揚州大學(xué)基因工程期末試題卷復(fù)習(xí)要點整理

...wd......wd......wd...基因工程期末試題復(fù)習(xí)要點整理基因工程是70年代出現(xiàn)的一門科學(xué)，是生物學(xué)最具生命力和最引人注目的前沿科學(xué)之一，是現(xiàn)代生物技術(shù)的代表，是生命科學(xué)類專業(yè)中的一門重要的專業(yè)課。本課程主要介紹基因工程概述、重組DNA基本技術(shù)及原理、基因克隆、基因的別離及鑒定、基因工程的表達系統(tǒng)、基因工程的應(yīng)用等。通過本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握基因工程技術(shù)的基本原理和了解該技術(shù)在動物、植物和微生物等方面的應(yīng)用，為今后從事生物學(xué)教學(xué)、生物技術(shù)研究和產(chǎn)品開發(fā)，或進一步的研究生學(xué)習(xí)科研打下堅實的理論及專業(yè)根基。揚州大學(xué)試題紙一、名詞解釋：共10題，每題2分，共20分。1.基因:是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。2.定位克隆:獲取基因在染色體上的位置信息，然后采用各種方法對該基因進展定位和克隆3.融合基因:是指應(yīng)用DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建的一類具有來自兩個或兩個以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。4.轉(zhuǎn)化子:導(dǎo)入外源DNA后獲得了新遺傳標志的細菌細胞或其他受體細胞，又稱重組體。5.人工接頭：是人工合成的具有一個或數(shù)個特定限制性內(nèi)切酶識別和切割序列的雙股平端DNA短序列。6.RT-PCR:是指以mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈為模板進展的PCR。7.ORF:起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的連續(xù)的密碼子區(qū)域，是潛在的編碼區(qū)。8.MCS:指載體上人工合成的含有嚴密排列的多種限制核酸內(nèi)切酶的酶切位點的DNA片段。9.genetargeting:基因工程中利用活細胞染色體DNA可與外源DNA的同源性DNA序列發(fā)生重組的性質(zhì)，來進展定點修飾改造染色體上某一目的基因的技術(shù)10.5’RACE:是一種通過PCR進展cDNA末端快速克隆的技術(shù)，是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后用PCR技術(shù)擴增出某個特異位點到5’端之間未知序列的方法。四、簡答題：共4題，共20分。1．簡述獲得目的基因常用的幾種方法?！?分〕答：〔1〕直接從染色體DNA中別離：〔1分〕僅適用于原核生物、葉綠體和線粒體基因的別離，較少采用。〔2〕人工合成：〔1分〕根據(jù)多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進展人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。〔3〕從mRNA合成cDNA：〔1分〕采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補DNA〔cDNA〕，除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法通?？傻玫娇杀磉_的完整基因。〔4〕利用PCR合成：〔1分〕如目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反響(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)，在體外合成目的基因。〔5〕從基因文庫中篩選：〔1分〕首先建設(shè)基因組或cDNA文庫，利用探針從文庫中篩選目的克隆。2.分子克隆載體應(yīng)具備哪些特點〔4分〕答：(1)在宿主細胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制〔1分〕(2)必須具備適宜的酶切位點，供外源DNA片段插入，同時不影響其復(fù)制〔1分〕(3)有一定的選擇標記，用于篩選〔1分〕(4)具有較高的拷貝數(shù)，便于載體的制備〔1分〕3.cDNA文庫和基因組文庫的主要差異有哪些〔5分〕答：〔1〕基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)造基因，包括調(diào)節(jié)基因?！?分〕〔2〕基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響?！?分〕〔3〕基因組文庫中的編碼基因是真實基因，含有內(nèi)含子和外顯子，而cDNA文庫克隆的是不含內(nèi)含子的功能基因?！?分〕4.某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一BglI的切點?，F(xiàn)用BglI切割該載體進展基因克隆，問：(1)轉(zhuǎn)化后涂皿時應(yīng)加什么樣的抗生素?(2)培養(yǎng)后長出的菌落具有什么樣的抗性基因型?(3)若何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體?〔6分〕答：(1)加四環(huán)素；(2)TetrKans和TetrKanr；(3)重新點種在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，選擇只在Tet平板上生長的菌落，即為所需的重組體。五．分析題10分科學(xué)家將人的生長素基因與大腸桿菌的DNA分子進展重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達。過程如右圖所示，據(jù)圖答復(fù)：(1)人的基因之所以能與大腸桿菌的DNA分子進展重組，原因是什么(2)過程①表示的是采取什么的方法來獲取目的基因(3)檢測大腸桿菌B是否導(dǎo)入了質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒，可采用的方法和理由(4)如果把已經(jīng)導(dǎo)入了普通質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒的大腸桿菌，放在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)生什么現(xiàn)象分析原因答:〔1〕人的基因與大腸桿菌DNA的組成成分一樣，構(gòu)造一樣(2分)(2)反轉(zhuǎn)錄法(逆轉(zhuǎn)錄法)(2分)(3)將得到的大腸桿菌B涂布在一個含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長的，說明已導(dǎo)入了質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒，反之則沒有導(dǎo)入。因為普通質(zhì)粒A和重組質(zhì)粒上都有抗氨芐青霉素基因(2分)(4)有的能生長，有的不能生長導(dǎo)入普通質(zhì)粒A的細菌能生長，因為普通質(zhì)粒A上有四環(huán)素抗性基因；導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細菌不能生長，因為目的基因正插在四環(huán)素抗性基因中，破壞了其構(gòu)造和功能。(4分)六、論述題：共1題，15分。1．在基因工程操作過程中，使用的克隆載體需要具備哪些條件選擇受體細胞時需要具備哪些基本原則答：克隆載體需要具備條件：〔7分〕①載體都能攜帶外源DNA片段(基因)進入受體細胞，或停留在細胞質(zhì)中自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。(1分)②載體都具有適宜的篩選遺傳標記。(1分)③載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點，即多克隆位點。(1分)④載體都必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除受體細胞以外的其他生物細胞，尤其是人的細胞。(1分)⑤載體本身的分子量都對比小，可容納較大的外源基因片段。(1分)⑥載體在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細胞內(nèi)大量擴增。(1分)⑦載體在細胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易喪失。(0.5分)⑧載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。(0.5分)受體細胞的選擇應(yīng)具備的基本原則：〔8分〕①便于重組DNA分子的導(dǎo)入。(1分)②便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達載體所含的選擇性標記與受體細胞基因是否相匹配，從而易于對重組體進展篩選。(1分)③遺傳穩(wěn)定性高，易于進展擴大培養(yǎng)或易于進展高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達效率。對動物細胞而言，所選用的受體細胞具有對培養(yǎng)的適應(yīng)性強，可以進展貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進展培養(yǎng)。(1分)④受體細胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累，可促進外源基因高效分泌表達。(1分)⑤安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細胞或營養(yǎng)缺陷型細胞作為受體細胞。(1分)⑥能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中。從受體細胞的角度出發(fā)，通常的做法是是對其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑欤邕x用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細胞就可以防止其對重組DNA分子的降解破壞作用。(1分)⑦受體細胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無明顯偏倚性。(1分)⑧具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機制等，便于真核目的基因的高效表達。(0.5分)⑨在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。(0.5分)基因工程原理復(fù)習(xí)題思考題基因工程緒論1、基因工程的定義與特征。定義：在體外把核酸分子〔DNA的別離、合成〕插入載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合〔重組DNA〕，引入原先沒有這類分子的受體細胞內(nèi)，穩(wěn)定地復(fù)制表達繁殖，培育符合人們需要的新品種〔品系〕，生產(chǎn)人類急需的藥品、食品、工業(yè)品等。特征：1、具跨越天然物種屏障的能力。2、強調(diào)了確定的DNA片段在新寄主細胞中的擴增。2、試述基因工程的主要研究內(nèi)容。1〕、目的基因的別離2〕、DNA的體外重組〔載體、受體系統(tǒng)等〕3〕、重組DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞及其篩選4〕、基因在受體細胞內(nèi)的擴增、表達、檢測及其分析。3、基因工程在食品工業(yè)上有何應(yīng)用開展主要是通過基因重組，使各種轉(zhuǎn)基因生物提高生產(chǎn)谷氨酸、調(diào)味劑、酒類和油類等有機物的產(chǎn)率；或者改進這些有機物組成成分，提高利用價值。4、轉(zhuǎn)基因是一把雙刃劍，請客觀談?wù)剬D(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因食品安全性的認識。轉(zhuǎn)基因技術(shù)所帶來的好處是顯而易見的，在人類歷史進步和開展中起到了積極作用。首先，通過該項技術(shù)可以提供人們所需要的特性，改進培育新品種；第二，延長食品保存時間或增加營養(yǎng)成分；第三，將抗蟲防菌基因轉(zhuǎn)入到作物中，使作物本身產(chǎn)生抵抗病蟲害侵襲的能力，減少了農(nóng)藥的使用量，有利于環(huán)境保護；第四，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因食物在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛研究和應(yīng)用。人們對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要擔(dān)憂在于環(huán)境方面。外源基因的導(dǎo)入可能會造就某種強勢生物，產(chǎn)生新物種或超級雜草、損害非目標生物、破壞原有生物種群的動態(tài)平衡和生物多樣性，也即轉(zhuǎn)基因生物存在潛在的環(huán)境安全問題。轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植已有數(shù)年，食用轉(zhuǎn)基因食品的人群至少有10億之多，但至今仍未有轉(zhuǎn)基因食品對生命造成危害的實例；更何況目前每一種基因工程食品在上市前，都要經(jīng)過國家法律認可，食品衛(wèi)生部門和環(huán)境部門的嚴格檢測。只有測試合格了，才能投放市場。因此公眾完全可以安全地消費、大膽地食用轉(zhuǎn)基因食品。第一章DNA的分子特性與利用1、原核生物和真核生物的基因表達調(diào)控有何差異1〕原核基因表達調(diào)控的三個水平：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控原核基因表達調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。2〕真核生物基因表達的特點：l1．基因組DNA存在的形式與原核生物不同；l2．真核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進展；l3．基因表達具有細胞特異性或組織特異性；l4．真核基因表達的調(diào)控在多個水平上進展：DNA水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控；2、什么是基因根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為哪三類基因是具有生物學(xué)功能的、在染色體上占據(jù)一定位置的一段核苷酸序列，是分子遺傳的功能單位。根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為三類：l轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼蛋白質(zhì)的基因:包括構(gòu)造蛋白基因、編碼酶的基因、調(diào)節(jié)基因l轉(zhuǎn)錄但不翻譯產(chǎn)物的基因:包括tRNA、rRNAl不轉(zhuǎn)錄但有功能的DNA區(qū)段:如啟動子、操縱基因3、引起核酸變性的因素主要有哪些核酸變性后性質(zhì)有何變化引起核酸變性的因素：--溫度、酸、堿、甲醛和尿素等。DNA變性后，它的一系列性質(zhì)發(fā)生變化，如紫外吸收(260nm)值升高〔增色效應(yīng)〕,粘度降低等，如DNA增加25－40%.RNA約增加1.1%。。4、DNA復(fù)性及其影響因素。變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋構(gòu)造，這一過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)，也與它本身的組成和構(gòu)造有關(guān)：分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。〔附加：注意：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復(fù)性。復(fù)性的應(yīng)用：核酸的雜交，分子擴增〕第二章基因工程操作的基本技術(shù)1.DNA凝膠電泳中核酸分子別離的機理。在堿性環(huán)境下，核酸分子帶負電荷，在外加電場的作用下，分子在凝膠多孔性剛性濾孔中從負極向正極泳動，其中主要由于分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)到達別離不同大小核酸分子的目的。2.DNA凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些1〕分子本身的影響?分子的大?。盒t快?帶電荷數(shù)：多則快?分子構(gòu)型：超螺旋>解螺旋2〕電場：直流電場?電壓高則快?電壓太高則結(jié)果不準確常用3~5V/CM3〕支持物介質(zhì)?種類：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠?凝膠濃度:濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳4〕電泳緩沖液üpH值：偏堿性，帶負電荷ü離子濃度：離子濃度高_電流大_發(fā)熱快_膠溶解ü種類：TAE、TBE、TPE、TNE3.PCR的原理和主要反響過程，并分析影響PCR擴增的影響因素。PCR原理：變性溫度下，DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據(jù)堿基互補配對原則與單鏈DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導(dǎo)下合成與模板DNA互補的新鏈，實現(xiàn)DNA的擴增。影響PCR擴增的影響因素：§(1)Taq酶：常用1U/25μL3濃度低，擴增產(chǎn)物不夠；3濃度高，非特異性擴增增加；3酶的活性；§(2)dNTP的濃度：常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特異性、保真性；§(3)模板：主要考慮純度及使用量，對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。使用量從幾個ng到100ng.§(4)引物濃度：0.1-0.5μmol/L之間，過多則非特異擴增增加，形成引物二聚體；§(5)Mg2濃度：常用0.5-2.5mmol/L；影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性§(6)PCR反響程序設(shè)定：變性溫度和時間、引物退火溫度Tm與時間、引物延伸溫度與時間和循環(huán)數(shù)4.PCR引物設(shè)計的原則，假設(shè)給一指定DNA序列并需要通過PCR擴增此序列，若何設(shè)計擴增引物〔關(guān)于若何設(shè)計這個問題，靠自己了〕引物設(shè)計原則：1、GC含量45-55%；2、Tm值高于55；3、引物特異性；4、引物擴增跨度；5、是否形成引物二聚體5.定量PCR的原理Ct值的含義。原理：通過實時檢測PCR每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物相對應(yīng)的熒光信號，來實現(xiàn)對起始模板進展定量及定性的分析。初始模板量X0的對數(shù)值與C(T)值之間呈線性關(guān)系：logX0=-log(1Ex)*CtlogN6.分子雜交的類型主要有哪些探針的標記方法與標記類型常用的雙鏈DNA的標記方法是哪兩種探針的標記方法：切口平移法、隨機引物合成法，末端標記法，PCR標記法，體外轉(zhuǎn)錄標記法。探針按核酸分子分：DNA探針和RNA探針；按標記物的不同：放射性標記探針和非放射性標記探針。標記類型：按核酸分子的不同：可分為DNA探針和RNA探針根據(jù)標記物的不同：可分放射性標記探針和非放射性標記探針；雙鏈DNA探針標記主要方法：切口平移法、隨機引物合成法；7.Southern雜交一般過程及影響雜交因素。Southern雜交操作步驟:(1)用限制性內(nèi)切酶酶切DNA,經(jīng)凝膠電泳別離各酶切片段；(2)轉(zhuǎn)膜：將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；(3)預(yù)雜交：封阻濾膜上非特異性位點；(4)雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結(jié)合；(5)洗脫：去除非特異性結(jié)合的探針；(6)自顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交影響因子1〕、目的DNA在總DNA中所占的比例2〕、探針的大小和標記效率3〕、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量4〕、探針與靶DNA的同源性8.基因組文庫的構(gòu)建過程若何確定文庫的大小基因組文庫的構(gòu)建過程：1〕從生物體提取大片斷的基因組DNA；2〕用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶〔常為4堿基識別位點〕進展局部酶切或超聲波打斷基因組DNA；3〕在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當(dāng)長度的DNA片斷〔根據(jù)載體的要求〕；4〕載體的酶切、回收；5〕將處理好的基因組DNA片斷與載體連接；6〕將重組子導(dǎo)入宿主細胞7〕文庫的鑒定、收集、保存；確定文庫大小的方法：以在構(gòu)建的基因組文庫中任一基因存在的概率來衡量文庫的質(zhì)量或完備性，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N〔即文庫大小〕之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：N：文庫所需的總克隆數(shù)；P：任一基因被克隆〔或存在于基因文庫中〕的概率；f：克隆片段的平均大小/生物基因組的大小。9.基因文庫的類型包括哪兩種各有什么特點10.一般質(zhì)粒DNA的構(gòu)型有哪幾種在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點超螺旋質(zhì)粒DNA、開環(huán)質(zhì)粒DNA、線狀質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳的特點是：電泳的泳動速度由大到小分別是：超螺旋質(zhì)粒DNA>線狀質(zhì)粒DNA>開環(huán)質(zhì)粒DNA11.堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理，分析影響試驗結(jié)果的各種可能因素。堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，構(gòu)造破壞變性，環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分變性。在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來構(gòu)型，而線性大分子細菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去。〔各種可能因素是上一屆的，具體其實大家可以根據(jù)那天師兄說的去寫〕提取失?。?〕洗去雙鏈時，將質(zhì)粒DNA洗去；2〕破壁失敗，質(zhì)粒沒析出；3〕加劑問題電泳失敗：1〕電壓太高2〕沒加染色劑3〕膠穿孔4〕電泳時間過長12.電泳緩沖液使用一定時間后出現(xiàn)DNA在凝膠中跑不動現(xiàn)象的原因，有何解決方法原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；解決方法：1.更換成新配置的電泳緩沖液；2.把電泳槽中的緩沖液倒出混勻后再重新使用13.電泳的指示劑和染色劑有何區(qū)別，各自的作用是什么指示劑一定要在電泳前參加，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液；〔一般為：溴酚蘭，二甲苯青〕作用：①預(yù)知電泳的速率及方向；②使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；③一些高濃度蔗糖或其它物質(zhì)增加DNA的密度，可以防止DNA的擴散染色劑即可以在電泳前參加樣液，又可以電泳后再對凝膠染色；〔溴化已錠[EB]、硝酸銀、Goldview染料〕作用：呈現(xiàn)出核酸電泳后的帶型。第三章基因克隆的酶學(xué)根基1、限制性核酸內(nèi)切酶的類型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內(nèi)切酶〔常用II型〕2、什么是星活性，產(chǎn)生星活性的因素可能有哪些在非最適合的條件下酶的識別特異性降低，產(chǎn)生非特異性帶，這種活性稱星活性。產(chǎn)生Star活性的因素：〔書上P46-P47答案〕高濃度甘油，堿性pH，存在Mn2，低離子強度，低鹽濃度，低pH3、結(jié)合已做的實驗，分析影響酶切的因素?！策@個答案是上屆的，僅供參考〕1〕DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。2〕DNA的甲基化程度：dam甲基化酶〔修飾GATC中的A〕；dcm甲基化酶〔修飾CCA/TGG的C〕。3〕溫度：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反響溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。4〕緩沖液(Buffer)：是影響限制酶活性的重要因素。MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇〔DTT〕：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；β－巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活4、限制性核酸內(nèi)切酶命名規(guī)則及各字母代表的含義?！怖雍蛨D幫助大家理解而已〕命名規(guī)則：寄主菌屬名的第1個字母＋種名的前兩個字母＋菌株或菌型代號〔大寫〕＋空白＋發(fā)現(xiàn)序列〔羅馬數(shù)字〕例子：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)5、簡單表達同尾酶和同裂酶的差異。同尾酶：來源不同，識別的序列不同，但能切出一樣的粘性末端，連接后不能被相關(guān)的酶同時切割。同裂酶：識別序列一樣，切割位點有些一樣，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶〔PS：完全同裂酶：識別位點和切點完全一樣。不完全同裂酶：識別位點一樣，但切點不同?！?、連接酶主要有哪些類型有何異同點影響連接酶連接效果的因素主要有哪些類型：DNA連接酶和RNA連接酶異同點：一樣點：都能以DNA為模板，從5'向3'進展核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反響。不同點：DNA聚合酶識別脫氧核糖核苷酸，在DNA復(fù)制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。影響因素：〔影響因素就四個，后面分析覺得煩的話大家自己看著辦啦〕1〕連接所用的目的片段的狀態(tài)：1效率：粘性末端>平端(100倍)；15，突出>3，突出；1平端：HaeIII>AluI>HinCII>SmaI2〕連接溫度1連接效果最好在37℃，但形成的互補不穩(wěn)定;1最正確連接溫度：12-16℃，較好的連接效果，互補又較穩(wěn)定;3〕反響液中的成分：1ATP：反復(fù)凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；1單價離子：150-200mMNaCl，提高連接效果；1PEG：5%以下可以提高連接效率4〕插入片段與載體的濃度比例1載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1﹕3左右，甚至1﹕10或更高。1目的或作用：增加插入片段與載體的接觸時機，減少載體自我連接的現(xiàn)象。7、試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。〔傳說中的網(wǎng)上答案〕1、低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好。

2、在體系中加一點切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點消失。這樣可防止載體自連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。

3、足夠多的載體和插入片段是最重要的。

4、平端的連接對于離子濃度很敏感

5、盡可能縮小連接反響的體積6、建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些1〕大腸桿菌DNA聚合酶2〕Klenowfragment3〕T7DNA聚合酶4〕T4DNA聚合酶5〕修飾過的T7DNA聚合酶6〕逆轉(zhuǎn)錄酶7〕TaqDNA聚合酶第四章基因克隆的載體系統(tǒng)1、作為基因工程載體，其應(yīng)具備哪些條件!具有針對受體細胞的親緣性或親和性〔可轉(zhuǎn)移性〕；!具有適宜的篩選標記；!具有較高的外源DNA的載裝能力；!具有多克隆位點〔MCS〕；!具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點。2、質(zhì)粒的不相容性及其分子機理。●定義：任何兩種含有相似復(fù)制子構(gòu)造的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性?！穹肿訖C理：兩種含有相似復(fù)制子構(gòu)造的不同質(zhì)粒，在復(fù)制同時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢。3、載體的類型主要有哪些在基因工程操作中若何選擇載體基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進展篩選的標志基因、單一的限制酶切點等。4、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理，影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些A、化學(xué)法〔CaCl2法)轉(zhuǎn)化原理：是Ca2與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶構(gòu)造，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)〔感受態(tài)細胞〕。B、電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場，在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)。影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素:1〕載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；2〕插入片段的大?。翰迦肫卧酱?，轉(zhuǎn)化效率越低；3〕受體細胞的類型及預(yù)處理；4〕轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。5、重組體分子的選擇方法主要有哪些并簡單闡述其原理。從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個類型：〔1〕基于載體遺傳標記檢測法在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，據(jù)此可進展轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。〔2〕基于克隆DNA序列檢測法Southern印跡雜交：根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中別離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與已標記的單鏈DNA探針的雜交作用以檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段?！?〕基于外源基因產(chǎn)物檢測法如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯顏色反響，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。6、用已學(xué)過的重組體分子的選擇與鑒定技術(shù)，試設(shè)計一個試驗方案，假設(shè)一特異PCR擴出的基因或基因片斷重組進T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，若何鑒定并獲得真實轉(zhuǎn)化子(自理)第五章基因的克隆一般方法1、基因的克隆方法主要有哪些并闡述其克隆原理〔至少3種，都是書上找的，自選哈，建議必選DDRT-PCR和SSH，原因請看下題〕1〕差減雜交〔SH〕通過DNA復(fù)性動力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫的方式來進展目的基因別離克隆的。2〕抑制性差減雜交〔SSH〕SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標準化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴增。3〕差異顯示PCR〔DDRT-PCR〕利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY〔A〕構(gòu)造，在其3`端設(shè)計象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這局部基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時結(jié)合5`端的隨機引物〔20條10-mer〕，可以使不同長度的基因得到擴增。4〕DNA代表性差異分析〔DNARDA〕代表性差異分析是通過突變型〔驅(qū)趕DNA，driverDNA〕與野生型〔檢測DNA，testerDNA〕基因組之間的差異來別離和鑒定突變基因的方法。5〕擴增限制性片段長度多樣性〔AFLP〕基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈接頭，該接頭一端具有同樣的內(nèi)切酶識別粘性末端，互補連接后成為DNA模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個堿基序列作為引物的結(jié)合位點。[參考文獻：關(guān)德軍.AFLP技術(shù)原理及其在植物研究中的應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34〔15〕：3625-3628〕]6〕cDNA微陣列建設(shè)一套統(tǒng)一且具有高質(zhì)量、高代表性的cDNA列陣膜，在這一列陣膜上每個cDNA克隆都有固定的位置和編號，這樣大大方便了數(shù)據(jù)的綜合對比分析，并可對每個cDNA克隆子進展定量分析。在列陣雜交的根基上，還可以進展雜交測序，從而測定每個cDNA克隆子的序列。2、簡單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點，有何應(yīng)用主要原理：利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY〔A〕構(gòu)造，在其3`端設(shè)計象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這局部基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時結(jié)合5`端的隨機引物〔20條10-mer〕，可以使不同長度的基因得到擴增。優(yōu)點：l簡便、靈敏、高效、省時，能快速顯示mRNA的組成。l所需的mRNA量少。l各樣本mRNA的差異可同時進展對比。l擴出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等。缺點：l假陽性條帶多，對低豐度的基因表達不容易檢測。l工作量大。l無法定量研究。l擴出的條帶往往是3`端對比短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。利用該技術(shù)，目前已有越來越多的差異表達基因得以別離和鑒定，在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用?！睵221〕3、抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標準化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴增。應(yīng)用：l基因突變體的研究：如基因的表達與不表達；l基因時空表達的研究：如根、莖、葉；l不同處理條件下的基因表達差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。4、酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體外表展示技術(shù)的原理。A．酵母雙雜交技術(shù)原理：大局部真核生物的位點特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個可分隔開的構(gòu)造域，一個是DNA特異結(jié)合域〔DNA-bingingdomain,BD〕，一個是轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionalactivationdomain,AD)。這兩個構(gòu)造域各具功能，互不影響，但一個完整的、具有激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個構(gòu)造域，否則無法完成其激活功能。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結(jié)合后則能特異地激活BD結(jié)合基因的表達。B．噬菌體外表展示技術(shù)原理：當(dāng)外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個外被蛋白基因中時，如果兩者讀碼框構(gòu)造保持一致，這個外源DNA片段所編碼的產(chǎn)物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達，并顯示在噬菌體的外表。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物〔多肽或蛋白〕的抗體，通過親和純化，就能從大量的噬菌體中富集、別離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后，通過基因擴增，得到大量所要的目的基因。5、T-DNA標簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。?農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個體。?建設(shè)突變體基因組文庫及野生型基因組文庫.?用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。?用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。?把陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體進展功能互補及進展測序分析。第七章克隆基因的表達1、通過對比，分析大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點。大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢：ò全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架；ò基因克隆表達系統(tǒng)成熟、完善；ò繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；ò被FDA批準為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達外源基因的劣勢：ò缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能；ò缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)；ò內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；ò周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點：ü具有強的受嚴風(fēng)格控的AOX1啟動子ü表達蛋白的翻譯后的加工和修飾ü營養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產(chǎn)成本低ü可高密度發(fā)酵ü表達蛋白可存在于胞內(nèi)和胞外酵母表達系統(tǒng)的缺點：酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題〔這個找不到，百度