綜合性實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)的分離提取SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及Westen印跡

蛋白質(zhì)的別離提取

蛋白質(zhì)分子在水溶液中因其外表帶有一定數(shù)量的電荷及形成水化膜使其成為穩(wěn)定的膠體顆粒。在某些物理或化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒由于失去電荷和水化膜而沉淀。中性鹽、重金屬鹽、三氯乙酸和乙醇等都是常用的沉淀蛋白質(zhì)的試劑。Ⅰ、蛋白質(zhì)的鹽析大量中性鹽類如硫酸銨(NH4)2SO4、硫酸鈉(Na2SO4)和氯化鈉(NaCl)等參加到蛋白質(zhì)溶液后，可引起蛋白質(zhì)顆粒因失去水化膜和電荷而沉淀。各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小和電荷數(shù)量不同，用不同濃度中性鹽可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中沉淀。當(dāng)硫酸銨濃度到達(dá)飽和時(shí)血清中的白蛋白便沉淀下來(lái)。鹽析沉淀蛋白質(zhì)時(shí)能保持蛋白質(zhì)不變性，加水稀釋降低鹽濃度，能使沉淀的蛋白質(zhì)重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用鹽析法可到達(dá)別離提純蛋白質(zhì)的目的。Ⅱ、重金屬鹽和三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+等可與蛋白質(zhì)分子上的羧基結(jié)合生成不溶性蛋白質(zhì)金屬鹽而沉淀。三氯乙酸屬生物堿試劑，能與蛋白質(zhì)分子上的氨基結(jié)合而沉淀。它們均可引起蛋白質(zhì)分子的變性和失去生物學(xué)活性。PrNH3+COO-OH-PrNH2COO-Ag+PrNH2COOAgPrNH3+COO-CCl3COOHPrNH3+·-OOCCCl3COOHⅢ、乙醇沉淀蛋白質(zhì)某些可與水混合的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇和丙酮等，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，降低其在溶液中的穩(wěn)定性。當(dāng)參加少量中性鹽如NaCl等或溶液pH接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)膠粒上的電荷被中和，參加上述有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)沉淀。反響在0℃～4℃下進(jìn)行，并應(yīng)立即別離沉淀物，否那么蛋白質(zhì)會(huì)變性。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，可帶正電荷也可帶負(fù)電荷。帶電荷的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中向相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)在PH8.6的緩沖液中都帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。移動(dòng)的速度主要決定于帶電荷的多少和分子的大小。電荷多、分子小，移動(dòng)就快；反之就慢。因此，利用電泳時(shí)各種蛋白質(zhì)分子移動(dòng)的速度不同，可將血清蛋白質(zhì)分成白蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白等幾條區(qū)帶。幾種常見(jiàn)電泳的比較類型優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)紙電泳設(shè)備操作簡(jiǎn)單分辨率差，電滲現(xiàn)象醋酸纖維薄膜電泳設(shè)備操作簡(jiǎn)單，樣品用量少分辨率差瓊脂糖凝膠電泳快速，分辨率高電滲現(xiàn)象嚴(yán)重聚丙烯酰胺凝膠電泳可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，樣品用量少分辨率高，無(wú)電滲現(xiàn)象高濃度凝膠難剝離凝膠濃度(T)的選擇與被別離物質(zhì)分子量密切相關(guān)表3.4分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋白質(zhì)104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 5×105 2-5 核酸(RNA) 104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 圖2夾心垂直板電泳槽示意圖

圖3凝膠模示意圖

返回不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及別離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。別離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素?！?〕樣品濃縮效應(yīng)(a)凝膠孔徑不連續(xù)性：(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；在pH6.7的凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-)尾隨離子(trailingion)或慢離子：甘氨酸根mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當(dāng)進(jìn)入pH8.9的別離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過(guò)蛋白質(zhì)；〔c)電位梯度的不連續(xù)性：(2)分子篩效應(yīng)(3)電荷效應(yīng)A.樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：緩沖液成分及pH的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性緩沖液濃縮膠樣品分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－〞極向“＋〞極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入別離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液樣品濃縮膠分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－〞極向“＋〞極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入別離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液樣品濃縮膠分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－〞極向“＋〞極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入別離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液濃縮膠分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)蛋白質(zhì)從“－〞極向“＋〞極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入別離膠，速度變慢，堆積濃縮。緩沖液濃縮膠分離膠B.電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入別離膠后pH增大(pH8.9)，Gly－解離度增大，不存在快、慢離子之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電場(chǎng)強(qiáng)度和pH條件下泳動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)pI不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。緩沖液濃縮膠分離膠C.分子篩效應(yīng)別離膠的孔徑小，各分子由于大小和形狀不同，所受阻力不同，表現(xiàn)出不同的泳動(dòng)速度，即分子篩作用。分子量小，形狀為球形的泳動(dòng)速度最快。緩沖液濃縮膠分離膠三操作步驟㈠貯液及凝膠溶液的配制貯液及凝膠溶液的配制方法如下表。貯液及凝膠溶液的配制貯液20mL凝膠溶液混合比5%凝膠10%凝膠IⅡ

ⅢⅣ

Acr30g凝膠貯液Bis0.8g加蒸餾水到100ml凝膠緩沖液SDS0.2g加0.2mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液至100mlTEMED蒸餾水100g/L過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨1g加蒸餾水至10ml3.33ml10ml35μl4.57ml以上溶液混合后抽氣10min0.1ml6.67ml10ml35μl1.23ml0.1ml操作方法1.安裝夾心式垂直板電泳槽(1)裝上貯槽和固定螺絲銷(xiāo)釘，仰放在桌面上。(2)將長(zhǎng)、短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽。(4)將下貯槽的銷(xiāo)孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲銷(xiāo)釘?shù)纳腺A槽，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽。(5)豎直電泳槽，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)參加已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應(yīng)防止有氣泡。SDS別離蛋白質(zhì)1.安裝膜具裝封膠條，注意封膠條平面朝下，不能有裂口蓋上凹玻璃將凹玻璃沖外裝進(jìn)槽里將楔子插進(jìn)，將底部插緊

2.制備凝膠板 將混合后的別離膠溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加至長(zhǎng)、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1mL注射器在凝膠外表沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約3–4mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。約30-60min凝膠完全聚合，那么可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。 將上、下貯槽的蒸餾水倒去，將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加到長(zhǎng)、短玻璃板的窄縫內(nèi)(即別離膠上方)，距短玻璃上緣0.5cm處，輕輕參加樣品槽模板.在上、下貯槽中參加蒸餾水，但不能超過(guò)短玻璃板上緣。靜置電泳槽，10min左右，上膠即可聚合，再放置10-20min，參加電極緩沖液，使液面沒(méi)過(guò)短玻璃板約0.5cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。

配制凝膠溶液灌膠，加到頂部，來(lái)回傾斜去氣泡插入梳子膠凝后用夾子將玻璃夾出用夾子夾緊玻璃將封膠條輕輕撕掉旋轉(zhuǎn)180度，凹玻璃向里將玻璃放進(jìn)槽內(nèi)加緩沖液樣品制備一般是蛋白質(zhì)溶解在含10g/LSDS、10g/L巰基乙醇的0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，在100℃加熱2～5min。蛋白質(zhì)的最后濃度一般為0.05～1g/L。也可以將上述溶液在37℃保溫2h而不是100℃加熱。一般說(shuō)來(lái)，兩種處理的效果都一樣。但如蛋白質(zhì)樣品中混有少量蛋白水解酶，37℃處理就會(huì)引起樣品水解，使測(cè)定失敗，而100℃加熱3min一般都能使蛋白酶失活，得到滿意的結(jié)果。也有少數(shù)例外的情況，需要采用特殊的樣品處理方法。樣品的處理及加樣

將樣品按0.5–1mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時(shí)迸出)，在100℃沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。 用微量進(jìn)樣器取10

l上述混合液，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。加樣5.電泳將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，接通冷卻水，翻開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)電流為10mA，待樣品進(jìn)入別離膠后，將電流調(diào)至20-30mA，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框1cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源及冷卻水。剝膠7.結(jié)果處理

量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率mR:相對(duì)遷移率mR=

蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)樣品溶解液：0.01mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1%SDS，1%巰基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚藍(lán)。用來(lái)溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測(cè)蛋白質(zhì)樣品。配制方法如下：SDS100mg巰基乙醇0.1ml甘油1ml溴酚藍(lán)2mg0.2mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液0.5ml加蒸餾水至總體積10ml電極緩沖液：0.1%SDS，0.1mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液。配制方法：取1gSDS，參加500ml0.2mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液，用蒸餾水定容至1000ml。染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250，參加50%甲醇水溶液454ml和冰乙酸46ml。脫色液：75ml冰乙酸，875ml蒸餾水與50ml甲醇混合。標(biāo)記的二抗一抗蛋白膜Westernblot三、操作步驟先從玻璃板內(nèi)取出凝膠，將凝膠在電轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡一下〔先把Whatman3MM濾紙及硝酸纖維素薄膜在電轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10分鐘〕，按照以下圖所示夾心方法把Whatman3MM濾紙、凝膠、硝酸纖維素薄膜、石墨板依順序放好，操作時(shí)注意驅(qū)趕氣泡。電轉(zhuǎn)移條件為常溫1Am/cm2恒流約1.5hr。15層濾紙凝膠15層濾紙NC膜石墨板石墨板〔1〕蛋白質(zhì)電泳常用SDS：?jiǎn)我粊喕M成的蛋白質(zhì)非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)Tris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的別離效果。

戴手套，防止用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜15－30min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。方向正確：凝膠在陰極，膜在陽(yáng)極。排去濾紙、膠和膜間的氣泡。電轉(zhuǎn)時(shí)間：100V1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活選擇轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率。膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置?！?〕轉(zhuǎn)膜〔3〕封閉用5％脫脂奶粉或3％BSA〔含0.1％Tween20TBS或PBS配制〕時(shí)間：室溫2h或4oC過(guò)夜〔4〕顯色或顯影顯色辣根過(guò)氧化物酶：底物為DAB堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT化學(xué)發(fā)光顯影最常用。辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物〔商品化產(chǎn)品〕注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定

化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用StrippingBuffer洗滌后〔洗滌