飼用植酸酶活性的測(cè)定-分光光度法

飼用植酸酶活性的測(cè)定—分光光度法一、術(shù)語(yǔ)和定義在溫度37°C、pH值5.50條件下，每分鐘從濃度為5.0mmol/L植酸鈉溶液中釋放1mol無(wú)機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位，以U表示。二、原理植酸酶在一定溫度和pH條件下，將底物植酸鈉水解，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能與釩鉬酸銨生成黃色的復(fù)合物，可于波長(zhǎng)415nm下進(jìn)行比色測(cè)定。三、試劑和材料除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)純度的水。清洗試驗(yàn)用器皿不要用含磷清洗劑。1、 磷酸二氫鉀(KH2P04)：基準(zhǔn)物。2、 乙酸緩沖液(I),c(CHC00Na)=0.25mol/L：稱取34.02g三水乙酸鈉于1000mL燒杯中，3加入900mL水?dāng)嚢枞芙?，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.50±0.01，再轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度。室溫下存放2個(gè)月內(nèi)有效。3、 乙酸緩沖液(II),c(CHC00Na)=0.25mol/L:稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5g曲拉通3X-100(TritonX-100)，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000mL燒杯中，加入900mL水?dāng)嚢枞芙?，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.50±0.01，再轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度。室溫下存放2個(gè)月內(nèi)有效。4、底物溶液,c(CHOPNa)=7.5mmol/L:稱取0.69g植酸鈉(CHOPNa，相對(duì)分子66246 12 66246 12質(zhì)量為923.8,純度為95%)，精確至0.1mg，置于100mL燒杯中，用約80mL乙酸緩沖液I溶解,用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.50±0.01，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，并用乙酸緩沖液I定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配(實(shí)際反應(yīng)液中的最終濃度為5.0mmol/L)。5、 硝酸溶液：1＋2水溶液。6、 鉬酸銨溶液，100g/L：稱取10g鉬酸銨［(NH)MoO?4HO］于50mL燒杯中加水溶解,46 724 2必要時(shí)可微加熱，再轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加入1.0mL氨水(25%)用水定容至刻度。7、 偏釩酸銨溶液：2.35g/L配制方法一:稱取0.235g偏釩酸銨(NHVO)于50mL燒杯中，加入2mL硝酸溶液⑷及少量43水，并用磁石攪拌子在避光條件下攪拌溶解，再轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度。避光條件下保存一周內(nèi)有效。配制方法二：稱取0?235g偏饑酸銨(NHV0)于50mL燒杯中，加入20mL水，置于電爐上43加熱并不斷攪拌直至完全溶解，冷卻后加入加入2mL硝酸溶液(4)，再轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度。避光條件下保存一周內(nèi)有效。8、 酶解反應(yīng)終止及顯色液：移取2份硝酸溶液(5)，1份鉬酸銨溶液(6)，1份偏釩酸銨溶液(7)混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。四、儀器和設(shè)備1、 分析天平：感量0.lmg。2、 恒溫水?。?7±0.1°C。3、 分光光度計(jì)：有10mm比色皿，可在415nm下測(cè)定吸光度。4、 磁力攪拌器。5、 渦流式混合器。6、 酸度計(jì):pH值精確至0.01。7、 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速為4000r/min以上。8、 超聲波溶解器。9、回旋式振蕩器。五、試樣制備1、固體樣品：按GB/T14699.1的規(guī)定進(jìn)行采樣，選取有代表性樣品，用四分法將試樣縮分至100g,植酸酶產(chǎn)品不需粉碎，配合飼料需粉碎通過(guò)0.45mm標(biāo)準(zhǔn)篩，裝入密封容器，防止試樣成分變化。2、液體樣品：按GB/T14699.1的規(guī)定進(jìn)行采樣，選取有代表性樣品用前搖勻。六、測(cè)定步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取0.6804g在105C烘至恒重的基準(zhǔn)磷酸二氫鉀(5.1)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液I溶解，并定容至刻度，濃度為50.0mmol/L。按表1的比例用乙酸緩沖液II稀釋成不同濃度，與待測(cè)試樣一起反應(yīng)測(cè)定。以無(wú)機(jī)磷的量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，列出直線回歸方程(y二a+bx)。表1標(biāo)準(zhǔn)稀釋比例標(biāo)準(zhǔn)溶液序號(hào)稀釋量/mL濃度/仇mol/mL10.5—161.562520.5—83.125030.5—46.250040.5—212.50050.5—125.0002、試樣溶液的制備1)酶制劑樣品中酶的提取

正大康地CHIATAICONTI2012-XX-XX定稿參據(jù)GB/TXXXX-XXXX正大康地CHIATAICONTI2012-XX-XX定稿參據(jù)GB/TXXXX-XXXX編制人審核人批準(zhǔn)人按照附錄A中建議的稱樣量稱取植酸酶試樣兩份，精確至O.OOOlg，置于100mL容量瓶中，加入乙酸緩沖液II搖勻并定容至刻度。放入一個(gè)磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌30min。必要時(shí)離心，取上清液。2）酶制劑待反應(yīng)液的制備用乙酸緩沖液II對(duì)樣品提取液進(jìn)行稀釋，稀釋步驟如下:取0.25mL提取液—?3取0.25mL提取液—?3、反應(yīng)用乙酸緩沖液定容至5mL■ ＞取0.25mL稀釋 ■用乙酸緩沖液定容至5mL：待反應(yīng)液取5mL試管按下面的反應(yīng)順序進(jìn)行操作，標(biāo)準(zhǔn)空白加入0.5mL乙酸緩沖液II。在反應(yīng)過(guò)程中，從加入底物溶液開始，向每支試管中加入試劑的時(shí)間間隔要一致，在37°C恒溫水浴中水解30min。反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見表2。表2反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量反應(yīng)順序樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品空白標(biāo)準(zhǔn)空白1.加乙酸緩沖液I0.5mL0.5mL0.5mL2.加入待反應(yīng)液0.5mL0.5mL0.5mL乙酸緩沖液II3.混合VVV4.水浴37C預(yù)熱5minVVV5.依次加入底物溶液2mL2mL（終止液）2mL6.混合VVV7.37C水浴水解30minVVV8.依次加入終止及顯色液2mL2mL（底物）2mL9.混合VVV總體積5mL5mL5mL4、樣品測(cè)定在離心機(jī)上4000r/min離心10min,上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在分光光度計(jì)415nm波長(zhǎng)處測(cè)定試樣空白（A）和試樣溶液（A）的吸光值，A-A為實(shí)測(cè)吸光值。用直線回歸方程計(jì)00算植酸酶的活性。七、結(jié)果計(jì)算和表示1、試樣中植酸酶活性以X表示，單位為酶活性單位每克（U/g）或酶活性單位每毫升（U/mL）,按式（1）計(jì)算X xn （1）式中：X——試樣中植酸酶的活性，單位為酶活性單位每克U/g或酶活性單位每毫升（U/mL）；y—根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由直線回歸方程計(jì)算出的無(wú)機(jī)磷的量，單位為微摩爾（pmol）；t 酶解反應(yīng)時(shí)間，單位為分鐘（min）；n——試樣的稀釋倍數(shù)；m 試樣質(zhì)量，單位為克（g）或毫升（mL）。2、結(jié)果表示兩個(gè)平行試樣的測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，酶制劑樣品保留整數(shù)，加酶飼料樣品保留三位有效數(shù)字。3、重復(fù)性同一試樣兩個(gè)平行測(cè)定值的相對(duì)偏