酶與酶工程課件

抗體酶

Abzyme一概述二機(jī)制三製備四應(yīng)用

1946年,諾貝爾獎(jiǎng)二次得主美國(guó)化學(xué)家LinusPauling提出酶催化反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)理論：酶催化化學(xué)反應(yīng)的機(jī)制在於：酶能與高能、短壽命的過(guò)渡態(tài)（激發(fā)態(tài)）相結(jié)合，在這個(gè)處?kù)斗磻?yīng)底物和產(chǎn)物之間的過(guò)渡態(tài)構(gòu)型中，某些鍵斷裂而另一些鍵形成，從而大大降低了化學(xué)反應(yīng)的活化能。

一、抗體酶的發(fā)現(xiàn)與研究思路

酶的催化機(jī)理是降低活化能

能與過(guò)渡態(tài)結(jié)合的抗體也具有酶的性質(zhì)

根據(jù)Pauling理論，WilliamJencks於1969年預(yù)言：若能找到對(duì)應(yīng)某反應(yīng)過(guò)渡態(tài)的抗體，將其加入該反應(yīng)體系中，就可觀測(cè)到這個(gè)抗體對(duì)該反應(yīng)的催化效應(yīng)。也即：抗體若能與某化學(xué)反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)結(jié)合，則這樣的抗體必也能像酶一樣，使其活化能降低，從而幫助大量反應(yīng)物分子跨越能障，達(dá)到加速反應(yīng)的目的。這就意味著，抗體一旦能與過(guò)渡態(tài)相結(jié)合，它就具有酶的性質(zhì)，即在溫和條件下高效專屬地催化學(xué)反應(yīng)。

LinusCarlPauling

尋找過(guò)渡態(tài)類似物作為半抗原產(chǎn)生的抗體可能具有酶活性

由於ES?過(guò)渡態(tài)中間物的半衰期很短，實(shí)踐中很難獲得反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)，若設(shè)計(jì)和製備穩(wěn)定的過(guò)渡態(tài)類似物（能夠模擬一個(gè)酶催化反應(yīng)過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定物質(zhì)，它能與相應(yīng)的酶緊密結(jié)合而成為該酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑），以此替代反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)作為半抗原，誘導(dǎo)與其互補(bǔ)構(gòu)像的抗體，這樣產(chǎn)生的抗體就能識(shí)別反應(yīng)過(guò)程的真正過(guò)渡態(tài)，該抗體即有酶催化反應(yīng)的基本特徵，可能成為一種具有酶活性的抗體。

如願(yuàn)以償

在1986年，加利福尼亞實(shí)驗(yàn)室的Lerner和Schultz同時(shí)報(bào)導(dǎo)了成功製備具有催化能力的單克隆抗體---催化抗體，證實(shí)了抗體和酶一樣，能專一催化化學(xué)反應(yīng)的事實(shí)。此後，抗體酶才從理論變?yōu)榱爽F(xiàn)實(shí)。

目前，抗體酶的研究方向是如何提高酶的效率以及免疫學(xué)中的應(yīng)用。

PeterSchultzAquestion:

抗體酶是酶還是抗體？

二、抗體酶的結(jié)構(gòu)與機(jī)制

什麼是酶(enzyme)？酶——活細(xì)胞產(chǎn)生，起生物化學(xué)反應(yīng)催化劑作用的蛋白質(zhì)。

什麼是抗體（antibody，Ab）？抗體——是B細(xì)胞識(shí)別抗原後增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要存在於血清等體液中,能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能。

其本質(zhì)是一類免疫球蛋白。

抗體結(jié)構(gòu)

抗體分子是由兩條輕鏈(lightchain,L鏈)和兩條重鏈(heavychain,H鏈)通過(guò)鏈間二硫鍵連接而成的四肽鍵結(jié)構(gòu)。經(jīng)蛋白酶水解後分為抗原結(jié)合片段(antigenbindingfragment,Fab)

和可結(jié)晶片段(crystallizabefragement,Fc)；位於H和L鏈的N-端的可變區(qū)是抗原的結(jié)合位點(diǎn),由約110個(gè)氨基酸構(gòu)成(variableregion,V)。其中H鏈含4個(gè)超變區(qū)段，L鏈含3個(gè)超變區(qū)段，加上兩條鏈的組合，就可產(chǎn)生108以上種抗體分子。

抗體酶模型

抗體酶——Abzyme

是酶的高效催化能力和抗體的高度選擇性巧妙結(jié)的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋（Ig），在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。因此，催化抗體又稱抗體酶。通過(guò)一系列化學(xué)和生物技術(shù)方法製備出具有催化活性的抗體，除了具有相應(yīng)的免疫學(xué)性質(zhì)，還類似於酶，具有各種催化特性。所以，其實(shí)抗體酶是一種特殊的抗體，它有著催化特性，可謂是酶和抗體性質(zhì)的兼得。所以又被稱為催化抗體。（Catalyticantibody）

抗體酶的作用機(jī)制

酶和抗體的本質(zhì)差別在於：酶是能和反應(yīng)過(guò)渡態(tài)

(激發(fā)態(tài)分子)選擇結(jié)合的催化物質(zhì)。而抗體是和基態(tài)分子選擇結(jié)合的催化物質(zhì),它們識(shí)別底物的機(jī)理是相同的。如果以激發(fā)態(tài)的分子為半抗原激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體,那麼這種抗體就可能像酶一樣催化經(jīng)過(guò)此過(guò)渡態(tài)的化學(xué)反應(yīng)。由於在實(shí)踐中很難獲得反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)，激發(fā)態(tài)的過(guò)渡態(tài)分子不可能作為抗原來(lái)產(chǎn)生抗體，所以對(duì)某一特定的酶催化的化學(xué)反應(yīng),可以合成一種穩(wěn)定態(tài)分子,它在帶電性能,幾何形狀與反應(yīng)過(guò)渡態(tài)分子結(jié)構(gòu)類似。這種穩(wěn)定態(tài)分子即為過(guò)渡態(tài)類似物。

設(shè)計(jì)和製備穩(wěn)定的過(guò)渡態(tài)類似物，以此代替反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)作為半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，這樣產(chǎn)生的抗體就能識(shí)別反應(yīng)過(guò)程的真正過(guò)渡態(tài)，該抗體具有酶催化反應(yīng)的基本特徵，可能成為一種具有酶活性的抗體。這就是我們所稱的抗體酶。

抗體酶與天然酶相比其優(yōu)勢(shì)何在？（1）抗體酶可以達(dá)到專一催化某一底物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)。（2）抗體酶能催化那些理論上認(rèn)為非常不利的反應(yīng)。（3）抗體酶能催化那些天然酶不能催化的反應(yīng)。

(4)不僅提供了人工生物催化劑，而且提供了研究生物催化過(guò)程的新途徑。

抗體的種類非常多，免疫系統(tǒng)可以擁有上億種抗原特異性不同的抗體分子。應(yīng)用抗體的種類繁多以及抗體酶的可誘導(dǎo)、可改造的特點(diǎn)，有望能製備出具有治療和輔助治療某些疾病和催化某類具有特殊意義反應(yīng)的抗體酶。

Aquestion:

如何讓抗體具有酶活性？

抗體酶製備的基本原理

按照現(xiàn)代酶學(xué)理論，酶首先要和底物結(jié)合，使底物向過(guò)渡態(tài)轉(zhuǎn)化，然後再在催化基團(tuán)的作用下促進(jìn)底物進(jìn)行反應(yīng)。免疫反應(yīng)和酶反應(yīng)十分相似，抗體也能專一地、高親和力地與抗原物質(zhì)結(jié)合，然後再促使抗原發(fā)生各種變化。如果能適當(dāng)?shù)馗淖兛贵w中與抗原結(jié)合部位的微環(huán)境，並在適當(dāng)部位引入相應(yīng)的催化基團(tuán)，那就有可能使抗體轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写呋阅艿目贵w酶。三、抗體酶的製備制備方法誘導(dǎo)法基因工程法拷貝法導(dǎo)入法修飾法

誘導(dǎo)法

採(cǎi)用過(guò)渡態(tài)的底物類似物誘導(dǎo)

(transitionstateanalogue)

作為酶的抑制劑的過(guò)渡態(tài)類似物是穩(wěn)定的，因此利用抗體能與抗原特異結(jié)合的原理，可用過(guò)渡態(tài)的類似物作為半抗原來(lái)誘發(fā)抗體，這樣產(chǎn)生的抗體便能特異的識(shí)別反應(yīng)過(guò)程中真正的過(guò)渡態(tài)分子！

首先設(shè)計(jì)和製備過(guò)渡態(tài)的底物類似物，以它作為半

抗原（hapten），再和載體蛋白質(zhì)一起免疫動(dòng)物，然後

分出脾細(xì)胞，進(jìn)而和骨髓瘤細(xì)胞融合，選出對(duì)半抗原有

高親和力的克隆，使之在培養(yǎng)介質(zhì)中生長(zhǎng)擴(kuò)增，最后選

擇、純化產(chǎn)生的具有催化活性的單克隆抗體。此法的關(guān)

鍵是要設(shè)計(jì)和獲得適當(dāng)?shù)倪^(guò)渡態(tài)底物類似物作為半抗原?！把u備”抗原：設(shè)計(jì)過(guò)渡態(tài)類似物合成半抗原半抗原－載體雜交瘤細(xì)胞製備：免疫小鼠與骨髓瘤細(xì)胞結(jié)合限制性稀釋篩選與半抗原具有高親和力的克隆製備單克隆抗體：將細(xì)胞培養(yǎng)於腹水液或培養(yǎng)介質(zhì)中生產(chǎn)單抗純化單抗篩選抗體酶：篩選具有催化性能的單抗

簡(jiǎn)言之——

誘導(dǎo)法是選擇適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)模型物與載體蛋白連接後給動(dòng)物免疫，通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選和分離單克隆抗體（所得抗體催化效果的好壞很大程度上取決於化學(xué)模型物的設(shè)計(jì)）。

基因工程法

對(duì)於已經(jīng)獲得的單抗，分析其氨基酸序列和相應(yīng)基因的堿基序列，將抗原結(jié)合部位的基因換上編碼有催化作用的氨基酸的基因，這就是基因工程法制備抗體酶的主要內(nèi)容。基因工程的技術(shù)使得建立抗體基本的組合文庫(kù)，並根據(jù)需要構(gòu)建適當(dāng)序列的基因片斷已成為可能。利用抗體庫(kù)技術(shù)，在將來(lái)也許有可能繞開(kāi)免疫，產(chǎn)生完全由基因工程構(gòu)建的全新抗體酶。

拷貝法

用已知酶作為抗原免疫動(dòng)物，通過(guò)單克隆技術(shù)，制得抗該種酶的抗體。再以此種抗體免疫動(dòng)物，再次採(cǎi)用單克隆技術(shù)，經(jīng)篩選與純化，就可獲得具有原來(lái)酶活性的抗體酶(因?yàn)榭乖c該抗產(chǎn)生的抗體具有互補(bǔ)性，經(jīng)過(guò)上述兩次拷貝，就把酶的活性部位的資訊翻錄到抗體酶上，使該抗體酶能高選擇性地催化原酶所催化的反應(yīng))。這種方法對(duì)自然界來(lái)源稀少的緊缺酶，不失為一種有價(jià)值的有潛力的方法。

導(dǎo)入法在現(xiàn)有的抗體基礎(chǔ)上，借助化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的辦法將催化基團(tuán)引入到已有底物結(jié)合能力的抗體的抗原結(jié)合部位上?？梢話?cǎi)用選擇性化學(xué)修飾的方法將人工合成的或天然存在的催化基團(tuán)引入到抗原結(jié)合部位；也可採(cǎi)用寡核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù)將特定的氨基酸殘基引入抗原結(jié)合部位，使其獲得催化功能。化學(xué)修飾法

抗體酶和酶一樣也可以用化學(xué)修飾的方法加以改造。對(duì)抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和的方法，在抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基團(tuán)。

游離巰基就是適合的基團(tuán)之一,它具有高親核性,易於氧化,及能通過(guò)二硫化物進(jìn)行交換反應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點(diǎn)。Schultz等在IgAMOP315抗體結(jié)合部位選擇性的引入了親核性的巰基。其方法如下:用含有易裂解鍵(如二硫鍵或硫鍵)的親和力標(biāo)記試劑,在NaCNBH3存在下,對(duì)抗體進(jìn)行親和力標(biāo)記,將標(biāo)記的抗體通過(guò)親和力色譜而純化,然後標(biāo)記物被裂解形成活潑的二硫化物。大量的催化基團(tuán)能夠通過(guò)二硫化物的交換反應(yīng)而引入。通過(guò)此方法,在IgAMOP315抗體的結(jié)合部位引入了巰基(-SH),其催化香豆酯水解的速度比照樣相提高了6×104倍。

四、抗體酶的應(yīng)用前景

在抗體酶被發(fā)現(xiàn)的13年以後，他們才開(kāi)始進(jìn)入商業(yè)領(lǐng)域。目前已有一些公司，比如：美國(guó)的Med-Immune和Prolifaron公司以及以色列的AdvancedBiotechLtd.致力於抗體酶的商業(yè)應(yīng)用，並且取得了一些業(yè)績(jī)。

（一）、人工設(shè)計(jì)一些抗體酶來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)某些手性藥物的立體專一性合成和非酶催化系統(tǒng)的反應(yīng)的催化。包括催化酯水解、糖苷鍵水解、Diels-Alder反應(yīng)和Oxy-Cope重排反應(yīng)等。在催化萘普生乙酯水解的抗體酶研究中，發(fā)現(xiàn)所獲得的多克隆和單克隆抗體都能立體專一性地水解R構(gòu)型的萘普生乙酯，從而開(kāi)闢了一條抗體酶用於手性合成的道路，此技術(shù)已獲授權(quán)發(fā)明專利。

（二）、有很多世界知名的實(shí)驗(yàn)室提出了許多不同的方案，期望將抗體酶技術(shù)應(yīng)用於醫(yī)藥製造方面。其中之一就是利用抗體酶的水解產(chǎn)物來(lái)啟動(dòng)一些藥物前體,通過(guò)瞄準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞活性，藥物前體就能直接作用於腫瘤細(xì)胞，並且轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒素的化合物。

（三）、一個(gè)在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用是利用抗體酶來(lái)特異性的水解可卡因。目前美國(guó)的哥倫比亞大學(xué)正致力於這方面的研究，希望可以找到解決過(guò)量吸食毒品的方案。用可卡因磷酸單酯過(guò)渡態(tài)類似物為抗原製備的抗體酶能催化可卡因中苯甲醯基團(tuán)的水解，其水解產(chǎn)物芽子堿甲酯和苯甲酸不具有可卡因的刺激作用，這為治療可卡因依賴性的患者提供了可能。

以色列的AdvancedBiotechLtd.正在試圖利用抗體酶技術(shù)生產(chǎn)一種藥物來(lái)對(duì)付革蘭氏陰性膿血癥。

所有這些對(duì)抗體酶的研究都是為了得到一種具有特定序列的蛋白酶，從而為抗癌療法以及新型疫苗的獲得開(kāi)闢一條新的道路。1、在診斷肝炎方面的應(yīng)用

利用抗體酶技術(shù)可以方便的診斷出丙型,丁型,戊型肝炎.比如對(duì)於戊型肝炎,目前已經(jīng)研製出一種IgM抗體酶免檢測(cè)試劑盒。此試劑盒採(cǎi)用間接ELISA法，檢測(cè)戊型肝炎病毒IgG抗體，包被抗原為合成肽(ORF2和ORF3)，酶標(biāo)抗體為辣根酶標(biāo)記的抗－μ單抗，試劑全部工作液化，可直接使用，包被板採(cǎi)用可掰板，可單人份檢測(cè)，反應(yīng)過(guò)程為50分鐘.

2、在診斷胃腸道惡性腫瘤的應(yīng)用

根據(jù)中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜誌(CHINESEJOURNALOFLABORATORYMEDICINE)的介紹，對(duì)於結(jié)直腸癌的輔助診斷和監(jiān)測(cè)，常用的血清腫瘤生物學(xué)標(biāo)誌為癌胚抗原（CEA）、癌相關(guān)糖抗原（CA）19-9、CA72-4及CA242等。根據(jù)抗腫瘤單克隆抗體證實(shí)，血清腫瘤標(biāo)誌均為非特異的腫瘤相關(guān)抗原［1］，其檢測(cè)腫瘤的敏感性及特異性均有限。嘗試將以上與結(jié)直腸癌有關(guān)的血清腫瘤標(biāo)誌進(jìn)行手術(shù)前後測(cè)定及單項(xiàng)、雙項(xiàng)、3項(xiàng)、4項(xiàng)聯(lián)合測(cè)定並進(jìn)行比較，目的在於對(duì)各腫瘤標(biāo)誌在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)，並選擇較佳的血清腫瘤標(biāo)誌組合，以提高檢測(cè)結(jié)直腸癌的敏感性。

用基因工程人源化的抗體酶代替從細(xì)菌中得到對(duì)人體有毒副作用的天然酶，把該抗體酶與癌細(xì)胞表面抗原特異抗體結(jié)合，利用特異抗體，把抗體酶帶到癌細(xì)胞的周圍，分解藥物前體，專一殺死癌細(xì)胞，大大減少了化療的毒副作用。

3、在診斷愛(ài)滋病方面的應(yīng)用

愛(ài)滋?。ˋIDS）是感染愛(ài)滋病病毒（HIV）後免疫功能逐漸喪失的結(jié)果。研究證明，除血液標(biāo)本外，HIV感染者的尿液、唾液、淚液、精液中均可檢測(cè)到抗HIV抗體。愛(ài)滋病的診斷一直以來(lái)以血清學(xué)檢查陽(yáng)性為基礎(chǔ)。最近，一種新的愛(ài)滋病診斷試劑———尿液HIV－1抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)。

尿液HIV－1抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑與血清學(xué)診斷試劑比較，有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：它不僅和血液HIV抗體酶聯(lián)免疫診斷檢測(cè)方法一樣，具有較好的可信度，而且尿液中一般不存在HIV病毒，無(wú)針頭採(cǎi)集尿液標(biāo)本，不會(huì)引起皮膚損傷，消除了收集血液標(biāo)本過(guò)程中引起的病毒傳播的可能；其次尿液收集簡(jiǎn)便易行，便於大規(guī)模篩查。由於採(cǎi)樣過(guò)程不需要針刺，建立在無(wú)損傷收集標(biāo)本的基礎(chǔ)上，消除了與職業(yè)暴露相關(guān)的危險(xiǎn)因素，可以保護(hù)醫(yī)護(hù)人員和被檢測(cè)者避免查體時(shí)因針刺意外感染肝炎或愛(ài)滋病病毒的危險(xiǎn)。因此，該檢測(cè)試劑可用於除血源篩查以外人群的愛(ài)滋病HIV－1抗體篩查。4、在診斷妊娠反應(yīng)方面的應(yīng)用

單克隆抗體酶標(biāo)絨毛膜促性腺激素檢測(cè)法這是目前最先進(jìn)的妊娠試驗(yàn)，靈敏度極高,陽(yáng)性率幾乎百分之百。用本法可在受精後10天左右即在停經(jīng)之前就能確定診斷，而且操作簡(jiǎn)單，人人都能學(xué)會(huì)，也可以在家庭使用。

小結(jié)

取得了很大進(jìn)展

抗體酶研究已取得很大進(jìn)展，建立了製備抗體酶的技術(shù)（包括免疫法.化學(xué)法.基因工程和蛋白質(zhì)工程等方法），通過(guò)這些技術(shù)不僅從單克隆抗體中獲得了酶催化活性，而且從多克隆抗體中也獲得了酶催化活性。個(gè)別抗體酶的催化反應(yīng)已接近於天然酶的水準(zhǔn)，天然酶催化的六大化學(xué)反應(yīng)，抗體酶都可以進(jìn)行催化?？贵w酶還可以催化天然酶不能催化的反應(yīng)，在工業(yè)及醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的潛力已初見(jiàn)端倪。

存在的問(wèn)題

儘管抗體酶的研究已取得很大進(jìn)展，但還存在一些需要進(jìn)一步發(fā)展的問(wèn)題，如催化機(jī)制的研究。儘管像瑞士的諾華和美國(guó)的Bristol-MyerSquibb這樣的跨國(guó)公司已經(jīng)對(duì)於抗體酶的研究運(yùn)用產(chǎn)生了很大的興趣，並且已經(jīng)與Dr.Lerner領(lǐng)導(dǎo)的研究小組進(jìn)行了合作，共同開(kāi)發(fā)抗癌藥物。但目前對(duì)於抗體酶在工業(yè)方面的大部分應(yīng)用還是處?kù)秾?shí)驗(yàn)階段。

綜上所述，催化抗體的出現(xiàn)不僅為人們開(kāi)創(chuàng)了一條人工設(shè)計(jì)酶的新方法，也是人們對(duì)催化過(guò)程中催化劑的作用機(jī)理和催化劑與底物的相互識(shí)別有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。它無(wú)疑會(huì)對(duì)化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。當(dāng)然，抗體酶研究和運(yùn)用還是剛剛起步，很多實(shí)踐和理論上的東西有待解決。

在理論上：對(duì)抗體酶的催化效率的預(yù)測(cè)還剛起步；

在實(shí)踐上：還沒(méi)有找到一個(gè)普遍可行的篩選法；

在應(yīng)用上：沒(méi)有找到真正運(yùn)用的抗體酶；

最重要的一點(diǎn)是：抗體酶與天然酶相比，抗體酶的催化效率和轉(zhuǎn)換數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低於天然酶，還不能成為真正意義上的酶。但隨著抗體酶研究的深入，特別是抗體酶製備技術(shù)的成熟以及抗體酶結(jié)晶學(xué)研究的不斷深入，科學(xué)家有希望達(dá)到有目的地改造和構(gòu)建抗體酶，使之成為真正意義上的酶！

酶分子修飾與模擬

酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其他催化劑所無(wú)法比擬的。因此，日益增多的酶製劑已用於食品發(fā)酵、疾病診治和預(yù)防、環(huán)境保護(hù)和監(jiān)測(cè)、化工產(chǎn)品的生產(chǎn)，以及基因工程等生物技術(shù)領(lǐng)域。但是酶在實(shí)際應(yīng)用中有局限性：1、作為異體蛋白在體內(nèi)難於吸收、易引起免疫反應(yīng)和被識(shí)別降解；2、酶蛋白經(jīng)不起溫度、酸堿、有機(jī)溶劑及時(shí)間的考驗(yàn)，

半衰期短、易變性失活；3、酶的活性、作用專一性和最適條件不一定能適應(yīng)生產(chǎn)工藝要求，限制了酶製劑的應(yīng)用範(fàn)圍。

對(duì)策——

酶分子工程

（MOLECULARENGINEERINGOFTHEENZYME）

分子酶工程可以從分子水準(zhǔn)改造酶，彌補(bǔ)天然酶的缺陷，並賦予它們某些新的機(jī)能和優(yōu)良特性。隨著各學(xué)科及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，特別是對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能的深入瞭解、基因工程及固定化技術(shù)的普及，使酶分子工程已進(jìn)入實(shí)用階段?？傮w來(lái)說(shuō)酶的分子工程分兩部分：一是分子生物學(xué)水準(zhǔn)，即用基因工程方法對(duì)DNA或RNA進(jìn)行分子改造，以獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更理想的酶蛋白；二是對(duì)天然酶分子進(jìn)行改造（包括酶一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側(cè)鏈修飾等)。

酶分子工程主要有以下幾方面的內(nèi)容1）化學(xué)修飾（一級(jí)結(jié)構(gòu)改造）：對(duì)酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)、酶活性中心中的必需基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，改造酶性能、研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)係；2）變性、誘導(dǎo)與構(gòu)象重建（高級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)整）3）蛋白質(zhì)工程（基因水準(zhǔn)定位突變）：用分子生物學(xué)方法克隆酶或修飾基因以便產(chǎn)生新的酶（如突變酶），或設(shè)計(jì)新基因合成自然界不存在的新酶（如抗體酶）4）固定化酶：通過(guò)對(duì)酶分之內(nèi)或分之間的交聯(lián)，或與水不容性載體的結(jié)合製成，催化特定的反應(yīng)。5）模擬酶：用化學(xué)方法合成新的有機(jī)催化劑，使其具有酶活性。

一、酶的化學(xué)修飾（一級(jí)結(jié)構(gòu)水準(zhǔn)的改造）

（原理、方法、應(yīng)用）

化學(xué)修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎(chǔ)上，能夠在較大範(fàn)圍內(nèi)改變酶的性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的優(yōu)良特性，甚至創(chuàng)造出新的活性。

化學(xué)修飾方法雖多，但基本都是利用修飾劑所具有的各種化學(xué)基團(tuán)特性，或直接或經(jīng)過(guò)一定的活化過(guò)程，與酶分子上某氨基酸殘基（一般儘量選酶活性非必需基團(tuán)）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。1、化學(xué)修飾原理

凡通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去而使酶蛋白共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（側(cè)鏈基團(tuán)的取代、肽鏈的限制性水解、分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)），都可稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。達(dá)到：改造酶的作用特性（包括改變酶活性、專一性、對(duì)效應(yīng)物回應(yīng)性能及對(duì)輔助因數(shù)的要求）提高酶的穩(wěn)定性擴(kuò)大在體內(nèi)應(yīng)用可能性（防止在體內(nèi)非專一性水解、減少和消除免疫原性以利於醫(yī)療應(yīng)用）

用纖維蛋白的專一性單克隆抗體修飾尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍

用乙醛酸修飾胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成親水性的α－NHCH2COOH後，該酶對(duì)60°C熱處理的穩(wěn)定性增高了1000倍。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、L－穀氨醯胺酶、L－門(mén)冬醯胺酶、尿酸酶等用PEG修飾後，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，減慢了它們?cè)趧?dòng)物血液迴圈中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。2、化學(xué)修飾方法的幾個(gè)問(wèn)題

決定化學(xué)修飾成敗的關(guān)鍵是修飾的專一性，儘量少破壞必需基團(tuán)，得到高的酶活力回收。為此，有時(shí)需要通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)來(lái)確定。其中：對(duì)酶性質(zhì)的瞭解：活性部位、穩(wěn)定條件、反應(yīng)最佳條件及側(cè)鏈基團(tuán)性質(zhì)等；選擇修飾劑考慮：1）分子量、修飾劑鏈長(zhǎng)和對(duì)蛋白吸附性；2）修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置；3）修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法和條件（一般要求較大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有較多反應(yīng)活性基團(tuán)）；選擇酶反應(yīng)條件要注意：1）反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、PH、溫度、時(shí)間；2）酶與修飾劑的比例。參考：酶工程P.86(1)、試劑的選擇—要根據(jù)修飾目的選擇

例如對(duì)氨基修飾可有幾種情況——修飾所有氨基而不修飾其他基團(tuán)；僅修飾

-氨基；修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基；修飾具有催化活性的氨基；例：如果修飾目的是希望改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)或溶解性，則必須選擇能引入最大電荷量的試劑。。。。（酶工程P86）用於修飾酶活性部位氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備：選擇性地與一個(gè)氨基酸殘基反應(yīng)；反應(yīng)在酶蛋白不變性條件下進(jìn)行；所標(biāo)記的殘基在肽鏈中穩(wěn)定以易於分離鑒定；修飾反應(yīng)的程度能簡(jiǎn)單測(cè)定；最常用的修飾劑——PEG類修飾劑

聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)通常沒(méi)有免疫原性和毒性,不會(huì)破壞生物分子的活性，其生物相容性已通過(guò)美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)認(rèn)證。特別是當(dāng)酶經(jīng)過(guò)PEG類修飾劑修飾後，修飾劑的許多優(yōu)良性質(zhì)也會(huì)在修飾蛋白中得到體現(xiàn)。PEG分子末端有兩個(gè)能被活化的-OH基團(tuán)，化學(xué)修飾時(shí)則多採(cǎi)用甲氧基聚乙二醇(MPEG)的衍生物為修飾劑。PEG分子量範(fàn)圍很寬，適合用作修飾劑或修飾劑出發(fā)原料的PEG的相對(duì)分子品質(zhì)一般為500～20000。

PEG既溶於水，又溶於絕大多數(shù)有機(jī)溶劑，但不溶於乙醚、脂肪烴。(2)、反應(yīng)條件的選擇不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性（通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)）；有利於專一性修飾（小心控制條件，盡可能在酶蛋白特定構(gòu)象不變或少變的情況下進(jìn)行）；溫度、PH、反應(yīng)介質(zhì)和緩沖液；修飾劑專一性；

在所有影響化學(xué)修飾的反應(yīng)條件中,PH值是最重要的一個(gè)條件,因?yàn)樗鼪Q定了具有潛在反應(yīng)能力的功能基團(tuán)所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的解離狀態(tài)。一般情況下,增加PH可以提高反應(yīng)速率,降低PH可以減小反應(yīng)速率。反應(yīng)活性較高的修飾劑可以在生理PH下與蛋白質(zhì)耦合;而反應(yīng)活性較低的修飾劑通常需要較高的PH。修飾反應(yīng)的專一性則對(duì)應(yīng)有一個(gè)優(yōu)化PH值。(3)、反應(yīng)的專一性

除考慮修飾試劑專一性、控制反應(yīng)條件外，還可利用其他途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)修飾專一性：

利用酶蛋白質(zhì)分子中某些基團(tuán)的特殊性（如蛋白酶的絲氨酸與DFP）；選擇不同的PH以控制相關(guān)功能基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而有利於專一修飾（如鹵代乙酸對(duì)半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸等的作用）；

親和標(biāo)記試劑（如甲基苯磺醯氟作用於胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸上）；

差示標(biāo)記（在底物或抑制劑存在下進(jìn)行化學(xué)修飾）；

利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異（如在結(jié)晶狀態(tài)下反應(yīng)）；

利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性；

使用非特異試劑對(duì)特殊基團(tuán)的標(biāo)記；

非特異性試劑：不能區(qū)分活性部位內(nèi)和活性部位外基團(tuán)的試劑。

特殊基團(tuán):某些酶的活性部位含有活性部位以外沒(méi)有的氨基酸殘基，如（-HS基）。例如：木瓜蛋白酶中有7個(gè)半胱氨酸殘基，其中的6個(gè)形成三對(duì)二硫橋，只有一個(gè)殘基以自由巰基形式存在於活性部位，這時(shí)就可以用任何一種巰基試劑來(lái)標(biāo)記（如碘乙酸）得到巰基修飾與活力喪失相平行的結(jié)果。若是非特殊基團(tuán)，要充分利用活性部位中某一基團(tuán)具有特別高的反應(yīng)性的有利條件進(jìn)行化學(xué)修飾。（如胰凝乳蛋白酶的Ser-195與DFP的作用）+x-y

親和標(biāo)記主要利用酶和底物特異結(jié)合的性質(zhì)設(shè)計(jì)標(biāo)記試劑。

差示標(biāo)記是非特異性試劑標(biāo)記的一個(gè)發(fā)展，要求被標(biāo)記的活性部位基團(tuán)有特殊靈敏的反應(yīng)性。+RRR(a)+PP+RRP-PR+R*RR*(b)（4）、酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的常用修飾水溶性的碳二亞胺類特定修飾酶的羧基；賴氨酸氨基的烷基化（鹵代乙酸等）；具有兩個(gè)臨位羰基的化合物修飾精氨酸胍基（丁二酮等）；烷基化試劑修飾巰基；碘代乙酸修飾組氨酸咪唑基；還有色氨酸吲哆基、甲硫氨酸甲硫基、酚基、脂肪族羥基等；二硫鍵的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾羧基的化學(xué)修飾

應(yīng)用比較多的修飾方法1.酶的表面化學(xué)修飾

(1).大分子修飾：可溶性大分子，其中相對(duì)分子量在500-20000u範(fàn)圍內(nèi)的PEG（聚乙二醇）類修飾劑應(yīng)用最廣，既能溶於水，又可以溶於大多數(shù)的有機(jī)溶劑，它一般沒(méi)有免疫原性和毒性?；瘜W(xué)修飾時(shí)多採(cǎi)用單甲氧基聚乙二醇（MPEG)(2).小分子修飾：利用小分子化合物對(duì)酶的活性部位或活性部位之外的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，以改變酶學(xué)性質(zhì)。已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖，乙酸酐，硬脂酸，鄰苯二酸酐等。(3).交聯(lián)修飾：使用雙功能基團(tuán)試劑如戊二醛，PEG等將酶蛋白分子之間，亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分間進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，可使酶分子活性結(jié)構(gòu)加固，並可提高其穩(wěn)定性，增加了酶在非水溶液中的使用價(jià)值。(4).固定化修飾：通過(guò)酶表面的酸性或鹼性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上後，由於酶所處的微環(huán)境的改變，會(huì)使酶的性質(zhì)（最適ph，最適溫度，穩(wěn)定性等）改變。2.酶分子內(nèi)部修飾(1).非催化活性基團(tuán)的修飾(2).蛋白主鏈的修飾(3).催化活性基團(tuán)的修飾(4).與輔因數(shù)相關(guān)的修飾

3.結(jié)合定點(diǎn)突變的化學(xué)修飾

通過(guò)一些可控制的方法在酶的關(guān)鍵活性位點(diǎn)引入一個(gè)氨基酸殘基，然後利用化學(xué)修飾法將突變的氨基酸殘基進(jìn)行修飾，引入一個(gè)小分子化合物，得到一種稱為化學(xué)修飾突變酶（CMM)的新型酶。3、酶化學(xué)修飾的應(yīng)用

酶經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾後會(huì)產(chǎn)生的變化：1.提高生物活性；2.增強(qiáng)在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性；3.針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力，解除免疫原性；4.產(chǎn)生新的催化能力；

在醫(yī)藥方面：化學(xué)修飾可以提高醫(yī)用酶的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)它在體內(nèi)半衰期，抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生，降低免疫原性和抗原性。

在生物技術(shù)領(lǐng)域：化學(xué)修飾酶能夠提高酶對(duì)熱，酸，堿和有機(jī)溶劑的耐性，改變酶的底物專一性和最適ph等酶學(xué)性質(zhì)。

在酶結(jié)構(gòu)功能研究中：1.研究酶空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)係，如酶的活性中心研究；2.確定氨基酸殘基的功能；3.測(cè)定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量。4、酶蛋白化學(xué)修飾的局限性1.某種修飾劑對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)修飾專一性是相對(duì)的，很少有對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈絕對(duì)專一的化學(xué)修飾劑。2.化學(xué)修飾後酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變，因此這種構(gòu)象的變化將妨礙對(duì)修飾結(jié)果的解釋。3.酶的化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行，目前還不能用化學(xué)修飾的方法研究非極性氨基酸殘基在酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)係中的作用。4.酶化學(xué)修飾的結(jié)果對(duì)於研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)係能提供一些資訊，如某一氨基酸殘基被修飾後，酶活力完全喪失，說(shuō)明該殘基是酶活性所“必需”的，為什麼是必需的，還得用X射線和其他方法來(lái)確定。因此化學(xué)修飾法研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)係尚缺乏準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性。（二）、變性、誘導(dǎo)與構(gòu)象重建

（對(duì)酶高級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)整）

酶肽鏈變性鬆散後，使其在有底物類似物或抑制劑存在的非天然條件下複性，酶將折疊成所需要的特殊結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生新的性狀，此即變性誘導(dǎo)構(gòu)象重建的原理

實(shí)驗(yàn)證據(jù)：在8mol/L尿素存在下，用巰基乙醇處理天然RNase,其二硫鍵全部斷裂，肽鏈鬆散，活性全部喪失，但當(dāng)用透析法除去尿素、巰基乙醇後，RNase活力全部恢復(fù)，而且復(fù)原後產(chǎn)物其物化性質(zhì)與天然RNase完全相同；然而在隨機(jī)情況下，8個(gè)HS—形成4個(gè)—S—S時(shí)，應(yīng)有105種不同方式，但在復(fù)原過(guò)程中，走向隨機(jī)的RNase肽鏈卻只選擇了其中一種方式（即與天然構(gòu)象完全相同）.

（三）、蛋白質(zhì)工程

（基因水平上進(jìn)行蛋白質(zhì)改造）以重組DNA技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合X-衍射分析技術(shù)、蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象理論及電腦輔助設(shè)計(jì)發(fā)展起來(lái)的一種定點(diǎn)定位修飾技術(shù)體系，也是在基因水準(zhǔn)進(jìn)行蛋白質(zhì)改造的技術(shù)科學(xué)。常用：化學(xué)全合成法、限制酶酶切片斷取代法等。蛋白質(zhì)工程在酶的改造方面目前研究比較系統(tǒng)的例子是組織型血纖維蛋白溶酶原啟動(dòng)劑（TpA）P81蛋白質(zhì)工程的主要方法化學(xué)全合成法限制性內(nèi)切核酸酶酶切片段取代法寡核苷酸引物指導(dǎo)的定點(diǎn)突變

二、酶的模擬

早在20世紀(jì)中葉，人們就已認(rèn)識(shí)到研究和模擬生物體系是開(kāi)闢新技術(shù)的途徑之一，並自覺(jué)地把生物界作為各種技術(shù)思想、設(shè)計(jì)原理和發(fā)明創(chuàng)造的源泉，通過(guò)對(duì)生物體系結(jié)構(gòu)與功能的研究，為設(shè)計(jì)和建造新的技術(shù)提供新思想、新原理、新方法和新途徑。酶是自然界經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化而產(chǎn)生的生物催化劑，對(duì)酶這樣的高效催化劑的結(jié)構(gòu)功能的設(shè)計(jì)和模擬，是當(dāng)今自然科學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題之一。模擬酶的基本概念

模擬酶又稱人工酶或酶模型，它是有機(jī)化學(xué)的一個(gè)分支。由於天然酶的種類繁多，模擬的途徑、方法、原理和目的不同，對(duì)模擬酶至今沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的定義。一般認(rèn)為，所謂模擬酶就是利用有機(jī)化學(xué)的方法合成一些比酶簡(jiǎn)單的非蛋白質(zhì)分子，它們可以模擬酶對(duì)底物的絡(luò)合和催化過(guò)程，既可達(dá)到酶催化的高效性，又可以克服酶的不穩(wěn)定性。對(duì)酶的模擬已不僅局限於化學(xué)手段，化學(xué)和分子生物學(xué)方法的結(jié)合使酶模擬更加成熟起來(lái)。模擬酶的分類單純酶模型：以化學(xué)方法通過(guò)天然酶活性的模擬來(lái)重建酶活性；機(jī)理酶模型：通過(guò)對(duì)酶作用機(jī)制如識(shí)別、結(jié)合和過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識(shí)，來(lái)指導(dǎo)模型酶的設(shè)計(jì)和合成；單純合成的酶樣化合物：化學(xué)合成具有酶樣催化劑活性的簡(jiǎn)單分子；目前，較為理想的小分子仿酶體系有環(huán)糊精、冠酶、環(huán)番、環(huán)芳烴和卟啉等大環(huán)化合物；大反子仿酶體系有聚合物酶模型，分子印跡酶模型和膠囊酶模型等。固定化酶

（ImmobilizedEnzyme）

酶在水溶液中不穩(wěn)定，一般不能反復(fù)使用，而且不易與產(chǎn)物分離，不利於產(chǎn)物的提純和精製。針對(duì)這些限制酶廣泛應(yīng)用的因素，將水溶性酶或游離細(xì)胞經(jīng)過(guò)化學(xué)或物理手段處理，將酶束縛在一定的空間內(nèi)，限制酶分子在此區(qū)間進(jìn)行活躍的催化作用，成為不溶於水的固定化的酶或細(xì)胞。

固定化酶的製備方法、性質(zhì)、固定化酶反應(yīng)器和應(yīng)用

1953年，Grubhofev和Schleith首先開(kāi)始了酶固定化研究，並第一次實(shí)現(xiàn)了酶的固定化。

1960年，日本的千畑一郎開(kāi)始了氨基醯化酶固定化研究，開(kāi)始了將固定酶應(yīng)用在工業(yè)上的第一步。

1969年，千畑一郎成功地將氨基醯化酶反應(yīng)用於DL-AA的光學(xué)分析，實(shí)現(xiàn)了酶連續(xù)反應(yīng)的工業(yè)化。這是世界上固定化酶用於工業(yè)的開(kāi)端。

1973年，千畑一郎再次在工業(yè)上成功地固定化大腸桿菌細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了L-天冬氨酸連續(xù)生產(chǎn)。

吸附法包埋法共價(jià)結(jié)合法共價(jià)交聯(lián)法一、固定化酶(細(xì)胞)的製備方法(一)、吸附法吸附法是通過(guò)載體表面和酶分子表面間的

次級(jí)鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法。只需將酶液與具有活潑表面的吸附劑接觸，再經(jīng)洗滌除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最簡(jiǎn)單的固定化技術(shù)，在經(jīng)濟(jì)上也最具有吸引力.

根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)又分為兩種：物理吸附法(physicaladsorption)是通過(guò)氫鍵、疏水鍵等作用力將酶吸附於不溶性載體的方法。常用的載體有：高嶺土、皂土、矽膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微空玻璃等無(wú)機(jī)吸附劑，纖維素、膠原以及火棉膠等有機(jī)吸附劑。離子結(jié)合法(ionbinding)是指在適宜的pH和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換基間的相互作用而達(dá)到酶固定化的方法（離子鍵）。最常用的交換劑有CM-纖維素、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；其他離子交換劑還有各種合成的樹(shù)脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。離子交換劑的吸附容量一般大於物理吸附劑。

影響酶蛋白在載體上吸附程度的因素:1.PH：影響載體和酶的電荷變化,從而影響酶吸附。2.離子強(qiáng)度：多方面的影響，一般認(rèn)為鹽阻止吸附。3.蛋白質(zhì)濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。4.溫度：蛋白質(zhì)往往是隨溫度上升而減少吸附。5.吸附速度：蛋白質(zhì)在固體載體上的吸附速度要比小分子慢得多。6.載體：對(duì)於非多孔性載體，則顆粒越小吸附力越強(qiáng)。多孔性載體，要考慮吸附對(duì)象的大小和總吸附面積的大小。

吸附法的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，可供選擇的載體類型多，吸附過(guò)程可同時(shí)達(dá)到純化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活後可以重新活化和再生。

吸附法的缺點(diǎn)：酶和載體的結(jié)合力不強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致催化活力的喪失和沾汙反應(yīng)產(chǎn)物；經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)。

世界第一例獲得工業(yè)應(yīng)用的固定化酶是

DEAE-SephadexA-25吸附的氨基醯化酶反應(yīng)用於

DL-AA的光學(xué)分析。（二）、包埋法

包埋法是將酶物理包埋在高聚物網(wǎng)格內(nèi)的固定化方法。(如將聚合物的單體和酶溶液混合後，再借助聚合促進(jìn)劑的作用進(jìn)行聚合，將酶包埋於聚合物中以達(dá)到固定化的目的）。

1、凝膠包埋法：

將酶分子包埋在高聚物網(wǎng)格內(nèi)的包埋方法。

聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法：

先把丙烯醯胺單體、交聯(lián)劑和懸浮在緩衝溶液中的酶混合，然後加入聚合催化系統(tǒng)使之開(kāi)始聚合，結(jié)果就在酶分子周圍形成交聯(lián)的高聚物網(wǎng)路。它的機(jī)械強(qiáng)度高，並可以改進(jìn)酶脫落的情況，在包埋的同時(shí)使酶共價(jià)偶聯(lián)到高聚物上，可以減少酶的脫落。

海藻酸鈉也可以用來(lái)作為包埋載體，它從海藻中提取出來(lái)，可被多價(jià)離子Ca2+、Al3+凝膠化，操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)。

K-角叉萊膠（卡拉膠）冷卻成膠或與二、三價(jià)金屬離子成膠。包埋條件溫和無(wú)毒性，機(jī)械強(qiáng)度好。固定化的酶活回收率和穩(wěn)定性都比聚丙烯醯胺法好。

膠原和明膠也是常用的包埋載體。2、微囊化包埋法微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中。膠囊和脂質(zhì)體主要用於醫(yī)學(xué)治療，中空纖維主要適於工業(yè)使用。介面沉澱法是一種簡(jiǎn)單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的介面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。介面聚合法是用化學(xué)手段製備微囊的方法。他所得的微囊外觀好，但不穩(wěn)定，有些酶還會(huì)因在包埋過(guò)程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而失活。

包埋法的優(yōu)點(diǎn)在於它是一種反應(yīng)條件溫和、很少改變酶結(jié)構(gòu)但是又較牢固的固定化方法。

包埋法的缺點(diǎn)是只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過(guò)高聚物網(wǎng)架擴(kuò)散，對(duì)那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶並不適合。這是由於高聚物網(wǎng)架會(huì)對(duì)大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴(kuò)散阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為改變，使活力降低。

（三）、共價(jià)偶聯(lián)法

是目前研究中最為活躍的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基團(tuán)和固相支持物表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，因而將酶固定在支持物上（借助共價(jià)鍵將酶的非活性必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶連）。

共價(jià)偶聯(lián)法中的幾個(gè)影響因素

1、載體的物化性質(zhì)要求載體親水，並且有一定的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，同時(shí)具備在溫和條件下與酶結(jié)合的功能基團(tuán)。

2.偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件必須在溫和PH、中等離子強(qiáng)度和低溫的緩衝溶液中。

3.所選擇的偶聯(lián)反應(yīng)要儘量考慮到對(duì)酶的其他功能基團(tuán)副反應(yīng)盡可能少。

4.要考慮到酶固定化後的構(gòu)型，儘量減少載體的空間位阻對(duì)酶活力的影響。

共價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)：得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、利於連續(xù)使用，是目前應(yīng)用和報(bào)導(dǎo)得最多的一類方法。

共價(jià)偶聯(lián)法的缺點(diǎn)也很明顯。載體活化的操作複雜，反應(yīng)條件激烈，需要嚴(yán)格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時(shí)共價(jià)結(jié)合會(huì)影響到酶的空間構(gòu)象，從而對(duì)酶的催化活性產(chǎn)生影響。

（四）、交聯(lián)法

共價(jià)交聯(lián)法的基本原理是酶分子和多功能試劑之間形成共價(jià)鍵得到三向的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行膠聯(lián)反應(yīng)，把酶蛋白分子彼此交叉連接起來(lái)，形成網(wǎng)路結(jié)構(gòu)的固定化酶。能起交聯(lián)作用的試劑很多，但目前常用的交聯(lián)試劑是戊二醛和雙耦聯(lián)苯胺-2,2’-二磺酸。交聯(lián)法常與吸附法結(jié)合使用，或者與包埋法配合，目的是使酶緊緊地結(jié)合於載體上。

共價(jià)交聯(lián)法的四種形式：酶直接交聯(lián)法：

在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴於酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。操作簡(jiǎn)單，但是缺乏選擇性，活力回收往往不高。酶輔助蛋白交聯(lián)：

當(dāng)可得到的酶量有限，可以使用第二個(gè)“載體”蛋白來(lái)增加蛋白質(zhì)濃度，從而使酶與惰性蛋白共交聯(lián)的方法。這種“載體”蛋白即輔助蛋白，可以是白蛋白、明膠、血紅蛋白等。吸附交聯(lián)法：

此法先將酶吸附在矽膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹(shù)脂或其他大孔型離子交換樹(shù)脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。載體交聯(lián)法：

用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能基團(tuán)偶聯(lián)酶蛋白。

四種固定化酶製備方法的特點(diǎn)小結(jié)物理吸附包埋法共價(jià)交聯(lián)法共價(jià)結(jié)合法製備易易難難結(jié)合力弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)酶活力高高中中底物專一性無(wú)變化無(wú)變化有變化有變化再生可能不可能不可能不可能固定化費(fèi)用低中中高制法特性1.必須注意維持酶的催化活性和專一性2.酶與載體結(jié)合牢固3.載體的機(jī)械強(qiáng)度4.固定化酶要有最小的空間位阻5.載體穩(wěn)定，不可與底物、產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)6.固定化酶要廉價(jià)固定化方法與載體的選擇

固定化細(xì)胞

固定化細(xì)胞是指直接將細(xì)胞固定在水不溶性載體上，在一定的空間範(fàn)圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)（生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝）的細(xì)胞。

固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)：

1、可增殖，細(xì)胞密度大，可獲得高度密集而體積小的生產(chǎn)菌集合體。

2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使用。

3、發(fā)酵液中含菌體較少，有利於產(chǎn)品分離純化。

4、有利於需要輔酶和多酶系統(tǒng)才能進(jìn)行的反應(yīng)。

固定化酶(細(xì)胞）應(yīng)用實(shí)例固定化酶和固定化細(xì)胞應(yīng)用生產(chǎn)時(shí)間氨基醯基轉(zhuǎn)移酶DL-氨基酸的旋光度解析1969葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖異構(gòu)變?yōu)楣?973青黴素醯胺酶生產(chǎn)6-APA1973天冬氨酸酶生產(chǎn)L-天冬氨酸1973延胡索酸酶生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸1974?-半乳糖苷酶水解乳糖1977L-天冬氨酸?-脫羧酶生產(chǎn)L-丙氨酸1982

二、固定化酶（細(xì)胞）的性質(zhì)

有一定的機(jī)械強(qiáng)度且穩(wěn)定性好，催化劑與系統(tǒng)分相。固定化酶在使用前可充分洗滌，不帶進(jìn)雜質(zhì)，在反應(yīng)中酶與產(chǎn)物自然分開(kāi)，所以產(chǎn)物易提純，收率也高。酶與細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定化以後，穩(wěn)定性大為提高，可較長(zhǎng)期使用與儲(chǔ)藏，並可以再生。

能反復(fù)使用，可大大降低生產(chǎn)成本；同時(shí)也為實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的管道化、連續(xù)化與自動(dòng)化提供了可能。（一）、影響固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的因素

酶經(jīng)過(guò)固定化後引起的性質(zhì)改變，不外乎兩種原因：一是酶本身的變化，二是受固定化載體的物理或化學(xué)性質(zhì)的影響。就載體物化性質(zhì)和固定化過(guò)程影響而言，主要存在以下三種影響效應(yīng)：

分配效應(yīng)

空間障礙效應(yīng)

擴(kuò)散限制效應(yīng)

1、分配效應(yīng)由於載體和底物的性質(zhì)差異引起了微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的局部環(huán)境，而將主體溶液稱為宏觀環(huán)境。由這種不同造成的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個(gè)環(huán)境之間的不同分配，被稱為分配效應(yīng)。

2、空間障礙效應(yīng)固定化之後，由於酶的空間自由度受到限制(因?yàn)檩d體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位造成了空間屏障)，使酶分子的活性基團(tuán)不易於底物或效應(yīng)物接觸，影響酶分子的分子活性中心對(duì)底物的定位作用,所造成的對(duì)固定化酶的活力的影響效應(yīng)，被稱為空間障礙效應(yīng)。

3、擴(kuò)散限制效應(yīng)酶固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相，於是產(chǎn)生了擴(kuò)散阻力：

1）、外擴(kuò)散阻力是底物從宏觀環(huán)境向酶顆粒表面?zhèn)鬟f過(guò)程中的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)，它發(fā)生在反應(yīng)之前，發(fā)生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會(huì)使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通過(guò)增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴(kuò)散效應(yīng)。

2）、內(nèi)擴(kuò)散阻力是指底物分子達(dá)到固相酶表面後傳遞到酶活性部位時(shí)的一種擴(kuò)散阻力，它與催化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)擴(kuò)散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡可能大而直且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種內(nèi)擴(kuò)散阻力。

（二）、固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變1、固定化酶的活力在大多數(shù)情況下比天然酶下降，其專一性也會(huì)受到影響發(fā)生改變。

活力下降的原因：

酶分子在固定化過(guò)程中，酶的空間構(gòu)像發(fā)生了變化，甚至活性中心的氨基酸也會(huì)參加反應(yīng)。

固定化後的空間障礙效應(yīng)的影響。

內(nèi)擴(kuò)散阻力的影響使底物分子與活性中心的接近受阻。

包埋法時(shí)被高分子物質(zhì)半透膜包圍。

2、固定化後酶穩(wěn)定性提高

穩(wěn)定性提高的原因：

固定化後的酶與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子伸展變形。

酶活力的緩慢釋放。反應(yīng)開(kāi)始只有部分酶起作用，其餘部分僅在開(kāi)始起作用的酶變性後才起作用。

抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。

3、固定化酶（細(xì)胞）的作用pH變化

酶固定化後，對(duì)底物的最適PH曲線常常發(fā)生偏移。一般來(lái)說(shuō)，帶負(fù)電荷載體製備的固定化酶，其最適PH值較游離酶偏高，反之，若使用帶正電荷載體的話，其最適PH值較游離酶偏低，即向酸性偏移。

為什麼？（從分配效應(yīng)說(shuō)明）

4、固定化酶（細(xì)胞）的最適溫度的變化

酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應(yīng)速度的綜合結(jié)果。因?yàn)楣潭ɑ?，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是很有利的結(jié)果。

5、米氏常數(shù)Km的變化

固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。簡(jiǎn)單說(shuō)，由於高級(jí)結(jié)構(gòu)變化及載體影響引起酶與底物親和力變化，從而使Km變化。而這種Km變化又受到溶液中離子強(qiáng)度影響：離子強(qiáng)度升高，載體周圍的靜電梯度逐漸減小，Km變化也逐漸縮小以至消失。

（三）、固定化酶（細(xì)胞）的活力

固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小可以用在一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來(lái)表示。

它的單位可定義為每毫克幹重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化底物的量：用μmol/min·mg或μmol·min-1/cm2

1）、活力測(cè)定方法分為：

間歇測(cè)定：在攪拌或振盪反應(yīng)器中，在與溶液酶同樣測(cè)定條件下進(jìn)行，然後間隔一定時(shí)間取樣，過(guò)濾後按常規(guī)進(jìn)行測(cè)定。連續(xù)測(cè)定：固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過(guò)底物，測(cè)定酶柱流出液，根據(jù)流速和反應(yīng)速度之間關(guān)係，算出酶活力。

活力回收=×100%3）、固定化酶（細(xì)胞）的半衰期在連續(xù)測(cè)定條件下，固定化酶的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間稱為固定化酶的半衰期。以t1/2表示。固定化酶的操作穩(wěn)定性是影響使用的關(guān)鍵因素，半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。

2）、固定化酶的活力回收

固定化酶（細(xì)胞）熱穩(wěn)定性變化固定化酶（細(xì)胞）對(duì)有機(jī)試劑（乙醇）穩(wěn)定性變化下一幅固定化酶（細(xì)胞）對(duì)酶抑制劑（尿素）的穩(wěn)定性變化下一幅固定化酶（細(xì)胞）對(duì)PH穩(wěn)定性變化

三、固定化酶反應(yīng)器

批量式攪拌桶式反應(yīng)器

BatchStirredtankreactor,BSTR

結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，適於小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。當(dāng)前食品和飲料工業(yè)有採(cǎi)用這種形式反應(yīng)器。一般應(yīng)用溶液酶或粗酶製劑催化，酶不回收，待反應(yīng)轉(zhuǎn)化至一定程度後，通過(guò)加熱或其他方法直接使之失效除去。但在反復(fù)過(guò)濾或離心回收過(guò)程中，易造成酶的失效損失。工業(yè)上很少用.

連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器ContinuousStirredtankreactor,CSTR

催化劑採(cǎi)用顆粒狀的固定化酶，少數(shù)應(yīng)用片狀固定化酶。運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中要不斷分出部分反應(yīng)液，同時(shí)補(bǔ)充等量的新鮮底物溶液，為不致使酶隨反應(yīng)液流失，所以在它的出口處通常有濾膜。利於有底物抑制場(chǎng)合.

連續(xù)攪拌桶式超濾反應(yīng)器CSTR/Ultrfitrationreactor,CSTR/UFR

由連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器和超濾裝置組合而成，為小分子量產(chǎn)物與高分子底物的分離、底物較徹底的轉(zhuǎn)化以及溶液酶或固定化酶的反復(fù)使用提供了可能。但酶易因循環(huán)超濾而失效損失。

填充式反應(yīng)器PlugFlowreactor,PFR

床內(nèi)用顆粒狀或片狀固定化酶填充，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，底物按一定方向以恒定速度通過(guò)反應(yīng)床。使用最普遍.

流動(dòng)床反應(yīng)器

Fluidizedbedreactor,FBR

底物溶液以足夠大的流速向上通過(guò)固定化酶床層，使固體顆粒處?kù)读骰癄顟B(tài)?；旌铣潭雀撸蕚鳠帷髻|(zhì)情況良好?？捎渺短幚碚承詮?qiáng)和含有固體顆粒的底物，或用於需要供應(yīng)氣體或排放氣體的反應(yīng)。

迴圈流式反應(yīng)器

Recyclereactor,RCR

把部分流出物與加料流混合，然後再令其進(jìn)入反應(yīng)器。特點(diǎn)是可以提高液體的流速和減少底物向固定化酶表面?zhèn)鬟f的阻力。

固定化酶反應(yīng)器的選擇依據(jù)固定化酶的形狀底物的物理性質(zhì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性酶的穩(wěn)定性操作要求及反應(yīng)器費(fèi)用

1、固定化酶的形狀一般言之，顆粒狀或片狀固定化酶對(duì)連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器和填充式反應(yīng)器類型的反應(yīng)器均可適用。但膜狀和纖維狀的固定化酶則不適於連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器，而適用於填充式反應(yīng)器。另一方面，如果固定化酶易變形、易粘結(jié)或顆粒細(xì)小時(shí)，那麼在填充於填充式反應(yīng)器後，往往會(huì)引起高的壓力降和堵塞床層，並且在大規(guī)模生產(chǎn)中無(wú)法實(shí)現(xiàn)高的流率。此時(shí)宜採(cǎi)用流動(dòng)床反應(yīng)器。

2、底物的物理性質(zhì)底物分三種情況：溶解性物質(zhì)、顆粒物質(zhì)與膠狀物質(zhì)。溶解性底物顯然對(duì)任何類型反應(yīng)器均不會(huì)造成困難。顆粒狀和膠狀底物則往往會(huì)導(dǎo)致床層堵塞，對(duì)此可用迴圈反應(yīng)器或流動(dòng)床反應(yīng)器。連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器只要攪拌速度足夠高，能維持底物和固定化酶良好的懸浮狀態(tài)，也可用於顆粒狀底物。但高的攪拌速度會(huì)導(dǎo)致固定化酶從載體上被剪切下來(lái)，所以轉(zhuǎn)速不能太高。3、酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性

一般而言，填充床反應(yīng)器在固定化酶反應(yīng)器中佔(zhàn)有主導(dǎo)地位，它適合於產(chǎn)物抑制的場(chǎng)合；但在底物抑制的系統(tǒng)中，則連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器的性能又優(yōu)於填充床。流動(dòng)床反應(yīng)器因其流動(dòng)特性接近連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器，故也適宜於底物抑制的反應(yīng)。

4、酶的穩(wěn)定性在反應(yīng)器操作過(guò)程中，由於攪拌漿或液流的剪切作用，常會(huì)使固定的酶從載體上脫落下來(lái)，或由於磨損，引起粒度的減小而影響固定化酶的操作穩(wěn)定性，其中尤以連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器最為嚴(yán)重。為解決這一問(wèn)題而改進(jìn)反應(yīng)器設(shè)計(jì)，是把酶直接粘接在攪拌軸上，或把固定酶設(shè)置在與軸相連的金屬網(wǎng)籃內(nèi)。5、操作要求及反應(yīng)器費(fèi)用

連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器是最便宜的，它結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且具有良好的操作性，適應(yīng)性強(qiáng)；而其他類型的反應(yīng)器，則都需為特定的生產(chǎn)過(guò)程專門(mén)設(shè)計(jì)和製造。在討論反應(yīng)器價(jià)格的同時(shí)，還應(yīng)該考慮固定化酶本身的費(fèi)用，及在各種反應(yīng)器中的穩(wěn)定性。四、固定化酶的應(yīng)用固定化酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用固定化酶在分析化學(xué)中的應(yīng)用固定化酶與基礎(chǔ)理論

固定化酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用

產(chǎn)物

酶或細(xì)胞

固定化方法

原料L-氨基酸果糖漿6APAL-門(mén)冬氨酸L-蘋(píng)果酸低乳糖牛奶乳糖幹蛋白果汁脫苦啤酒植物白脫脂肪酸氨基醯化酶葡萄糖異構(gòu)酶或含該酶之菌體青黴素醯胺酶含有門(mén)冬氨酸的菌體含有反丁烯二酸酶的菌體乳糖酶鹼性蛋白酶葡萄糖氧化酶和氧化氫酶柚苷酶木瓜蛋白酶脂肪酶脂肪酶載體結(jié)合法載體結(jié)合法或交聯(lián)法載體結(jié)合法膠格包埋法膠格包埋法載體結(jié)合法載體結(jié)合法膠格包埋法載體結(jié)合法載體結(jié)合法或包埋法膠格包埋法載體結(jié)合法乙醯-DL-氨基酸葡萄糖青黴素G反丁烯二酸反丁烯二酸牛奶牛奶蛋白桔類果汁生啤酒植物油植物油

產(chǎn)物

酶或細(xì)胞

固定化方法

原料類固醇L-丙氨酸D-苯甘氨酸ATP核苷酸類味精乙醇啤酒L-亮氨酸乙酸乳酸澱粉酶桿菌肽氫氣含脫氫酶及羥化酶的菌體含有L-門(mén)冬氨酸、β-脫羧酶的菌體氨基醯化酶乙醯激酶5’-磷酸二酯酶，5’-腺苷酸脫氨酶Sacharomycescarlsbergensie或S.Cerevisiae同上SerratiamarcescensAectobcter.sp.乳酸桿菌與酵母BacillussubstilisBacillsp.ClostridiumbutyicumRhodospirilliumrubrum膠格包埋法包埋法載體結(jié)合法載體結(jié)合法載體結(jié)合法角叉膠或聚丙烯醯胺膠包埋聚乙烯氯或多孔磚吸附或海藻酸包埋角叉膠包埋水合氧化鈦吸附明膠包埋聚丙烯醯胺膠包埋聚丙烯醯胺膠包埋聚丙烯醯胺或瓊脂包埋類固醇前體L-門(mén)冬氨酸乙醯-DL-苯基苷氨酸ADPRNA葡萄糖培養(yǎng)基蘇氨酸培養(yǎng)基乙醇培養(yǎng)基

固定化生長(zhǎng)菌體在三廢處理上的應(yīng)用應(yīng)用內(nèi)容

菌體

固定化方法

毒物廢水處理脫氮作用CandidatropicalisPsendomonasPutida各種微生物混合培養(yǎng)PseadomonasspMicrococcusderitrificans聚丙烯醯胺膠包埋聚丙烯醯胺膠包埋皂土和Mg＋＋或聚氨基甲酸乙酯海綿活性炭吸附液膜酚苯廢水亞硝酸、硝酸

固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用

溶液酶的應(yīng)用缺陷：酶作為異體物質(zhì)，在體內(nèi)應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)酶是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除和被蛋白質(zhì)酶水解破壞由於稀釋效應(yīng)，藥物酶無(wú)法集中於靶器官組織以達(dá)到治療所需的最適高濃度

1、轉(zhuǎn)入體內(nèi)發(fā)揮作用（口服和注入）

口服：最初主要限於消化酶類，近年來(lái)也有人嘗試將酶以口服方式用於尿中毒等疾患的治療?？诜膬?yōu)點(diǎn)是藥物通過(guò)粘膜吸收後能迅速進(jìn)行擴(kuò)散，進(jìn)入體內(nèi)，通常不會(huì)引起免疫反應(yīng)。注入：是最有實(shí)用價(jià)值的一種方式，溶液酶的弱點(diǎn)集中於此方式。固定化酶可很好的地解決這一問(wèn)題，辦法是將藥物酶包埋於半透膜中，可容許小分子底物自由出入包埋膜，而藥物酶和破壞它的蛋白水解酶以及其他免疫因數(shù)等不會(huì)直接接觸，因而可延長(zhǎng)酶在體內(nèi)的半壽期和避免免疫過(guò)敏反應(yīng)。如果選擇載體適宜，或者在載體上偶聯(lián)適當(dāng)成分，還可使藥物酶比較集中的送到靶細(xì)胞。

2、通過(guò)“體外迴圈”做成人工臟器

固定化酶也可做成“人工臟器”參與體外迴圈，應(yīng)用有兩方面：用於除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝產(chǎn)物除去氨基酸，使需要這些物質(zhì)的病變組織“餓死”；治療時(shí)只需將患者的血液引出體外，通過(guò)由固定化酶等構(gòu)成的“人工臟器”加以處理，然後再回流體內(nèi)。

酶應(yīng)用方式

載體應(yīng)用對(duì)象半壽期

優(yōu)缺點(diǎn)尿酸酶門(mén)冬醯胺酶脲酶脂肪酶酪氨酸酶穀氨醯胺酶β-葡糖苷酸酶β-葡糖苷酸酶膽紅素葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶過(guò)氧化氫酶組成體外迴圈移接體內(nèi)迴圈口服體內(nèi)迴圈體內(nèi)迴圈體內(nèi)迴圈體內(nèi)迴圈體內(nèi)迴圈體內(nèi)迴圈血液透析裝置Dacron脈管修複用和移接管尼龍微囊腸衣包被可溶性的聚順丁烯二酸與聚丙烯酸聚合物可溶性的聚乙二醇血影細(xì)胞脂質(zhì)體和聚乙烯吡咯烷酮結(jié)合的微粒體尼龍微囊急淋白血病尿胰機(jī)能不全癌瘤癌瘤取代和補(bǔ)償先天缺失補(bǔ)償先天缺失黃疸約2d1d1d24h24h18h短暫優(yōu)點(diǎn)：加速尿酸移去缺點(diǎn)：需移去尿素優(yōu)點(diǎn)：無(wú)免疫原性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：易缺點(diǎn)：消亡快；載體有毒優(yōu)點(diǎn)：抗酸優(yōu)點(diǎn)：最適pH向中性偏優(yōu)點(diǎn)：無(wú)抗原性半壽期長(zhǎng)優(yōu)點(diǎn)：抗原性優(yōu)點(diǎn)：載體能被代謝缺點(diǎn)：對(duì)載體內(nèi)含物敏感優(yōu)點(diǎn)：不需分離酶缺點(diǎn)：需輔助因數(shù)擴(kuò)散優(yōu)點(diǎn)：能做成糊狀缺點(diǎn)：在唾液很快移除

包埋藥用酶的載體可溶性載體聚乙烯吡咯酮烷多糖或糖肽聚乙二醇聚氨基酸以及血清白蛋白其他（核酸和脂類物質(zhì)等）不可溶性載體半透性聚合酶脂質(zhì)體紅血球血影細(xì)胞

固定化酶在分析化學(xué)中的應(yīng)用

固定化酶在生化分析和臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用也是一個(gè)十分重要的領(lǐng)域，它的發(fā)展非常迅速，這不僅因?yàn)樗鼈儽容^穩(wěn)定，可反復(fù)使用，能實(shí)行自動(dòng)化、連續(xù)化等，而且因?yàn)樗鼈儗?duì)抑制劑和活化劑比較不敏感，因此可用於較複雜體系的檢測(cè)。分析化驗(yàn)中應(yīng)用的固定化酶大體分為兩類：酶感測(cè)器(酶電極)

固定化酶柱檢測(cè)器,包括固定化酶柱和檢測(cè)器

固定化酶與基礎(chǔ)理論

1、用固定化酶研究亞基間關(guān)係：在適宜的條件下將寡聚體酶的一個(gè)亞基和載體偶聯(lián)固定變性並除去其他亞基複性及活性檢測(cè)亞基重組和酶性質(zhì)的測(cè)定

2、應(yīng)用固定化雙酶或多酶系統(tǒng)進(jìn)行模擬試驗(yàn)?zāi)塬@得一些有意義的結(jié)果將己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶固定化在一起，結(jié)果觀察到偶聯(lián)反應(yīng)的初速度顯著升高，而中間產(chǎn)物積累達(dá)到恒態(tài)水準(zhǔn)所需的潛伏期大大縮短甚至消失。將上述兩種酶和ATP再生系統(tǒng)同固定於白蛋白上，然後用能透過(guò)葡萄糖、但不能透過(guò)葡萄糖-6-磷酸的膜進(jìn)行包埋，結(jié)果，在體外實(shí)現(xiàn)了“反抗”濃度梯度的葡萄糖的“活性運(yùn)轉(zhuǎn)”。3、通過(guò)固定化技術(shù)來(lái)改變酶的特性是酶分子修飾模擬的一個(gè)方面內(nèi)容。

酶活性調(diào)節(jié)方式

酶活性調(diào)節(jié)的實(shí)例：

凝血酶、胰蛋白酶激活

糖元磷酸化酶活性轉(zhuǎn)化

母體分娩後母乳中乳糖合成

丙二酸抑制琥珀酸脫氫酶活性

蘇氨酸到異亮氨酸的代謝途徑控制

多種調(diào)節(jié)方式：

濃度調(diào)節(jié)（合成降解調(diào)節(jié))；

生理調(diào)節(jié)(激素調(diào)節(jié))；

共價(jià)修飾調(diào)節(jié)（可逆，不可逆)；抑制劑調(diào)節(jié)；

回饋調(diào)節(jié)（別構(gòu)調(diào)節(jié)）；

存在方式調(diào)節(jié)（多酶體系）；

寡聚酶的聚合、解聚調(diào)節(jié)；

1.調(diào)節(jié)酶在細(xì)胞內(nèi)的濃度

如：大腸桿菌的葡萄糖效應(yīng)，即在有葡萄糖存在時(shí)，它不利用乳糖。原理可以用乳糖操縱子模型來(lái)解釋。

腺苷酸環(huán)化酶

AMPcAMP+H2O

磷酸二脂酶乳糖操縱子模型

2.

生理調(diào)節(jié)或激素調(diào)節(jié)在特殊生理?xiàng)l件下，分泌某一種激素來(lái)調(diào)節(jié)酶的活性。如：乳腺組織中的乳糖合成酶。

乳糖合成酶是蛋白A和蛋白B兩組分構(gòu)成的複合物，可以催化乳糖合成反應(yīng)：

EUDP-半乳糖+葡萄糖乳糖+UDP

蛋白A不能催化上述反應(yīng)而能催化下述合成反應(yīng)：UDP-半乳糖+N-乙醯葡糖胺N-乙醯半乳糖胺+UDP

蛋白B本身無(wú)催化能力，但其與蛋白A結(jié)合，可以改變蛋白A的底物專一性。A

3、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)

不可逆共價(jià)調(diào)節(jié)——酶原啟動(dòng)

◆一些酶（主要是消化酶和執(zhí)行防禦功能的酶）在細(xì)胞內(nèi)以無(wú)活性前體形式（即酶原）合成和分泌，然後輸送到胞內(nèi)外作用部位去，當(dāng)功能需要時(shí)就會(huì)被活化而起作用?？梢韵胂?，必須有一種調(diào)控機(jī)制，使其在胞內(nèi)合成時(shí)處?kù)妒Щ顮顟B(tài)，而在需要時(shí)啟動(dòng)；◆在酶原啟動(dòng)過(guò)程中，酶原分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了這樣的變化：

首先，酶原分子被切去若干小段，即發(fā)生一級(jí)結(jié)構(gòu)變化、

一級(jí)結(jié)構(gòu)變化引起酶分子活性部位構(gòu)象變化，形成能與特異性底物相結(jié)合的完整的疏水口袋。胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶Ser14—Arg15Thr147—Asn148A鏈B鏈C鏈胰凝乳蛋白酶原（無(wú)活性）π--胰凝乳蛋白酶（有活性）α--胰凝乳蛋白酶（有活性,穩(wěn)定）α--胰凝乳蛋白酶（三鏈間有二硫鍵）◆α--胰凝乳蛋白酶為穩(wěn)定的形式，A、B兩鏈及B、C兩鏈間各通過(guò)一對(duì)大的二硫鍵相連，其活性只有π--胰凝乳蛋白酶的2/5◆

酶活性中心的氨基酸殘基來(lái)自B、C二鏈

胰凝乳蛋白酶原受胰蛋白酶作用後，Arg15-Ile16間的肽鍵被打斷，形成了新的Ile16末端，這個(gè)新末端的氨基再與酶分子內(nèi)部的Asp194發(fā)生靜電作用,

觸發(fā)一系列的構(gòu)象變化：Met192從酶分子的深層移動(dòng)到酶分子的表面，第187及第193殘基更加舒展等，這些改變的總結(jié)果是造成一個(gè)口袋——允許帶芳香族的底物或帶一個(gè)較大的非極性脂肪族鏈的底物進(jìn)入專一性部位

消化系統(tǒng)其他蛋白水解酶原的啟動(dòng)胃蛋白酶原（pepsinogen）由胃壁細(xì)胞分泌出來(lái)，在胃酸H+作用下，低於pH5時(shí)，酶原自動(dòng)啟動(dòng)，失去44個(gè)氨基酸殘基，轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨人嵝缘?，有活性的胃蛋白酶胰蛋白酶原（trypsinogen）進(jìn)入小腸後，在有Ca2+的環(huán)境中受到腸激酶的啟動(dòng)，賴氨酸-異亮氨酸之間的肽鍵被打斷，水解失去一個(gè)6肽，使構(gòu)象發(fā)生一定變化後，成為有活性的胰蛋白酶羧肽酶原A彈性蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶羧肽酶原羧肽酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶對(duì)各個(gè)胰髒蛋白酶原的啟動(dòng)作用

綜上所述，酶原啟動(dòng)有兩個(gè)特點(diǎn)：是蛋白質(zhì)肽鏈的水解過(guò)程，不可逆啟動(dòng)後，不能變?yōu)槊冈瓲顟B(tài)，因而這是“一次性”的調(diào)節(jié)，能及時(shí)地從靶部位通過(guò)自身催化或組織蛋白酶的作用而降解移去都是通過(guò)級(jí)聯(lián)繫統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的快速的信號(hào)放大過(guò)程，以完成特定功能

可逆的共價(jià)調(diào)節(jié)

由於其他的酶對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行共價(jià)修飾，而使其在活性形式與非活性形式之間進(jìn)行互變.第一種類型是磷酸化酶及其他的一些酶，它們通過(guò)接受ATP轉(zhuǎn)來(lái)的磷酸基的共價(jià)修飾，或脫下磷酸基，來(lái)調(diào)節(jié)酶活性：酶的無(wú)活性形式酶的有活性形式最典型的例子是動(dòng)物組織中的糖原磷酸化酶：（葡萄糖）n+Pi（葡萄糖）n-1+1-磷酸-葡萄糖E糖原磷酸化酶的活性形式及非活性形式間的平衡，是磷酸基共價(jià)地結(jié)合到酶上或從酶上脫下，從而控制調(diào)節(jié)磷酸化酶的活性糖原磷酸化酶及其他受共價(jià)修飾調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)酶