馬鈴薯脫毒種薯技術(shù)醫(yī)學(xué)課件

馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)技術(shù)“脫毒種薯”“種薯”是指那些作為種子用的薯塊?！懊摱痉N薯”是指種薯經(jīng)過一系列物理、化學(xué)、生物或其它技術(shù)措施清除薯塊體內(nèi)的病毒后，獲得的經(jīng)檢測無病毒或極少有病毒侵染的種薯。為什么馬鈴薯種薯需要脫毒:退化:

在馬鈴薯栽培過程中，植株的逐年變小，葉片皺縮卷曲，葉色濃淡不均，莖稈矮小細(xì)弱，塊莖變形龜裂，產(chǎn)量逐年下降等現(xiàn)象，這種現(xiàn)象叫“退化”。種薯“退化”是引起產(chǎn)量降低和商品性狀變差的主要原因?！巴嘶敝饕?

病毒的侵染及其在薯塊內(nèi)積累。馬鈴薯種薯脫毒和種薯生產(chǎn)程序目前我國馬鈴薯種薯產(chǎn)業(yè)存在的主要問題:我國馬鈴薯脫毒快繁和種薯繁殖技術(shù)，具有世界先進(jìn)水平，但目前我國的種薯質(zhì)量不容樂觀。脫毒種薯繁育體系不完善，無權(quán)威的種薯質(zhì)量監(jiān)控機(jī)構(gòu)，種薯生產(chǎn)未形成規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化，種薯市場混亂，生產(chǎn)不規(guī)范，無國家統(tǒng)一的種薯質(zhì)量和病蟲害檢測標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和種植者的利益。植物莖尖脫毒技術(shù)能夠脫去哪些病毒?經(jīng)高溫處理后，進(jìn)行莖尖分生組織培養(yǎng)可以脫除PLRV、PVY、PVX、PVA、PVS、PVM(馬鈴薯M病毒)及PAMV(馬鈴薯雜斑病毒或馬鈴薯奧古巴花葉病毒)。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTV)是一種非常頑固的病害，目前利用莖尖脫毒的方法是很難根除的。PSTV既可以通過田間植株傳毒，又能通過種子帶毒，新育品種的親本如帶有PSTV，其后代很難避免被PSTV侵染，因此在種薯生產(chǎn)和新品種選育中要絕對杜絕PSTV的存在。馬鈴薯S病毒(PVS)也是比較難脫掉的病毒，PVS單獨存在時對產(chǎn)量的影響較小，但在復(fù)合侵染時也可以造成嚴(yán)重減產(chǎn)?，F(xiàn)在PVS在我國已有蔓延趨勢，要生產(chǎn)高質(zhì)量的種薯必須根除PVS和其它病毒，一般莖尖苗只要脫掉PVS，其它容易脫掉的病毒也隨之脫除。（潛隱花葉病(PVS)）脫毒材料休眠打破及表面消毒:

入選塊莖用1％硫脲+5毫克／升赤霉素浸種5分鐘，以打破休眠。用濕潤砂覆埋，置于25℃黑暗條件下催芽。待薯塊頂芽生長至2厘米時，取芽作為外植體用于莖尖脫毒。

消毒方法是先用刀片切取2—3厘米的壯芽，將芽在75％的酒精中過一遍(幾秒鐘)，然后用飽和漂白粉上清液或用市售的次氯酸鈉溶液稀釋為5％—7％，浸泡15—20分鐘，然后用無菌水清洗3-4次。

一次消毒的芽不能太多，以免消毒后材料放置時間太長，莖尖發(fā)生褐變，對植物組織產(chǎn)生較大的傷害，影響成活率。脫毒材料的熱處理:為提高脫毒效果，應(yīng)進(jìn)行材料的熱處理，1.鈍化病毒活性，2.消除馬鈴薯卷葉病毒，3.提高脫毒效果。用手術(shù)刀，切取1—1.5毫米左右的莖尖。取下的莖尖接種在不含任何激素的快繁基上培養(yǎng)，于25℃每天光照16小時的培養(yǎng)室培養(yǎng)。待莖尖長至1厘米時轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以每天16小時光照，36℃的高溫處理6-8周。馬鈴薯莖尖分生組織剝?nèi)∪〗?jīng)高溫處理后的試管苗的莖尖，在30-40倍解剖鏡下進(jìn)行莖尖分生組織剝離。用解剖刀小心地除去莖尖周圍的葉片組織，暴露出頂端圓滑的生長點，用解剖針細(xì)心切取所需的莖尖分生組織。一般切取莖尖的長度為0.1-0.3毫米，帶有1—2個葉原基。馬鈴薯莖尖分生組織示意圖切取的莖尖分生組織隨即接種到莖尖培養(yǎng)基上，以切面接觸瓊脂，置于培養(yǎng)室進(jìn)行離體培養(yǎng)。

莖尖分生組織培養(yǎng)的容器以15厘米×2厘米的試管為宜，每管盛10毫升培養(yǎng)基接種一個莖尖，同時給試管壁編號并作工作日記，注明接種的品種、試管數(shù)、日期等。莖尖培養(yǎng)注意點:莖尖分生組織培養(yǎng)的適宜溫度為22—25℃，光照強(qiáng)度2000—4000Lux，光照時間為每天16小時。注意:植物激素以及有機(jī)成分的搭配使用，在對培養(yǎng)基進(jìn)行激素搭配時應(yīng)以不使莖尖愈傷化為基本原則，使莖尖直接發(fā)育生長成植株，而不能經(jīng)愈傷組織再分化發(fā)育成植株，因為經(jīng)愈傷組織分化的植株很容易使植株分生變異。適宜馬鈴薯莖尖分生組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基：以MS+赤霉素0.1毫克/升+6-芐基腺嘌呤0.1毫克/升+D-泛酸鈣0.2毫克/升+蔗糖2％，瓊脂0.6％，pH5.8，為比較好的培養(yǎng)基組合。

經(jīng)過莖尖脫毒的材料進(jìn)行病毒檢測目的：第一次擴(kuò)繁后要對試管苗進(jìn)行病毒檢測。剝?nèi)∏o尖的大小直接關(guān)系到脫毒效果，一般剝?nèi)〉那o尖愈小成苗率愈低，但脫毒率高，而培養(yǎng)的莖尖愈大，成苗率愈高，但脫毒率低。

因此只有經(jīng)病毒檢測后，確認(rèn)是不帶病毒的株系，才能進(jìn)一步利用，對繼續(xù)帶病毒的株系應(yīng)淘汰或進(jìn)行再次脫毒。常見的病毒檢測技術(shù)

常用的馬鈴薯病毒檢測技術(shù)指示植物檢測血清學(xué)技術(shù)檢測(ELISA)免疫吸附電子顯微鏡檢測現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)檢測。

常用的類病毒檢測技術(shù)

聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、往返凝膠電泳(RGE)cDNA探針

脫毒后的材料需要進(jìn)行田間試種1.經(jīng)病毒檢測后確認(rèn)不帶有病毒的試管苗在進(jìn)一步大量擴(kuò)繁或工廠化生產(chǎn)前，還需要進(jìn)行田間試種觀察鑒定，將每個無病毒株系的試管苗取出一部分，移栽或誘導(dǎo)成試管薯播種到大田試種、觀察，檢驗其是否發(fā)生了變異，是否符合選定品種的全部生物學(xué)特性及農(nóng)藝性狀。

2.莖尖分生組織在培養(yǎng)過程中，極易因外界條件的影響發(fā)生變異，特別是當(dāng)莖尖培養(yǎng)基含有外源激素參與時，這種可能性就更大。3.另外，在剝?nèi)∏o尖分生組織時，由于細(xì)胞組織很小，也有可能取到的組織是不帶本品種全部遺傳基因的嵌合體組織，由它進(jìn)一步培養(yǎng)產(chǎn)生的植株就不會與原品種完全相符，這些變異的株系都屬淘汰之列。馬鈴薯脫毒苗需要組培快繁脫毒試管苗在獲得之初只有很少幾棵試管苗，用薯塊繁殖的繁殖系數(shù)只有10—15倍。加快脫毒種薯的生產(chǎn)，就必須利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，以工廠化生產(chǎn)的方式快速繁殖脫毒苗，達(dá)到在生產(chǎn)上快速利用的目的。適合馬鈴薯試管苗快繁的培養(yǎng)基：

試管苗快繁，是屬于微扦插，直接從葉腋芽生長成新植株，不經(jīng)過愈傷組織分化和再生階段，因而在快繁過程中一般不需要激素的調(diào)節(jié)。MS基本培養(yǎng)基滿足試管苗所需要的營養(yǎng)。試管苗隨MS培養(yǎng)基中的大量元素的增加，其生長勢和干物質(zhì)積累也增高，尤其在液體培養(yǎng)時更明顯，2倍MS液體培養(yǎng)基處理的試管苗生長茁壯、葉片濃綠，使繼代培養(yǎng)周期從3-4周縮短為2—3周。

培養(yǎng)基內(nèi)加入0.3％活性炭可提高莖的生長速度，有利于試管苗葉片伸展及壯苗。接種操作注意事項1.用瓶轉(zhuǎn)瓶的方法，先用剪刀在基礎(chǔ)苗瓶中將苗剪切成帶有一個腋芽的莖段，然后用鑷子從瓶內(nèi)取出接在新培養(yǎng)基的瓶中。2.直徑10厘米的培養(yǎng)瓶中每瓶接種15-18段為宜。試管苗的中上部切段生長快、苗壯苗齡大的比苗齡小的生根快、發(fā)芽快、生長快，最適宜試管苗齡為25—30天。試管苗生長需要環(huán)境條件：光照：每日16小時光強(qiáng)：2000米燭光以上(相當(dāng)于兩只40瓦日光燈下30厘米處的光強(qiáng))。試管苗生長的最適溫度：白天25-27℃，夜間16—20℃。

培養(yǎng)瓶濕度：100％相對濕度培養(yǎng)室相對濕度：70％-80％為宜，培養(yǎng)室的濕度過低時培養(yǎng)瓶內(nèi)外差異太大，會使培養(yǎng)基內(nèi)的水分喪失很快，不利于試管苗的生長和發(fā)育。

培養(yǎng)室內(nèi)的相對濕度過高，會造成室內(nèi)空氣中的真、細(xì)菌孢子的快速繁殖，易引起霉菌污染。植物激素對試管苗生長影響植物生長素赤霉素(CA3)和萘乙酸(NAA)是馬鈴薯試管苗快繁中用得較多的植物激素。CA3能顯著增加許多品種的試管苗株高，在MS+GA3培養(yǎng)基上生長的試管苗株高、平均節(jié)間長度和葉片數(shù)顯著增加，但莖粗減少，特別是集中于植株上部的葉片仍然較多，限制了切段繁殖可用節(jié)數(shù)的增加。NAA單獨使用增加試管苗株高、平均節(jié)間長度、葉片數(shù)、莖粗和切段繁殖可用節(jié)數(shù)，并隨培養(yǎng)基中NAA濃度增大而增大，但效果均不明顯。應(yīng)用MS附加1毫克/升GA3、0.1毫克/升NAA培養(yǎng)基，可以使馬鈴薯試管苗切段繁殖周期從6周縮短為4周，切段繁殖可用節(jié)數(shù)增大1.17倍。

生長調(diào)節(jié)劑對試管苗生長影響植物生長延緩劑可促進(jìn)壯苗形成，多效唑(簡稱MET)、比久(簡稱B9)、矮壯素(簡稱CCC)，常用作馬鈴薯試管苗培養(yǎng)基添加劑，結(jié)果表明，B9(5-10毫克/升)對試管苗壯苗最有利，表現(xiàn)為節(jié)間短、莖粗壯、葉片開展呈濃綠色。MET和CCC的壯苗效果均不如B9，MET的抑制生長力最強(qiáng)，CCC的抑制力最弱。

控制試管苗的污染方法：1.嚴(yán)格按操作規(guī)程作業(yè)，盡可能減少人為污染。2.堅持每天巡視培養(yǎng)室，及時取出污染瓶。3.降低培養(yǎng)室濕度，相對濕度降到60％以下。4.培養(yǎng)室經(jīng)常通風(fēng)換氣，并采用酒精噴霧、紫外燈殺菌。脫毒試管苗能否無限繁殖下去？

病毒的再現(xiàn)可能有三方面的原因，一是脫毒不徹底，試管苗多次繼代后，病毒逐漸積累，從而再次出現(xiàn)病毒侵染；二是一些弱系病毒或一些暫時沒有條件檢測到的病毒，在強(qiáng)系病毒脫掉后快速繁殖造成危害，三是由于操作及其它一些原因造成的病毒再次侵染。（馬鈴薯脫毒試管苗組培快繁，需兩年更換一次基礎(chǔ)苗）

保存馬鈴薯種質(zhì)試管苗在培養(yǎng)基里加入植物生長延緩劑或抑止劑；控制生長條件，如降低溫度，改變培養(yǎng)器中空氣成分或培養(yǎng)基營養(yǎng)成分，以及提高培養(yǎng)基滲透壓等。馬鈴薯試管薯工廠化生產(chǎn)技術(shù)試管薯：在培養(yǎng)瓶內(nèi)通過誘導(dǎo)，于試管苗葉腋間形成的，通常直徑為2-10毫米大小的塊莖稱為試管薯。脫毒試管薯生產(chǎn)的優(yōu)點：不受氣候影響，可以常年大規(guī)模工廠化快速生產(chǎn)。脫毒試管薯繁育過程中不被病毒或其它病菌侵染，最大限度保證了脫毒薯的質(zhì)量。試管薯比試管苗更容易栽培、管理，而且成活率高，技術(shù)容易被推廣。4.體積小便于更廣泛的交流和運輸，大大降低了運輸成本。5.縮短了脫毒薯的生產(chǎn)周期，可以直接提供給種薯生產(chǎn)農(nóng)戶，從而有可能在脫毒試管薯生產(chǎn)基礎(chǔ)上建立新的種薯繁育體系。試管薯工廠化生產(chǎn)需要設(shè)備

(1)黑暗培養(yǎng)室室內(nèi)應(yīng)安裝空調(diào)和貨物貯藏架，房頂裝有照明用日光燈和中途檢查用綠色安全燈等。培養(yǎng)室溫度18土2℃，注意黑暗培養(yǎng)室的通風(fēng)換氣，促進(jìn)大薯的形成。(2)低溫貯藏庫庫內(nèi)放置貯藏架，并配備塑料保鮮盒用于試管薯的存放。培養(yǎng)出健壯的試管薯誘導(dǎo)母株選用適宜的培養(yǎng)基是培養(yǎng)健壯母株的基礎(chǔ)，可以采用外源激素調(diào)節(jié)方式誘導(dǎo)壯苗的形成。通過調(diào)整培養(yǎng)基的組成，能促進(jìn)健壯試管苗形成。培養(yǎng)基內(nèi)加入0.15%-0.5%的活性炭可以復(fù)壯細(xì)弱的試管苗，用B9(0.5-5毫克/升)、ccc(2-50毫克/升)、pp333(0.05-1毫克/升)等植物生長調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)壯苗的形成。試管薯母株培養(yǎng)用淺層液體靜止培養(yǎng)的方法培養(yǎng)母株

方法：將帶有1-2個莖節(jié)的試管苗，去掉頂芽接種在液體培養(yǎng)基上，試管苗浮在培養(yǎng)基表面靜止培養(yǎng)，3-4周后每個莖段發(fā)育成一株具有5-7個節(jié)的粗壯苗。培養(yǎng)室溫度：日溫23-27度，夜溫16-20度，光照：每天16小時光照，光強(qiáng)2000lux。選用透氣性好的封口物，100—250毫升培養(yǎng)瓶，每瓶15-25株，母株培養(yǎng)一般需要25天。適合試管薯誘導(dǎo)的培養(yǎng)基：試管薯誘導(dǎo)使用的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，國際馬鈴薯中心推薦的試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基是：MS+BA5毫克/升+CCC500毫克/升+蔗糖8％。高濃度的蔗糖(6-10％)是試管薯誘導(dǎo)過程中必不可少的條件。作用：調(diào)節(jié)滲透壓的功能，提供塊莖形成時所需的足夠的碳源。試管薯生產(chǎn)順序：母株培養(yǎng)→匍匐莖誘導(dǎo)→試管薯誘導(dǎo)→試管薯收獲→試管薯貯藏五部分。試管薯生產(chǎn)過程中注意問題：接種小心接放試管苗莖段，接種后小心輕放，以免莖段浸沒在培養(yǎng)液內(nèi)，使莖段窒息而死。試管苗單莖段在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4周后(5—7個節(jié))，去掉壯苗培養(yǎng)基，換入試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基。換入培養(yǎng)基后，在光照下培養(yǎng)2天以促進(jìn)匍匐莖的形成。然后轉(zhuǎn)入黑暗中培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)薯，3-4天后試管內(nèi)開始有試管薯形成。黑暗培養(yǎng)溫度16—20度，注意暗室空氣流通，以利塊莖的發(fā)育。試管薯誘導(dǎo)周期為50—60天，即試管苗莖段接種到壯苗形成為25-30天，誘導(dǎo)培養(yǎng)開始到收獲25-30天。采用100毫升培養(yǎng)瓶，每瓶15個芽段，一次可收試管薯15—20粒。

試管薯收獲時注意事項：首先要將粘在試管薯上的培養(yǎng)基完全沖洗干凈，用自來水至少要沖洗3-4次，試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基含糖量大，收獲后的試管薯離開無菌的培養(yǎng)環(huán)境，極易受真菌、細(xì)菌的侵染。沖洗徹底的試管薯，要置于陰涼處陰干后再貯藏。微型薯在防蟲溫(網(wǎng))室內(nèi)的人工合成營養(yǎng)基質(zhì)中，通過試管苗移栽、試管薯栽培或莖段扦插，生產(chǎn)的直徑為1-10厘米左右的小型薯塊，稱為微型薯。

微型薯生產(chǎn)需要設(shè)施條件

(1)防蟲溫室主要用于基礎(chǔ)苗的栽培。要求具有保溫、保濕、通風(fēng)和良好的光照條件，應(yīng)具備給水、排水和防蟲設(shè)施。

(2)防蟲網(wǎng)室用于扦插生產(chǎn)微型薯和試管薯栽培。網(wǎng)室的防蟲網(wǎng)紗應(yīng)在40目以上，這樣才能達(dá)到防止蚜蟲人內(nèi)的目的。

(3)苗床用于試管苗移栽、莖段扦插、試管薯栽