原那么與半保存復制的原理，合成一條新的DNA鏈靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸靶序列

靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量4、PCR循環(huán)的結(jié)果②DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反響，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸二、PCR的實驗操作1、PCR儀〔一〕設備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次PCR儀微量離心管微量移液器1、準備2、移液〔二〕實驗操作步驟按照PCR反響體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反響體系配方往微量離心管里面參加各種試劑①過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反響液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序①過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s4、離心5、反響②離心目的：使反響液體集中在離心管底部，提高反響效果循環(huán)數(shù)變性復性延伸第一次94°C，10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min6、本卷須知①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；②分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭〔一〕理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復制n次，DNA為ax2n〔二〕實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關2、過程①稀釋2uLPCR反響液，參加98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③計算④計算DNA含量〔g〕＝50x(260nm的讀數(shù)〕x稀釋倍數(shù)50：1g/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02比色杯四、課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝〔109拷貝〕五、實驗小結(jié)PCR儀加熱使〔〕變性,復性使引物與模板DNA〔〕,延伸需將反響溫度升至中溫(),在〔〕的作用下,以〔〕為原料,以〔〕為復制的起點,合成新鏈。如此重復改變反響溫度,經(jīng)〔〕三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復性和延伸72℃50

學習目標：廣告分類及特點。廣告的寫法

學法指導：結(jié)合已有見聞了解廣告用法。學會聯(lián)想，激發(fā)想象力，學會廣告寫作。課后多觀察，多積累素材，借助媒體，借鑒經(jīng)驗，處處留心皆廣告。

本節(jié)課重點：學習目標1、2、廣告標題寫法。51導入：相信同學們對廣告這個字眼是再熟悉不過了，隨著現(xiàn)代科技的開展，人們生活水平的日益提高，傳媒手段的多元化，廣告如漫天飛雪撲面而來，給人們的生活帶來意想不到的影響。可以說人人都離不開廣告。通過今天的學習，同學們對廣告會有更深的認識。52廣告概念：廣義：包括公益性宣傳廣告和商業(yè)行為廣告。狹義：以盈利為目的的商業(yè)行為的廣告。商業(yè)廣告概念：商業(yè)廣告是一種有方案、有針對性地通過各種媒體向公眾傳遞商品、效勞信息，以促進銷售或有償效勞的經(jīng)濟應用文?！皬V告〞一詞，來源于西方。英語稱之為Advertise。源出于拉丁語Advetteze，含義為‘注意’、‘誘導’。

53分類：

按傳播媒體形式分：報刊雜志廣告播送電視廣告路牌廣告櫥窗展示廣告郵寄廣告按作用分：商品廣告招聘廣告效勞廣告54廣告詞，也稱廣告文案或廣告文稿，是指在廣告作品中用以表達廣告主題和創(chuàng)意的語言文字，它是廣告的核心。55標題作品欣賞：標題：誰來電，讓我心頭一震〔ERICSSON雜志廣告〕56竹葉青茶葉平面廣告〔香篇〕：文案:暗香浮動竹葉青，品“竹葉青〞，細聞其香，雖無茉莉之馥都，但有山水之清芳，至純至真，此刻，品茗漸入佳境……57正文寫法：58正文證明體。比方：山東蘭陵美酒，曾榮獲1915年巴拿馬國際博覽會金質(zhì)獎章。1980年獲山東優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品證書，1987年獲“中國第一屆黃酒節(jié)〞一等獎。陳述體。大致分為條款式和文章式兩種。比方，廣西永福制藥廠的廣告：“永?？h是名貴特產(chǎn)羅漢果之鄉(xiāng)，羅漢果味甜、性涼，具有清熱潤肺、止咳化痰、生津止渴、潤腸通便、益肝健脾以及促進腸胃機能、降低血壓等成效〞。對話體。形式活潑，有親切感。59ΧΧ牌超濃縮洗衣粉