生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)2

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

歡迎同學(xué)們到醫(yī)學(xué)分析與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室來(lái)！同學(xué)們?cè)卺t(yī)學(xué)

分析與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方面要取得好成績(jī)，在很大程度上，取決于

對(duì)這些專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的熟練掌握和對(duì)實(shí)驗(yàn)原理的深入了解。

應(yīng)該做到：

1.遵守實(shí)驗(yàn)紀(jì)律，按時(shí)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，不得遲到或早退。

實(shí)驗(yàn)中途因故需外出時(shí)應(yīng)向任課教師請(qǐng)假。

2.進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室之前要換好白大衣及拖鞋。

3.保持實(shí)驗(yàn)室安靜，不許在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大聲喧嘩及隨意走

動(dòng)。

4.必須嚴(yán)肅認(rèn)真地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間不得進(jìn)行任何與

實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的活動(dòng)。

5.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各組儀器及器材由各組自已使用，不得互相

調(diào)換。要愛(ài)護(hù)儀器、標(biāo)本和設(shè)備。如遇儀器損壞或不靈，應(yīng)

及時(shí)報(bào)告任課教師，以便修理或更換，不要自行亂修。損壞

器材或設(shè)備者應(yīng)按有關(guān)規(guī)定進(jìn)行賠償。

6.注意節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料、藥品和水、電等。

7.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中凡遇產(chǎn)生煙霧或有毒性腐蝕性氣體

時(shí)，應(yīng)放在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行。如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)無(wú)此種設(shè)施，則必

須注意及時(shí)打開(kāi)窗戶(hù)通風(fēng)。

8.以移液管取用試劑應(yīng)使用橡皮吸球。對(duì)于劇毒或有腐

蝕性試劑的取用更要注意安全，應(yīng)使移液管的尖湍固定在液

面下適當(dāng)?shù)奈恢?，以防試劑進(jìn)入吸球。如果不慎已吸入球內(nèi)，

則應(yīng)隨時(shí)洗凈晾干。

9.乙醛、乙醇、丙酮、氯仿等易燃試劑應(yīng)放在遠(yuǎn)離火源

處，并不可直接放在火源上蒸煮，以防引起火災(zāi)。

10.在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，接觸苯酚、氯仿、溟乙錠等

有毒試劑時(shí)應(yīng)戴手套，以防止腐蝕，傷害皮膚。

11.保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清潔整齊。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組必須認(rèn)

真清理各自的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，將器材清洗后點(diǎn)清數(shù)目，然后擺放

整齊。班級(jí)值日生負(fù)責(zé)清掃室內(nèi)衛(wèi)生，關(guān)好水、電開(kāi)關(guān)和門(mén)、

窗等，經(jīng)教師允許后方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。

12.動(dòng)物尸體、紙片及實(shí)驗(yàn)廢物應(yīng)放到指定地點(diǎn)，不得

隨意亂丟。

13.有不遵守上述要求者，任課老師將終止其實(shí)驗(yàn)，并

取消其當(dāng)堂實(shí)驗(yàn)成績(jī)。

實(shí)驗(yàn)應(yīng)急處理（實(shí)驗(yàn)室意外事故的急救）

1.皮膚灼傷處理皮膚不慎被強(qiáng)酸、溟、氯等物質(zhì)灼傷

時(shí)，應(yīng)即時(shí)用大量自來(lái)水沖洗，然后用5%碳酸氫鈉液洗滌。

2.強(qiáng)酸液進(jìn)入口內(nèi)的處理應(yīng)立即用清水或0.lmol/L

氫氧化鈉液漱口，再服用氧化鎂、鎂乳等和牛奶混合劑，但

不宜服重碳酸鈉液，以免因和酸作用而產(chǎn)生過(guò)量氣體加劇對(duì)

胃的刺激。

3.強(qiáng)堿溶液進(jìn)入口內(nèi)的處理，立即用大量清水或5%硼酸

液漱口，再服用適量5%醋酸。

4.酸、堿等化學(xué)試劑濺入眼內(nèi)的處理先用自來(lái)水或蒸

儲(chǔ)水沖洗眼部，如濺入酸類(lèi)物質(zhì)則可再用5%碳酸鈉仔細(xì)洗；

如系堿類(lèi)物質(zhì)，可用2%硼酸沖洗。然后滴1—2滴油性物質(zhì),

使起滋潤(rùn)保護(hù)作用。

5.被電擊的處理實(shí)驗(yàn)室內(nèi)電器設(shè)備多，如某項(xiàng)設(shè)備漏電,

使用時(shí)則有觸電危險(xiǎn)。如有人不慎觸電，首先應(yīng)立即切斷電

源。在沒(méi)有斷開(kāi)電源時(shí)絕不可赤手去拉觸電者，宜迅速用干

木棒、塑料棒等絕緣物把導(dǎo)電物和觸電者分開(kāi)。然后對(duì)觸電

者進(jìn)行搶救。嚴(yán)重者應(yīng)立即送醫(yī)院。

6.酸、堿等化學(xué)試劑濺灑在衣物鞋襪上的處理強(qiáng)酸或強(qiáng)

堿類(lèi)物質(zhì)灑在衣服鞋襪上，應(yīng)立即脫下用自來(lái)水浸泡沖洗；

濺灑物如系苯酚類(lèi)物質(zhì)，而衣服又是化纖織物，則可先用60

—70%酒精擦洗被濺處，然后再將衣物放清水中浸泡沖洗。

第一章：

第一章蛋白質(zhì)測(cè)定、分離、鑒定技術(shù)

實(shí)驗(yàn)一雙縮胭(Biuret)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

【目的要求】

掌握雙縮胭法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。

【實(shí)驗(yàn)原理】

蛋白質(zhì)分子中的肽鍵(-CO-NH-)在堿性溶液中與C/+形

成紫紅色絡(luò)合物，在540nm波長(zhǎng)有特定吸收峰，所產(chǎn)生的顏

色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，依此原理可測(cè)蛋白質(zhì)含量。由

于此反應(yīng)和兩個(gè)尿素分子縮合后生成的雙縮胭

(H2N-OC-NH-CO-NH2)在堿性溶液中與銅離子作用生成紫紅色

的反應(yīng)相似，故稱(chēng)雙縮服(Biuret)反應(yīng)。

【試劑】

1.雙縮版試劑：取CuS04-5乩0(C.P.)1.5g和酒石酸鉀

鈉(NaKC^Oe?4H20)(C.P.)6.Og以少量蒸儲(chǔ)水溶解，再加

2.5mol/LNaOH溶液300mLKI1.0g,然后力口水至1000ml。

棕色瓶中避光保存。長(zhǎng)期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不

能使用。

2.蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：取牛血清白蛋白，用生理鹽水稀釋至濃

度10g/L。

【器材】

1.試管：15X150mm試管7只

2.lml,5ml移液管

3.坐標(biāo)紙

4.722(721)分光光度計(jì)

【操作步驟】

一、標(biāo)準(zhǔn)曲線法

空白管12345溜定管

盤(pán)白標(biāo)準(zhǔn)液lOg/Uml)一0.10.20.30.40.5—

生理鹽水(ml)0.50.40.30.20.1一0.4

待測(cè)樣品(ml)——0.1

雙縮麻試劑(ml)3.03.03.03.03.03.03.0

相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)(g/L)01020304050

混勻，37℃水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)

540nm處，用一空白管校正吸光度為零，讀取各管吸光度值。

1?5為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測(cè)得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋

白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)得測(cè)定管的吸光度，對(duì)

照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)濃度。

二、標(biāo)準(zhǔn)管法

取3支試管，按下表操作:

加入物(ml)空白管(B)標(biāo)準(zhǔn)管(S)測(cè)定管(U)

血清樣品——0.05

標(biāo)準(zhǔn)液—0.05—

蒸儲(chǔ)水0.05——

雙縮胭試劑(應(yīng)用3.03.03.0

試劑)

混勻，37℃恒溫水浴lOmin,540nm波長(zhǎng)，以空白管調(diào)零,

測(cè)定各管吸光度。

計(jì)算：樣品中總蛋白含量(g/L)=&XCs

As

【參考值】60?80g/L

【注意事項(xiàng)】

1.雙縮胭試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Ci?+形成穩(wěn)定的絡(luò)

合銅離子，以防止CUSOL5H2O不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒

石酸鉀鈉與CuS04?5乩0之比不低于3：1,加入KI作為抗氧

化試劑。

2.雙縮服試劑要封閉貯存.防止吸收空氣中的二氧化碳。

3.本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾

乎不受溫度影響，唯一缺點(diǎn)是靈敏度較低。

4.黃疸血清.嚴(yán)重溶血對(duì)本法有明顯干擾。

【問(wèn)答題】

1.雙縮胭法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理是什么?其他還有什么方

法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量？

2.請(qǐng)用雙縮胭法，設(shè)計(jì)一個(gè)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的定量方法

（除標(biāo)準(zhǔn)曲線法外）。

實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)紫外分光測(cè)定法

【原理】

由于蛋白分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共趣雙

鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm

波長(zhǎng)處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）

與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。

由于核酸在280波長(zhǎng)處也有光吸收，對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定有

干擾作用,但核酸的最大吸收峰在260nm處,如同時(shí)測(cè)定260nm

的光吸收，通過(guò)計(jì)算可能消除其對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響，因此

溶液中存在核酸時(shí)必須同時(shí)測(cè)定280nm及260nm之光密度，

方可通過(guò)計(jì)算測(cè)得溶液中的蛋白質(zhì)濃度。

利用紫外線吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡(jiǎn)便、

不消耗樣品，低濃度鹽類(lèi)不干擾測(cè)定。因此，在蛋白質(zhì)和酶

的生化制備中（特別是在柱色譜分離中）廣泛應(yīng)用。此法的

缺點(diǎn)是（D對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含

量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；（2）若樣品中含有喋

吟、喀咤等吸收紫外線的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。

不同蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不同的，即使經(jīng)過(guò)校正，

測(cè)定結(jié)果也還存在一定的誤差。但可作為初步定量的依據(jù)。

【操作】

一、標(biāo)準(zhǔn)曲線法

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.樣品測(cè)定

取待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1血，加入蒸餌水31nL搖勻，按上述方

法在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出經(jīng)稀

釋的待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。

二、其他方法

(1)將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)稀釋?zhuān)诓ㄩL(zhǎng)260nm和280nm

處分別測(cè)出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出

蛋白質(zhì)濃度。

計(jì)算

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45A280-0.74A26O

式中Azso和A260分別是該溶液在280nm和260nm波長(zhǎng)下測(cè)得

的光吸收值。

實(shí)驗(yàn)三考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

【基本原理】

考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中的游離狀態(tài)呈紅褐色,與蛋

白質(zhì)結(jié)合呈藍(lán)色，且最大吸收波長(zhǎng)從465nm轉(zhuǎn)變?yōu)?95nll1。蛋

白質(zhì)溶液在一定濃度范圍內(nèi)，與595nm的光密度值成正比，可

用于蛋白質(zhì)的比色定量。

【器材】

721分光光度計(jì)、試管、吸管。

【試劑】

1.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(250ug/ml)：小牛血清白蛋白251ng

加生理鹽水至100ml。

2.考馬斯亮藍(lán)G-250：考馬斯亮藍(lán)G-250100mg,加195%

乙醇501nL加185%(W/V)H3PoJOOml,加蒸儲(chǔ)水稀釋至1000ml,

置棕色瓶過(guò)夜，用二層濾紙過(guò)濾。

【操作步驟】

取三支試管，編號(hào),垓讀蝶作：

B(空白管)S(標(biāo)

準(zhǔn)管)U(樣品管)___________________________

生理鹽水(ml)0.10

蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(250ug/ml)(ml)—

0.10—

待測(cè)樣品(ml)—

0.10—

考馬斯亮藍(lán)試劑(ml)5.00

5.005.00

充分混勻各管溶液。5分鐘后用595nin波長(zhǎng)比色，以空白

管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管及樣品管的吸光度值(As、Au)o

【計(jì)算】

待測(cè)液蛋白濃度=—X蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度X稀釋倍數(shù)

As

如用標(biāo)準(zhǔn)曲線法可用牛血清清蛋白配成0.1m中含蛋白質(zhì)

10Pg、20pg、40pg、60Rg、80iig的一系列標(biāo)準(zhǔn)液，上

述各管各加考馬斯亮藍(lán)試劑5.0mL5分鐘后，在595nm波長(zhǎng)比

色，讀取各管光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)含

量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)同樣條件測(cè)得的待測(cè)液的

光密度值，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得蛋白質(zhì)含量，另外也可用蛋

白質(zhì)濃度已知的人血清用生理鹽水適當(dāng)稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)液,

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【注】本法待測(cè)液0.1ml中含蛋白質(zhì)10~8011g為宜，如

果樣品蛋白質(zhì)濃度過(guò)高，可用生理鹽水適當(dāng)稀釋后再測(cè)。

【思考題】用標(biāo)準(zhǔn)曲線法及標(biāo)準(zhǔn)管法測(cè)定蛋白質(zhì)有何區(qū)

別與意義。

實(shí)驗(yàn)四血清Y-球蛋白的層析分離

【基本原理】

利用硫酸鍍分段鹽析將血清中的丫-球蛋白與清蛋白、a-

球蛋白、球蛋白等加以分離，再用凝膠過(guò)濾法除鹽即可

得到比較純的丫-球蛋白。

【器材】

玻璃層析柱(1.OX12cm)、圓形尼龍布(直徑1.5cm)、凹

孔白瓷板、試管、離心管、燒杯、滴管、螺旋夾等。

【試劑】

1.血清

2.磷酸鹽緩沖液-生理鹽水(PBS)：用O.Olmol/L磷酸鹽

緩沖液配制的0.9%NaCl溶液。配制方法如下：

0.2mol/L｝混勻后稀釋20倍

Na2HP0472ml

0.2mol/LNaH2P。428ml

3.pH7.2飽和硫酸鐵溶液：用氨水將飽和硫酸鍍?nèi)?/p>

液調(diào)到pH7.2

4.葡聚糖凝膠G-50(SephadexG-50)

5.納氏試劑(Nessler)sreagent)：

⑴儲(chǔ)存液：于500ml錐形瓶?jī)?nèi)加碘化鉀(KI)150g,蒸

鐳水100ml,溶解劭口碘(&)110g,振搖至溶解后再加汞(Hg)

150g,連續(xù)振搖7~15分鐘。在此過(guò)程中，碘的顏色漸淺并發(fā)

熱，可在冷水浴中連續(xù)振搖到溶液由棕紅色(碘色)轉(zhuǎn)變成淺

黃綠色(碘化鉀汞色)為止。將上清液倒入2升量筒內(nèi)，并用

蒸儲(chǔ)水洗錐形瓶?jī)?nèi)沉淀物數(shù)次，洗液全部倒入量筒內(nèi)，再加水

至2升后混勻。

⑵應(yīng)用液：取儲(chǔ)存液150ml加10%Na0H溶液700ml.蒸

儲(chǔ)水150nli混勻，放棕色瓶?jī)?nèi)靜置數(shù)日后取上清液使用。此

液要求酸堿度適宜。即與1.ONHC1滴定時(shí)需此試劑H.0?

11.5ml使酚醐指示劑變色為宜，否則需加以糾正。

6、雙縮胭試劑：

CuS04-5H200.39g,酒石酸鉀鈉1.2g分別溶于50ml蒸

儲(chǔ)水中，力口2.5NNaOH60mLKI0.2g,混勻后力口水至200ml。

【操作步驟】

1.鹽析

⑴血清1ml放入離心管中，加入磷酸鹽緩沖液-生理鹽

水（PBS）1ml混勻逐滴加入pH7.2飽和硫酸鐵溶液1ml,邊加

邊搖勻。靜置30分鐘后，離心3000rpm10分鐘，傾上清液

（上清中主要含清蛋白）。

⑵將離心管中的沉淀用1mlPBS攪拌溶解，再逐滴加

入pH7.2飽和硫酸鍍?nèi)芤?.5mL邊加邊搖勻。靜置30分鐘

后，離心3000rpm10分鐘。傾上清液（上清中主要含a、p

球蛋白）。

2.脫鹽

⑴裝柱：稱(chēng)取葡聚糖凝膠G-501g,放入100ml燒杯中，

加蒸儲(chǔ)水50ml,微火煮沸1小時(shí)（注意需隨時(shí)補(bǔ)充蒸儲(chǔ)水以

免蒸干）。冷卻后傾棄上清液。再加入PBS10ml,用玻璃棒

輕輕攪拌，傾入有尼龍布堵住下口的玻璃層析柱內(nèi)。于柱下口

接一小段膠管,待全部凝膠傾入柱內(nèi)且液面接近凝膠上表面時(shí)

將出口膠管夾緊。為使凝膠表面平坦，可用手指輕輕彈動(dòng)層析

柱，然后小心放松調(diào)節(jié)夾，使液體緩緩流出8?10滴/分。同

時(shí)檢查流出液中是否有NH；存在，若有則需用PBS洗至流出液

中無(wú)NIV為止。當(dāng)液面恰好與凝膠表面重合時(shí)，立即將出口膠

管夾緊，裝柱即結(jié)束（注意：液面不得低于凝膠表面，且柱內(nèi)

不得有氣泡）。

（2）脫鹽：向裝有丫-球蛋白的離心管內(nèi)加入PBS10滴，

用玻璃棒攪拌使之溶解。再用乳頭吸管吸出Y-球蛋白液，加

到層析柱內(nèi)凝膠表面。然后稍打開(kāi)流出口，使流速為8?10

滴/分。待丫-球蛋白液全部進(jìn)入凝膠柱內(nèi)時(shí)，再用乳頭吸管小

心加入PBS約1cm高，待大部分液體進(jìn)入凝膠柱后，再繼續(xù)加

PBS直至洗脫完畢（加液時(shí)注意不要沖擊凝膠表面）。在整個(gè)

洗脫過(guò)程中不能讓液面降至凝膠面以下。

（3）收集：準(zhǔn)備12只小試管用于收集流出液。從加樣后開(kāi)

始，每管收集lmlo收集12管后繼續(xù)用PBS洗至無(wú)NH；時(shí)，

停止洗脫。回收凝膠和尼龍布等。

（4）檢測(cè)：準(zhǔn)備反應(yīng)板兩塊。將12管收集液各取1滴分別放

入反應(yīng)板的12個(gè)凹孔。一塊板的各孔內(nèi)加納氏試劑1滴，有

NH：者呈黃色至橙色?？捎?、一號(hào)表示有無(wú)呈色或顏色深淺。

再向另一塊板的各孔內(nèi)加雙縮胭試劑1滴，有蛋白者呈藍(lán)紫

色。亦可用+、一號(hào)表示有無(wú)呈色或顏色深淺。將呈色最深

的一管收集液保留供實(shí)驗(yàn)3使用。利用實(shí)驗(yàn)3醋酸纖維素薄

膜電泳檢測(cè)本次實(shí)驗(yàn)所提Y-球蛋白的純度。

實(shí)驗(yàn)五醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)

【基本原理】

帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其電性相反方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱(chēng)為

電泳。蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，在不同pH條件下，其帶電情況

不同。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)為兼性離子，其實(shí)效電荷為零，

在電場(chǎng)中不發(fā)生泳動(dòng)；蛋白質(zhì)分子在pH小于其等電點(diǎn)的溶液

中，呈堿式解離，帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng)；蛋白質(zhì)

分子在pH大于其等電點(diǎn)的溶液中，呈酸式解離，帶負(fù)電荷，

在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。泳動(dòng)速度除與電場(chǎng)強(qiáng)度和溶液性質(zhì)有

關(guān)外，主要決定于分子顆粒的電荷量以及分子的大小與形狀。

電荷較多、分子較小的球狀蛋白質(zhì)泳動(dòng)較快。

醋酸纖維素薄膜電泳是利用醋酸纖維素薄膜做固體支持物

的電泳技術(shù)。與紙上電泳相似，是在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。

該電泳技術(shù)具有比紙電泳電滲小、分離速度快、樣品用量小

（可少于10微升）、而分辨率高和分離清晰等優(yōu)點(diǎn)。因此，

從1956年Kohn首先應(yīng)用此法以來(lái)，紙上電泳已逐漸被取代。

醋酸纖維素薄膜電泳的操作方法除比瓊脂電泳、淀粉膠電泳

和聚丙烯酰鍍凝膠電泳簡(jiǎn)便外，還有一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)，即染色

后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便

于保存和定量分析。

醋酸纖維素薄膜可用于一般血清蛋白電泳、脂蛋白電泳、

同工酶電泳、甲胎球蛋白電泳（AFP）、血紅蛋白電泳以及免

疫電泳等。

本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素薄膜作為支持物，于浸有緩沖液的薄

膜一端加微量血清，膜兩端連接于緩沖液。所用緩沖液的pH

為8.6,大于血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（見(jiàn)注）。因此，各

種蛋白質(zhì)皆帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極方向泳動(dòng)，因泳動(dòng)速

度不同而被分離。依次為清蛋白A、a1、a28和丫-球蛋

白，將蛋白質(zhì)染色后，可按染色區(qū)帶位置進(jìn)行定性觀察，也

可對(duì)各條色帶進(jìn)行定量測(cè)定。

【器材】

電泳儀、醋酸纖維素薄膜（2X8cm）、點(diǎn)樣板、鉛筆、尺

【試劑】

1.巴比妥緩沖液（pH8.6,離子強(qiáng)度0.06）：巴比妥鈉

12.76g,巴比妥1.66g加蒸鐳水?dāng)?shù)百毫升,加熱溶解后再補(bǔ)加

蒸儲(chǔ)水至1000ml,混勻。

2.染色液：氨基黑10B0.5g,溶于甲醇50ml中，再加

冰醋酸10mL蒸饋水40ml混勻。

3.漂洗液：甲醇（或95%乙醇）45ml,冰醋酸5ml,

蒸儲(chǔ)水50ml混勻。

4.洗脫液：0.4NNaOH溶液

5.透明液：95%乙醇20mL冰醋酸5ml混勻。

【基本操作】

1.電泳槽內(nèi)放適量的緩沖液，于兩端的液槽間放一充滿(mǎn)

緩沖液的連通管，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間使兩側(cè)液面達(dá)到平衡后，取

下連通管。在電泳槽的兩側(cè)的支持板上分別用四層濾紙（或

紗布）搭橋，即使其一端搭到支持板上，另一端浸入緩沖液

中。在醋酸纖維薄膜（2X8cm）的無(wú)光澤面距一端2cm處,，

用鉛筆畫(huà)一橫線（與此端平行），作為準(zhǔn)備點(diǎn)樣的位置，稱(chēng)為

點(diǎn)樣線或者是起點(diǎn)線。把膜放進(jìn)PH8.6的巴比妥緩沖溶液中

浸泡數(shù)小時(shí)使膜完全浸透。

2.點(diǎn)樣

把浸透緩沖液的醋酸纖維素膜取出，夾到濾紙中，輕撫使

吸去多余的緩沖液，使膜的無(wú)光澤面向上，把微量樣品［血清、

丫-球蛋白提純液、A液、B液等（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二）］分別均勻地涂

另于蓋玻片的一端，把玻片豎直輕貼到膜的點(diǎn)樣線上，使樣

品吸入膜內(nèi)。注意應(yīng)使點(diǎn)樣線成為粗細(xì)一致的直線狀。

3.電泳

把膜放進(jìn)電泳槽內(nèi)，注意要把膜的點(diǎn)樣面即無(wú)光澤面向下,

點(diǎn)樣端靠近陰極側(cè)，把膜的兩端緊貼到內(nèi)側(cè)支持板上搭橋的

濾紙或沙布上，把膜擺平拉直，蓋好電泳槽蓋。

檢查電泳槽電極的連接正確無(wú)誤后通電，調(diào)節(jié)電流按總膜

寬計(jì)算，每cm寬給電流0.4-0.6mA,通電時(shí)間45?60分鐘。

4.染色

關(guān)閉電源后立即將膜取出，放入染色液中浸染3?5分鐘,

然后移放漂洗液中漂洗數(shù)次，至蛋白條帶清晰，本底無(wú)色為

止，取出薄膜用濾紙吸干。

5.定量

把漂洗干凈的膜夾在濾紙中吸干，剪下各蛋白區(qū)帶及一段

平均大小的空白區(qū)，分別依次放入試管中，標(biāo)清管號(hào)，向清

蛋白管加0.4NNaOH10ml,其余各管加0.4NNaOH5ml,輕

輕振搖，使著色完全洗脫于溶液中，用620nm波長(zhǎng)比色，記

取各管光密度值。然后計(jì)算各組分相對(duì)百分含量。計(jì)算方法

如下：

設(shè)測(cè)得各管光密度值為DA、Da】、Da2、6、DY,則光

密度值總和DT=2DA+Da1+Da2+DB+DY。

Da\

清蛋白％=奇蟲(chóng)。。，"蛋白％xlOO,其余類(lèi)推，可分

DT

別求出各蛋白所占總蛋白的百分?jǐn)?shù)。

【注】

1.血清蛋白各組分的等電點(diǎn)、分子量及其在正常血清中

的百分含量如下表：

等電點(diǎn)分子量

占總蛋白的%

清蛋白4.6469,000

57?72

a1球蛋白5.06200,000

2?5

a2球蛋白5.06300,000

4?9

B球蛋白5.1290,000—150,000

6.5?12

Y球蛋白6.85~7.3156,000—950,000

12?20

2.血清蛋白電泳有一定的臨床意義。例如肝硬化時(shí)清蛋

白明顯降底，而Y球蛋白可增高2倍；腎病綜合癥和慢性腎

小球腎炎可見(jiàn)到清蛋白降低，a和B球蛋白增高。從電泳譜

上亦可查出某些異常，例如多發(fā)性骨髓瘤病人血清，有時(shí)在

B與Y球蛋白之間出現(xiàn)巨球蛋白；原發(fā)性肝癌病人血清在清

蛋白與a?球蛋白之間可見(jiàn)到甲胎蛋白。

【思考題】

1.電泳后，泳動(dòng)在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何

種成份？請(qǐng)分析原因。

2.電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的正極還是負(fù)極，為什么？

實(shí)驗(yàn)七聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳分離血清蛋白

【基本原理】

1.聚丙烯酰胺的合成和結(jié)構(gòu)

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acrylamide簡(jiǎn)寫(xiě)為Acr)

和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(N,N1-methylene-bisacrylamide,

簡(jiǎn)寫(xiě)B(tài)is)在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)成含有酰胺基側(cè)鏈的

脂肪族大分子化合物。

2.催化劑

過(guò)硫酸胺-四甲基乙二胺(N、N、N、N-Tetramethyl—

thylenediamine,簡(jiǎn)寫(xiě)TEMED)系統(tǒng),其中過(guò)硫酸錢(qián)是引發(fā)

劑。它在光照射下裂解成帶有自由基的硫酸錠，

通過(guò)自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反

應(yīng)，TEMED是加速劑，加快引發(fā)劑釋放自由基的速度。

(NH4)裊&?(NH4)2SO4

聚丙烯酰胺凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能起分子篩作用。用

它作電泳支持物，對(duì)樣品的分離不僅取決于各組分所帶電荷

的多少，也與分子大小有關(guān)。凝膠網(wǎng)孔的大小主要受成膠物

的總濃度及Acr和Bis的比例的影響。一般電泳采用成膠物

質(zhì)總濃度為7.5%,此濃度稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)凝膠濃度。如果改變總膠

濃度，也應(yīng)相應(yīng)改變Acr和Bis的比例。

總膠濃度為5%以下時(shí)，Acr：Bis在20左右。

總膠濃度為5?10%時(shí)，Acr：Bis在40左右。

總膠濃度為5?20%時(shí)，Acr：Bis在125?200左右。

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)分子量大小，選擇合適的凝膠總濃度和Acr

和Bis的比例。

分子量與凝膠濃度的關(guān)系

分子量范圍凝膠濃度(%)

蛋白質(zhì)〈IO"20-30

1-4X10415-20

4X1O4-1X1O510-15

1?5X105

5-10

>5X9

2-5

核酸＜及15-20

IO,?及5-10

l~2X1052-5

2.不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳的三種效應(yīng)

(1)濃縮效應(yīng)。不連續(xù)園盤(pán)電泳一般是在小玻璃管內(nèi)進(jìn)

行的。把三種性質(zhì)不完全一樣的聚

丙烯酰胺凝膠重疊起來(lái)。如圖4-3樣品股

所示，上層為樣品膠，中間為濃縮《間隔般，蟲(chóng)抄UZ的、

膠，這兩層膠的凝膠濃度為3%是大

孔膠，應(yīng)用Tris-HCL緩沖液，其分離酸(電沫殷》

PH6.7o下層是分離膠，此層凝膠總

濃度為7.5%,是小孔膠，也用

Tris-HCL緩沖液，pH8.90上下電

極槽緩沖液是Tris-甘氨酸緩沖液，pH=8.3。通電后，向陽(yáng)極

泳動(dòng)的陰離子有三種，即C1,蛋白質(zhì)陰離子(Pr。和甘氨

酸陰離子(Gly-)0在樣品膠及濃縮膠pH=6.7的環(huán)境下HC1

全部電離為Cr,甘氨酸僅極少部分電離為Gly一（甘氨酸等

電點(diǎn)pI=6.0）,一般酸性蛋白質(zhì)也解離為陰離子。這樣，C1-

泳動(dòng)最快（稱(chēng)快離子），Gly-泳動(dòng)最慢（稱(chēng)慢離子），蛋白質(zhì)介

于其間。通電后，快離子很快超過(guò)蛋白質(zhì)離子和Gly,泳動(dòng)

到最前面。于是，快慢離子之間形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域,

即低電導(dǎo)區(qū)域，低電導(dǎo)區(qū)域有較高的電壓梯度。電壓梯度驅(qū)

動(dòng)慢離子加速泳動(dòng)。這樣，當(dāng)快慢離子移動(dòng)速度相等時(shí)，就

建立一個(gè)不斷向陽(yáng)極移動(dòng)的界面。Pr一的泳動(dòng)速度恰好介于

快慢離子之間。因而被擠壓在快慢離子之間形成一條窄帶。

這種濃縮作用可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。血清蛋白在紙上電泳

和醋酸纖維素薄膜電泳上僅可分成5?7個(gè)組分。而在聚丙烯

酰胺凝膠電泳上則可以分為20-30個(gè)成分。

（2）電荷效應(yīng)：蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的

高濃度蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所帶有效電荷不同,

因而泳動(dòng)率也不同，因此各種蛋白質(zhì)就按泳動(dòng)率快慢順序排

列成一個(gè)一個(gè)圓盤(pán)區(qū)帶。在進(jìn)入分離膠時(shí)，電荷效應(yīng)仍起作

用。

（3）分子篩效應(yīng)：當(dāng)被濃縮的蛋白質(zhì)樣品從濃縮膠進(jìn)入

分離膠時(shí)，pH值和凝膠孔徑突然改變，選擇分離膠的pH值

8.9接近甘氨酸的Pka值（9.7?9.8）,這樣慢離子的解離度

增大，因而它的有效泳動(dòng)率也增加。此時(shí)慢離子的有效泳動(dòng)

率超過(guò)了所有蛋白質(zhì)的有效泳動(dòng)率。這樣，高電勢(shì)梯度不存

在了，各種蛋白質(zhì)僅會(huì)由于其分子量或構(gòu)型的不同，在一個(gè)

均一的電勢(shì)梯度和pH條件下通過(guò)一定孔徑的分離膠時(shí)所受阻

滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動(dòng)率的不同而被分開(kāi)。

【器材】

電泳儀、垂直板電泳槽、進(jìn)樣器、乳頭吸管、50ml小燒

杯

【試劑】

1.30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.2g,甲叉雙丙烯酰胺

0.8g,加水至100mL棕色瓶4℃保存。

2.1.5mol/LTris-HCl分離膠緩沖液pH8.8（4x）：取

18.15gTris,用1MHC1調(diào)pH至&8,加水至100ml,4℃保

存。

3.0.5mol/LTris-HCl濃縮膠緩沖液，pH6.8（4x）：

取5.98gTris,用INHC1調(diào)至pH6.8,加水至100ml,4℃

保存。

4.電極緩沖液（pH8.3）：取14.49g甘氨酸，3.02gTris,

加100ml10%SDS,加水至1升,4c保存。

5.10%過(guò)硫酸筱溶液（AP）：臨用前現(xiàn)配。

6.染色液（0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250、50%甲醇、7%乙酸）:

考馬斯亮藍(lán)R-2502.5g、甲醇（可用無(wú)水乙醇代替）500ml>

70ml冰乙酸，溶解后補(bǔ)足水至總體積1000mlo

7.脫色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用無(wú)水乙醇代

替）300ml,冰乙酸70mL補(bǔ)足水至1000mL

【操作步驟】

1.凝膠柱的制備

（1）取兩端已有金鋼砂磨平的10X0.6cm的玻璃管。在

距一端7cm和7.5cm處，各劃一條線。插入橡皮墊，垂直安

放于試管架中。

（2）按分離膠配制比例（見(jiàn)下表）加入各種試劑，混勻

后即成為分離膠溶液。迅速用乳頭吸管將分離膠加入玻璃管

內(nèi)，至7cm劃線處。

（3）用細(xì)尖的乳頭吸管沿玻璃管壁加入蒸儲(chǔ)水約0.5cm,

加水時(shí)要緩慢，盡量減少凝膠表面的震動(dòng)與混合。靜置1小

時(shí)以上。

(4)按濃縮膠配制比例(見(jiàn)下表)加入各種試劑:

分離膠和濃縮膠溶液的配制

分離膠(ml)濃縮膠(ml)

H2O6.207.65

30%丙烯酰胺2.501.00

分離膠緩沖液1.25—

(pH8.8)

濃縮膠緩沖液—1.25

(pH6.8)

TEMED0.0050.005

10%過(guò)硫酸錢(qián)0.050.05

總體積10ml10ml

(5)用乳頭吸管吸去分離膠管上面的水層，加入少許濃

縮膠迅速吸出去(目的是洗出分離膠表面的水)。

(6)用乳頭吸管沿凝膠管壁加入濃縮膠溶液至7.5cm處,

并隨即沿管壁緩慢加入約0.5cm高度，靜置20分鐘。

2.樣品配制

正常入血清0.1ml,加入濃縮膠緩沖液1.5ml,加入蔗糖

200mg/ML0.1ml,及0.05%溟酚蘭水溶液0.1ml,,輕搖混勻。

3.電泳

(1)選擇無(wú)氣泡和裂縫、聚合均勻的凝膠去水并垂直安

放在上電極糟的橡皮塞孔中。

(2)加入電極緩沖液于上、下電泳槽中，使電極緩沖液

淹沒(méi)凝膠管中，用乳頭吸管排除凝膠管上下口中的氣泡。

(3)加樣：用微量注射器取樣品液加30ul,沿管壁加

在濃縮膠面上，注入時(shí)要慢。標(biāo)記各管的編號(hào)。

(4)電冰：將上層電極糟的電極接在電泳儀的負(fù)極、下

層電極糟的電極接在電泳議的正極、接好電源。調(diào)節(jié)電流為

l-2mA/管。待示蹤劑進(jìn)入分離膠時(shí)，調(diào)節(jié)電流為2-4mA/管。

當(dāng)示蹤劑移出玻璃管下口約30分鐘，切斷電源。

4.剝膠

取下凝膠管，用帶有10cm長(zhǎng)局麻針頭注射器，盛滿(mǎn)蒸饋

水做潤(rùn)滑劑。將針頭插入膠與管壁之間，邊注入水邊旋轉(zhuǎn)玻

璃管。直至膠柱與管壁分開(kāi)。然后用吸耳球輕輕在膠管的一

端加壓，使凝膠從玻璃管中緩慢滑出，進(jìn)入到已編號(hào)的試管

內(nèi)。

5.染色、脫色、固定、保存

向裝有凝膠柱的試管中加入染色液，使凝膠柱全都浸泡在

染色液于60c水浴中染色30分鐘、傾去染色液，加入固定、

保存液，更換三次，次日觀察結(jié)果。

【注】Acr和Bis都是神經(jīng)性毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用、但

在形成凝膠后則無(wú)毒，操作時(shí)應(yīng)盡量避免接觸皮膚，并注意

洗手。

【思考題】

1.配制樣品時(shí)，為什么要加入蔗糖？

2.電泳時(shí)，為什么要把上層電泳槽接在負(fù)極上？

實(shí)驗(yàn)七蛋白質(zhì)印跡免疫分析(WesternBlot

Anglysis)

【基本原理】

蛋白質(zhì)印跡免疫分析的過(guò)程包括蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離

后，在電場(chǎng)作用下將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素

膜上，經(jīng)封閉后再用抗待檢蛋白質(zhì)的抗體作為探針與之結(jié)合,

經(jīng)洗滌后，再將濾膜與二級(jí)試劑一放射性標(biāo)記的或辣根過(guò)氧

化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)抗免疫球蛋白抗體結(jié)合，進(jìn)一步洗

滌后，通過(guò)放射自顯影或原位酶反應(yīng)來(lái)確定抗原一抗體一抗

抗體復(fù)合物在濾膜上的位置和豐度。

【器材】

轉(zhuǎn)移電泳儀，硝酸纖維素膜，濾紙，剪刀，手套，小尺

【試劑】

1.IgG標(biāo)準(zhǔn)品

2.羊抗人辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG抗體

3.轉(zhuǎn)移buffer：Tris3.03g,Glyl4.4g,甲醇200ml,

加三蒸水至1000ml充分溶解，4℃冰箱貯存。

4.Trisbuffer(TBS)：Tris2.42g,NaCl29.2g,溶于

600ml三蒸水，再用INHC1調(diào)至pH7.5,然后補(bǔ)加三蒸水至

1000mlo

5.漂洗液(TTBS)：TBSM500ml,加Tween20250ulo

6.封閉液：5%脫脂奶粉。

7.抗體buffer：1.5gBSA溶于50mlTTBSo

8.顯色液DAB(3.3-diaminobenzidine,3.3-二氨基聯(lián)苯

胺)配制：5mgDAB溶于10ml檸檬酸buffer(0.Olmol/L檸

檬酸2.6ml,0.02mol/LNa2HP0417.39ml),力口30%H20210

ul(臨用時(shí)現(xiàn)配)。

9.脫色液：甲醇2501nL冰醋酸100mL加蒸儲(chǔ)水至1000mlo

10.氨基黑染色液(0.現(xiàn)氨基黑-10B)：0.2g氨基黑-10B

溶于200nli脫色液中，充分?jǐn)嚢枞芙猓瑸V紙過(guò)濾。

【操作步驟】

一、樣品的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

L安裝制膠模具

2.根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)選擇某一合適的分離膠濃度。按下表

所列的試劑用量配。

分離膠的配制

7.5%(m15%(ml)

1)10%(ml)

4.904.102.40

H2O

30%丙烯酰胺2.503.305.00

分離膠緩沖液2.502.502.50

(pH8.8)

10%SDS0.100.100.10

TEMED0.020.020.02

10%過(guò)硫酸鐵0.020.020.02

總體積10ml10ml10ml

將分離膠混勻后立即灌注于玻板間隙中，上層小心覆蓋

一層正丁醇。將膠板垂直放于室溫下，待分離膠聚合完全后,

傾去正丁醇并用濾紙吸干。

3.濃縮膠的制備

按下表配制濃縮膠，將濃縮膠混勻后直接灌注在已聚合

的分離膠上，立即插入梳子，將凝膠垂直放于室溫下聚合。

濃縮膠的配制

3%(ml)4%(ml)6%(ml)

H2O3.052.7

3.2

30%丙烯酰胺0.651.0

0.5

濃縮膠緩沖液1.251.25

(pH6.8)1.25

10%SDS0.050.05

0.05

TEMED0.050.05

0.05

10%過(guò)硫酸鉉0.050.05

0.05

總體積5ml5ml5ml

4.樣品預(yù)處理：取樣品液與等體積樣品緩沖液混合，100℃

加熱1?2分鐘。

5.待濃縮膠聚合完全后，小心移出梳子，然后將膠板固

定于電泳裝置上，上下槽各加入電極緩沖液。

6.加樣：用微量進(jìn)樣器加樣。每個(gè)樣品孔加入20ul樣

品。

7.電泳：在100?150V的電壓下電泳，直至溟酚藍(lán)達(dá)到

膠底部，關(guān)閉電源。

加樣時(shí)，注意在同一塊膠上按順序做一份重復(fù)點(diǎn)樣，以備

電泳結(jié)束時(shí)，一份用于免疫鑒定，一份用于蛋白染色顯帶，

以利相互對(duì)比，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

二、轉(zhuǎn)移印跡

1.轉(zhuǎn)移前準(zhǔn)備：將濾紙，硝酸纖維素膜(NC)剪成與膠

同樣大小，NC膜浸入蒸儲(chǔ)水中10-20min后浸入轉(zhuǎn)移buffer

中平衡30min。

2.凝膠平衡：將電泳后的SDS膠板置于轉(zhuǎn)移buffer

中平衡30-60mino

3.按圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺折。

4.開(kāi)始轉(zhuǎn)移，連接正負(fù)極，蓋好蓋子，接上電源，恒流

0.8mA/cm,室溫下轉(zhuǎn)移lh,轉(zhuǎn)移后的凝膠再用氨基黑10B染

色液染色20min,然后脫色檢測(cè)轉(zhuǎn)移效果。

三、免疫染色

1.轉(zhuǎn)移后的NC膜于5%脫脂奶粉中封閉，4℃過(guò)夜。

2.TBS洗膜1-2次，lOmin/次。

3.加HRP標(biāo)記的抗體，室溫lho

4.TBS洗3次,lOmin/次。

5.NC膜再轉(zhuǎn)入DAB顯色液中，置暗處反應(yīng)，待顯色反應(yīng)

達(dá)到最佳程度時(shí)，立即用三蒸水洗滌終止反應(yīng)。

負(fù)極

濾紙

轉(zhuǎn)移單位示意圖

正極

【思考題】

此實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)是什么？

實(shí)驗(yàn)八微機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)

將計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)手段（即CAI）用于高等學(xué)校的教學(xué)工

作，近年來(lái)已取得了很大發(fā)展，這是高校教學(xué)改革的重要方

向。而將CAI用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，模擬動(dòng)態(tài)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，則難度

較大，目前成熟的實(shí)用軟件還不多見(jiàn)。在生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)中

使用計(jì)算機(jī)模擬純化生物大分子的實(shí)驗(yàn)軟件，意義就更為重

大，因?yàn)樯髮?shí)驗(yàn)的試劑十分昂貴，要用到各種離心機(jī)和

分光光度計(jì)，以及自動(dòng)部份收集器、電泳儀等十幾種儀器設(shè)

備，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的儀器裝備條件要求很高。此外，由于生物材

料的組成十分復(fù)雜，生物大分子的含量通常極微量，實(shí)驗(yàn)流

程又長(zhǎng)，有的實(shí)驗(yàn)要連續(xù)做一、二周，因而實(shí)驗(yàn)難度較大，

如果能在生化大實(shí)驗(yàn)中使用CAI,則可以獲得比其他實(shí)驗(yàn)課更

顯著的教學(xué)效果。

清華大學(xué)生物系生化大實(shí)驗(yàn)教學(xué)組多年前就十分重視CAI

的工作，從1989年開(kāi)始就將計(jì)算機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化的實(shí)驗(yàn)教

學(xué)軟件用于生化大實(shí)驗(yàn)的教學(xué)，簡(jiǎn)稱(chēng)為“干實(shí)驗(yàn)”。

[]Windows界面下計(jì)算機(jī)模擬純化蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)軟件：

由于DOS系統(tǒng)下的實(shí)驗(yàn)軟件已使用多年，而且是八十年

代編制的，現(xiàn)已十分落后，分離純化實(shí)驗(yàn)條件的選擇太少，

產(chǎn)率的計(jì)算時(shí)常超過(guò)100%,同一種酶使用不同的分離純化實(shí)

驗(yàn)條件，有時(shí)會(huì)得到相同的結(jié)果，因此由1996年開(kāi)始編制新

的Windows界面下的實(shí)驗(yàn)軟件，軟件名稱(chēng)是“Protein”,該

軟件是用VisualBasic編寫(xiě)的Win3.1/Win95應(yīng)用程序，

界面簡(jiǎn)潔明了，可以用鼠標(biāo)很方便的操作，并有完整的幫助

文件，對(duì)操作方法和使用的各種生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)詳加說(shuō)明，使

用者短時(shí)間即可熟練操作。

“Protein”軟件有36個(gè)任務(wù)，即36組待分離純化的蛋

白。任務(wù)要求利用軟件提供的幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提純每一個(gè)目

的蛋白，最終達(dá)到單向電泳一條帶，雙向電泳一個(gè)點(diǎn)，而且

使用的人時(shí)和經(jīng)費(fèi)（根據(jù)提取步驟計(jì)算得到）不得超過(guò)一個(gè)特

定值。在每個(gè)任務(wù)開(kāi)始時(shí)，軟件給出目的蛋白的一些性質(zhì)，

如熱穩(wěn)定的溫度范圍和pH穩(wěn)定范圍等，利用這些信息，可以

使實(shí)驗(yàn)少走彎路。

“Protein”提供的分離純化方法有七種：①熱變性；②

硫錢(qián)沉淀；③排阻層析（凝膠色譜）；④離子交換層析；⑤吸

附層析；⑥聚焦層析；⑦制備電泳。

例如，在使用層析方法時(shí)，可在Chromatography菜單下

點(diǎn)選上述四種層析方法，彈出相應(yīng)的參數(shù)對(duì)話框，此時(shí)要求

輸入柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、柱填料類(lèi)型、緩沖液組分及pH值和洗脫速

度等。如果采用梯度洗脫，還要求輸入梯度洗脫的初始和終

末濃度及洗脫體積，在輸入?yún)?shù)之后，計(jì)算機(jī)模擬洗脫過(guò)程,

并且畫(huà)出A280洗脫曲線和酶活曲線，此時(shí)，可以根據(jù)分離的

情況和酶活的峰位來(lái)收集組份，在收集之前還可以用電泳查

看洗脫曲線上某一部位的分離效果。在確認(rèn)收集之后，

“Protein”軟件記錄該步操作的條件，計(jì)算回收率、純化倍

數(shù)以及消耗的人時(shí)和經(jīng)費(fèi)等。

經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的模擬實(shí)驗(yàn)，初步純化了目的蛋白，在雙

向電泳圖上能夠確定該蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)之后，還需

要重新對(duì)其各步驟的實(shí)驗(yàn)條件，尤其是離子交換層析、排阻

層析和制備電泳等實(shí)驗(yàn)步驟的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行修改，以找到適

合該蛋白質(zhì)的最佳分離純化實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)條件。

在“Protein”所提供的各種分離純化方法中，熱變性法

和鹽析法是比較好的粗提方法，在提純的早期使用效果較好。

層析是各種方法中最強(qiáng)有力的方法，制備電泳雖然純化倍數(shù)

高，但是回收率低。在各種層析方法中，又以離子交換層析

最為有效和易于使用，并且耗費(fèi)的人時(shí)和經(jīng)費(fèi)也較少。排層

層析和聚焦層析耗費(fèi)較大，但在某些特定情況下，這兩種方

法是不可替代的。

“Protein”提供了四種電泳方法：即，SDS、PAGE、

等電聚焦電泳和雙向電泳。這些電泳方法不但可以用以檢測(cè)

樣品的純度，而且也給出了樣品的一些信息，如分子量、等

電點(diǎn)等，這些信息對(duì)于后續(xù)提純有重要的參考價(jià)值，等電聚

焦電泳和PAGE還可以用于制備。

“Protein”新軟件的投入使用，使生化大實(shí)驗(yàn)的CAI教

學(xué)水平上了一個(gè)新臺(tái)階，它的優(yōu)點(diǎn)是：在幾小時(shí)內(nèi)可以模擬

完成大量的生化實(shí)驗(yàn)分離純化過(guò)程，既經(jīng)濟(jì)，效率又很高，

實(shí)現(xiàn)了學(xué)生們想設(shè)計(jì)生化大實(shí)驗(yàn)的要求，而在實(shí)驗(yàn)室里要想

實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程是非常困難的。通過(guò)“干實(shí)驗(yàn)”的教學(xué)，對(duì)生

化大實(shí)驗(yàn)中的各種實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)的比較和選用，對(duì)所用

的幾種主要生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以加深認(rèn)識(shí)和理解。

本實(shí)驗(yàn)要求完成Windows版實(shí)驗(yàn)軟件中四至五種酶的分

離純化，而且要挑選一種酶做出其鹽析曲線。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求列表詳細(xì)寫(xiě)出分離純化的實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)條

件和實(shí)驗(yàn)結(jié)果（包括分子量和等電點(diǎn)），并畫(huà)出洗脫曲線。

第二章核酸的化學(xué)

實(shí)驗(yàn)九真核生物基因組DNA的制備（苯酚法）

【原理】

DNA是儲(chǔ)存遺傳信息的物質(zhì)，是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，它與生

命的正?；顒?dòng)如種的遺傳、生長(zhǎng)發(fā)育有密切關(guān)系。其結(jié)構(gòu)與

功能的研究是當(dāng)前分子生物學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。

核酸廣泛存在于生物中，DNA含有生物體的全部遺傳信息,

在生物組織中以核蛋白(DNP)形式存在。真核生物中，DNA主

要存在于細(xì)胞核中，核外也有少量，如線粒體DNA,稱(chēng)為核外

基因。DNA的分子長(zhǎng)度一般隨生物由低級(jí)進(jìn)化到高級(jí)而增加。

9

人類(lèi)基因組含2.9X10bpo

無(wú)論是研究核酸的結(jié)構(gòu)，還是它的功能，首先需要對(duì)核酸

進(jìn)行分離與提純。分離與提純核酸最基本的要求是保持核酸

的完整性及純度。

要從生物組織中提取DNA,因DNA是以核蛋白(DNP)形式

存在于細(xì)胞核中故首先必須粉碎組織，裂解細(xì)胞膜和核膜，

使DNP釋放出來(lái)，再用苯酚提取蛋白。由于細(xì)胞中的核糖核

蛋白(RNP)和DNP往往一起被提取，故DNA沉淀中混有RNA。

需用核糖核酸酶(RNase)處理，去除RNA。并用蛋白酶將遺留

的少量蛋白質(zhì)水解除去，再經(jīng)苯酚處理，乙醇沉淀，最后可

得較為純凈的DNAo它的純度可以從260nm波長(zhǎng)處的光密度和

280nm波長(zhǎng)處的光密度之比值測(cè)知，一般以O(shè)D260nm/0D

280nin能達(dá)到1.8左右為標(biāo)準(zhǔn)。

分離與提純過(guò)程中保持DNA的完整性和純度存在許多困

難，主要原因有：

(D細(xì)胞內(nèi)存在很高的DNA酶活性，在分離與提純過(guò)程中

會(huì)造成核酸的降解。，

(2)DNA分子很大，分離過(guò)程中因化學(xué)因素或物理因素使

DNA降解，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、溫度過(guò)高或機(jī)械張力剪切等。DNA

的定量可采用化學(xué)的定磷法、定核酸法。目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采

用紫外分光光度法測(cè)定核酸含量，以下公式可作為紫外定量

時(shí)參考：雙鏈DNA含量：OD260nmX樣品稀釋倍數(shù)X50ug/

ml=ug/ml樣品。

【器材】

1.塑料離心管：6

2.刻度離心管：1

3.滴管：長(zhǎng)：1吸酚：氯仿混合液

中：1吸乙醇

短(鈍口)：1吸DNA水溶液

4.細(xì)玻棒：1

5.移液管：1

6.微量取樣器1

7.手套：1副

8.離心機(jī)

9.紫外分光光度計(jì)

10.37℃水浴，50℃水浴

11.組織搗碎器

12.電泳儀及電泳槽

【試劑】

1.裂解緩沖液：

(l)50mmol/1Tris-HClpH7.4(2)20mmol/lEDTA

(3)0.5%SDS(4)100mmol/lNaCl

配法：

lmol/1Tris-HClpH7.450ml

20%SDS25ml

2mol/lNaCl50ml

0.5mol/lEDTA40ml

蒸儲(chǔ)水稀釋至1000ml

其中Tris-HclpH7.4維持PH恒定，防止DNA變性和水

解。EDTA能絡(luò)合二價(jià)金屬離子，當(dāng)Mg+，被絡(luò)合后，細(xì)胞內(nèi)

釋放出來(lái)的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同時(shí)

金屬離于絡(luò)合后，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性下降，有利于膜的裂解；

SDS有使蛋白質(zhì)變性的作用，它能破壞膜蛋白的構(gòu)象，因此使

膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸與蛋白質(zhì)解離，并且SDS

也具有抑制DNA酶的作用。

2.苯酚

重蒸苯酚加入抗氧化劑8-羥喳琳Img/mL用lmol/1

PH8.0Tris-HCl洗一次，再用0.lmol/ITris-HClPH8.0

洗二次，苯酚PH在7.6?7.8之間。

3.苯酚：氯仿混和液（1：1）

苯酚加上等體積氯仿并用水飽和，混和液分層，上層為

水相，下層為有機(jī)相且?guī)S色。苯酚和氯仿都是蛋白質(zhì)變性

劑，苯酚使蛋白質(zhì)變性的作用強(qiáng)于氯仿，但氯仿具有較好的

分層作用。

4.無(wú)水乙醇

DNA在PH7.4條件下分于帶負(fù)電，在NaCl存在條件下，

DNA鹽呈電中性，乙醇將DNA分子周?chē)乃謯Z去，DNA失水

形成白色絮狀沉淀。

5.TE緩沖液

50mmol/lTris-HClpH7.0

5mmol/lEDTA

配法：

Imol/1Tris-HClpH7.410ml

0.5mol/lEDTAEDTA

蒸儲(chǔ)水稀釋至1000ml

6.RNaselOmg/ml

配法：

稱(chēng)取RNase溶解在lOmmol/1Tris-HCl(PH7.5)和15mmol

/LTris-HC1(PH7.5)和15mmol/INacl落液中使之濃度為

10mg/mlo100C加溫15分鐘，使夾雜的少許DNase失活，

然后慢慢冷卻，分裝于小管中-20℃保存。

7.蛋白酶K(10mg/ml)-20℃保存。

蛋白酶K優(yōu)點(diǎn)：水解能力很強(qiáng)，作用廣泛，可與SDS

及EDTA合并使用。

8.20%SDS

9.0.5mol/LEDTA

10.12mol/L高氯酸

【操作】

1.取新鮮鼠肝用冰生理鹽水洗去血水，用濾紙吸干,

-70℃冰箱中保存，用時(shí)取出。

2.1克鼠肝加10ml裂解緩沖液，在組織勻漿器中勻漿約

1分鐘（2次，每次30秒）

3.取塑料離心管1支加入1/3支勻漿液（若勻漿液太稠,

則再加入hnlTE緩沖液），然后再加入等體積苯酚：氯仿混和

液抽提。每次抽提輕緩地來(lái)回?fù)u動(dòng)5分鐘，然后離心10000

轉(zhuǎn)/分鐘X5分鐘，水相吸入另一干凈的離心管中，重復(fù)抽提

二次。

注意：每次水相時(shí)不要將界面上的變性蛋白質(zhì)混入，抽提

r-]

本卷

爻性苑由藤

一貨機(jī)相

臧注■,

?心后的分■

二次后一般有機(jī)相和水相界面上的變性蛋白質(zhì)極少，肉眼基

本看不見(jiàn)。若界面上變性蛋白質(zhì)仍較多，可增加抽提次數(shù)

4.水相加入一刻度離心管中后，加入2.5倍體積的冰

無(wú)水乙醇（可用刻度離心管測(cè)量體積）。加5mol/LNaGI到終

濃度為0.lmol/L,在離心管中輕緩的混勻，此時(shí)可見(jiàn)白色絮

狀沉淀，此即DNA粗制品。

5.用玻棒撈起DNA沉淀，放入小燒杯中，用70%乙醇洗

滌沉淀一次，洗滌時(shí)動(dòng)作要輕，防止DNA被切斷。

6.沉淀取出放入一干凈的塑料離心管中，用ImlTE緩沖

液溶解。

7.在ImlDNA溶液中加入10mg/ml的RNA酶20P1,使

最終濃度達(dá)到200ug/血，37c保溫30分鐘。

8.加入20%SDS25U1,使最終濃度至0.5%加入0.5mol/l

EDTA30ul至20mmol/l；力口10mg/ml蛋白酶K20ul,使最終濃

度為200ug/ml,50E保溫30分鐘。

9.加等體積苯酚：氯仿混合液抽提，重復(fù)一次，去除蛋

白酶K及其它殘留的蛋白質(zhì)，至界面無(wú)明顯的變性蛋白質(zhì)為

止。每次抽提輕緩地來(lái)回?fù)u動(dòng)5分鐘，離心10000轉(zhuǎn)/分鐘

X5分鐘。

10.吸取水相，水相吸至一干凈刻度離心管中量出積體,

再加入2.5倍體積的冰無(wú)水乙醇，加5moi/LNaCl至終濃度

為0.lmol/L,混勻后可得較純的DNA沉淀，再用70%乙醇

洗滌沉淀一次。

11.在一干凈的塑料離心管中用0.3—0.5ml緩沖液溶

解沉淀，得到提純的DNA原液。

12.吸取DNA原液lOOuL用TE緩沖液稀釋至3ml(1:30

稀釋)，(若DNA原液太濃,取原液50uL太稀則取原液200ul)o

在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定0.D260nm及0.D280nm的讀數(shù)。計(jì)

算：0.D260nm/0.D280nm比值，DNA濃度及DNA總量。剩余

原液寫(xiě)上自己的學(xué)號(hào)，交給帶教老師保存，留作做PCR實(shí)驗(yàn),

【注意事項(xiàng)】.

1.為盡可能避免DNA大分子的斷裂，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須

(1)勻漿時(shí)應(yīng)保持低溫，勻漿時(shí)間應(yīng)短，勿用玻璃勻漿器。

(2)實(shí)驗(yàn)中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，

并燒成鈍口。

(3)酚抽提時(shí)勿劇烈振搖。

2.保持DNA活性，避免酸、堿或其它變性因素使DNA變

性。，

3.苯酚是一種強(qiáng)列的蛋白質(zhì)變性劑。實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)戴手套

操作，避免碰到皮膚，以免灼傷。苯酚蒸汽毒性較大，實(shí)驗(yàn)

中應(yīng)注意將盛酚的試劑瓶蓋好。

4.離心時(shí)要注意管于間的重量平衡。管于要對(duì)稱(chēng)放置，

當(dāng)離心達(dá)到所需速度后再開(kāi)始計(jì)時(shí)。

【思考題】

1.如樣晶中有蛋白質(zhì)存在，其紫外分析結(jié)果有何表現(xiàn)?

如何進(jìn)一步純化？

2.DNA的定量可采用那些方法？目前常用的是哪種?如何

測(cè)定DNA的含量？

3.從生物細(xì)胞中提取DNA的主要注意點(diǎn)是什么?應(yīng)如何

控制？

4.能引起DNA變性的因素有哪些?DNA降解和DNA變性有

何區(qū)別?如何鑒別？

實(shí)驗(yàn)十DNA與RNA含量測(cè)定

【基本原理】

核酸分子中含有堿基使核酸在260nm下有最大吸收。紫外

吸收是噂吟環(huán)和喀咤環(huán)的共飄雙鍵系統(tǒng)所具有的性質(zhì)，含有

口票吟和喀咤的物質(zhì)，不論是核昔、核昔酸或核酸都有吸收紫

外光的特性。

蛋白質(zhì)由于含芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光，通常

蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)有特異吸收。因此核酸在A海及A260>A%。

測(cè)定的比值（A260/A28。）可以反映樣品中核酸的含量及純度。

RNA在A26o/A28o的比值在2.0以上；DNA在A260/A280的比值為1.8

左右。當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)比值即下降。

DNA濃度計(jì)算公式：

小濃度（〃g/"）=皿亞皿鯉

根據(jù)濃度計(jì)算DNA總量:

DNA總量（ug）=DNA濃度（ug/111）義體積（口1）

【器材】

紫外分光光度計(jì)、紫外燈或凝膠成像儀

【試劑】

1.雙蒸水

2.DNA樣品或RNA樣品

【操作步驟】

1.將樣品加適量水